طريقة جديدة وفعالة لتلطيخ ذبابة الفاكهة مضان القلب بالتقطيع بالتبريد

Summary

ذبابة الفاكهة يبسط بروتوكول تقطيع القلب والتصوير الفلوري دراسة بنية القلب وأمراضه. يتضمن هذا النهج التقسيم المباشر والتلوين والتصوير ، متجاوزا الخبرة الفنية اللازمة للتشريح التقليدي. إنه يعزز إمكانية الوصول ، مما يجعل ذبابة الفاكهة نموذجا قابلا للاستخدام على نطاق واسع للأبحاث المتعلقة بالقلب داخل المجتمع العلمي الأوسع.

Abstract

تستخدم نماذج قلب ذبابة الفاكهة على نطاق واسع في دراسة شيخوخة القلب ونمذجة أمراض القلب البشرية. ومع ذلك ، فإن تشريح قلوب ذبابة الفاكهة قبل التصوير هو عملية دقيقة تستغرق وقتا طويلا وتتطلب تدريبا متقدما ومهارات حركية. لمواجهة هذه التحديات ، نقدم بروتوكولا مبتكرا يستخدم التشريح بالتبريد للتصوير الفلوري لأنسجة قلب ذبابة الفاكهة. تم إثبات البروتوكول في تصوير قلب ذبابة الفاكهة البالغ ولكن يمكن تكييفه مع مراحل النمو. تعزز هذه الطريقة كلا من كفاءة تلطيخ التألق وإمكانية الوصول إليه مع الحفاظ على سلامة الأنسجة. يبسط هذا البروتوكول العملية دون المساس بجودة التصوير ، وبالتالي تقليل الاعتماد على الفنيين ذوي التدريب المطور والمهارات الحركية. على وجه التحديد ، نستبدل التقنيات المعقدة ، مثل الشفط الفراغي الشعري ، بطرق أكثر وضوحا مثل تضمين الأنسجة. يسمح هذا النهج بتصور هياكل القلب بسهولة أكبر وقابلية للتكاثر. نثبت فائدة هذا البروتوكول من خلال الكشف الفعال عن علامات القلب الرئيسية وتحقيق تصوير مضان عالي الدقة وتصوير تلطيخ مناعي يكشف النقاب عن تفاصيل معقدة لمورفولوجيا القلب والتنظيم الخلوي. توفر هذه الطريقة أداة قوية ويمكن الوصول إليها للباحثين الذين يستكشفون ذبابة الفاكهة بيولوجيا القلب ، مما يسهل التحليلات التفصيلية لنمو القلب ووظيفته ونماذج المرض.

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة على مستوى العالم، وهي مسؤولة عن حوالي 17.9 مليون حالة وفاة كل عام، وهو ما يمثل ما يقرب من ثلث جميع الوفيات العالمية. ذبابة الفاكهة السوداء (المعروفة باسم ذبابة الفاكهة) تم استخدامها على نطاق واسع ككائن حي نموذجي لدراسة الأساس الجيني والخلوي والجزيئي لنمو القلب وعلم وظائف الأعضاء والتمثيل الغذائي والشيخوخة واعتلال عضلة القلب^{1،2،3،4،5،6،7،8،9}. كما تم استخدام نماذج ذبابة الفاكهة لدراسة دور عضلة القلب في التنظيم الجهازي للسمنة¹⁰ ، وهو عامل خطر رئيسي لمراضة القلب والأوعية الدموية والوفيات. كشفت دراسات تسلسل جينوم ذبابة الفاكهة ¹¹ عن الحفاظ الكبير على الجينات لدى البشر ، بما في ذلك تلك المرتبطة بتطوير أعضاء مختلفة ، بما في ذلك القلب. من بين هذه الجينات المحفوظة للغاية ، يشارك بعضها في خلل وظيفي في القلب ، مثل اعتلال عضلة القلب أو اعتلال القنوات³. أدى التطوير الأخير للتقنيات الفعالة لدراسة أداء القلب إلى توسيع تطبيقات النموذج لاستكشاف التغييرات طويلة المدى في فسيولوجيا القلب للبالغين بسبب عوامل مثل التمرين والنظام الغذائي والشيخوخة⁸. ومع ذلك ، غالبا ما تعيق التحديات التقنية واللوجستية استخدام هذا النظام النموذجي. أحد التحديات التي تواجه استخدام ذبابة الفاكهة في دراسات القلب هو تشريح دقيق للقلب بطريقة تحافظ على البنية الخلوية وعناصر عضلة القلب.

ذبابة الفاكهة يتكون القلب أو الوعاء الظهري من هيكل يشبه الأنبوب يتكون من طبقة واحدة من خلايا عضلة القلب ، وخلايا التامور الموضوعة على طول جدار القلب ، مدعومة بالعضلات القلبية ، وفي البالغين ، مصحوبة بطبقة من الخلية العضلية الطولية البطنية¹². يعد التشريح الدقيق للوصول إلى هذه الهياكل الحساسة عملية تستغرق وقتا طويلا وعمالا طويلا. يتضمن المعيار الحالي تشريحا صعبا تقنيا وشفط الفراغ الشعري ، مما يتطلب تدريبا متقدما ومهارات حركية^{13،14،15،16}. عادة ما يبدأ التشريح بشق جدار الجسم البطني ، وتظهر التحديات بسرعة مع التشريح الدقيق للقلب ، وبنيته الهشة ، والموقع الظهري الذي يصعب الوصول إليه. هذا جنبا إلى جنب مع تقنيات التشريح التقليدية ، يسمح بإجراء تحليل دقيق لبنية القلب ووظيفته ، مما يوفر أداة محسنة لدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية في ذبابة الفاكهة¹³. على سبيل المثال ، باستخدام هذا ، Alayari et al. قدم بروتوكولا لوضع العلامات بالفلورسنت ذبابة الفاكهة هياكل القلب ، مما يسهل تصور مورفولوجيا القلب وبنيته. على الرغم من هذه الجهود ، يواجه تشريح القلب التقليدي وتلبيخه العديد من التحديات ، بما في ذلك صعوبة الحفاظ على سلامة الأنسجة والتدريب المتخصص المطلوب لتلطيخ القلب بشكل فعال.

تقدم الطريقة حلا مبتكرا لهذه المشكلة من خلال استبدال الإجراء بأكمله ببروتوكول أبسط يستخدم التجميد لذبابة الفاكهة والصدر والبطن متبوعا بالتلوين المناعي والتصوير الفلوري. يضمن هذا النهج سهل التعلم تصورا أسرع وأكثر وضوحا لهياكل القلب مع قابلية أكبر للتكاثر. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة بسيطة تتضمن ثلجا جافا تضمن محاذاة موحدة لبشرة البطن ذبابة الفاكهة على نفس المستوى z لتبسيط خطوة التقطيع بالتبريد في اتجاه مجرى النهر. نثبت فعالية هذا البروتوكول في الكشف عن علامات القلب المهمة ، ومورفولوجيا القلب ، والتنظيم الخلوي باستخدام الفحص المجهري المناعي الفلوري وكذلك الفحص المجهري متحد البؤر. تعد سهولة هذا النهج وفعاليته العالية مفيدة بشكل خاص لدراسات القلب القائمة على ذبابة الفاكهة عالية الإنتاجية.

Protocol

1. إعداد المعدات

1. تأكد من تشغيل ناظم التبريد وضبطه على -20 درجة مئوية. اترك وقتا كافيا لتصل درجة الحرارة إلى هذه النقطة. إذا كانت الماكينة في درجة الحرارة المحيطة ، فقد يستغرق التبريد إلى درجة حرارة القطع المثلى حوالي 5 ساعات.
2. قم بتشغيل جهاز تسخين الشرائح أو الحاضنة ، مما يضمن ضبطه على 37 درجة مئوية. تأكد من أن الشرائح لديها الوقت الكافي للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة.
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن وضع الشرائح المصنفة على المدفأة أو الحاضنة وتركها إلى أجل غير مسمى حتى التقسيم.
3. تأكد من أن الثلج الجاف جاهز للاستخدام. يمكن إزالة الثلج من التخزين عند - 80 درجة مئوية بمجرد الوصول إلى الخطوة 5.

2. إعداد الحلول

1. تحضير 50 مل من PBS. تحضير 10 مل من 10 مل من حمض إيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك في PBS. قم بإعداد محلول 4٪ بارافورمالدهيد في PBS حيث يكون الحجم النهائي مساويا ل 100 ميكرولتر مضروبا في عدد المجموعات التجريبية.
2. تحضير محلول تنظيف 70٪ من الإيثانول في الماء في زجاجة رذاذ. تحضير جميع محاليل تلطيخ الفلورسنت.
   ملاحظة: سيشرح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إجراء تلطيخ بسيط باستخدام بقع أو أصباغ الفلورسنت البسيطة. في هذه الحالة ، سنصف استخدام 1x Phalloidin 594 بنسبة 1: 250 في PBS. تختلف تركيزات البقع الفلورية اعتمادا على الكاشف والأهداف التجريبية. يجب إجراء الاختبارات الأولية للعثور على التركيز المناسب. لن يتم تفصيل تلطيخ الأجسام المضادة هنا ولكن يجب أن يكون قابلا للتطبيق باستخدام طرق التلوين التقليدية.

3. جمع الأنسجة

1. قم بتخدير 5-10 ذباب باستخدام حصيرة ذبابة CO₂ وضع الذباب في مرمى البصر تحت المجهر بتكبير 1x-2x. يجب أن يسجل منظم ثاني أكسيد الكربون₂ ما بين 1 و 5 كيلو باسكال في حصيرة ثاني أكسيد الكربون₂ .
   ملاحظة: تتوفر طرق أخرى للتخدير (على سبيل المثال ، FlyNap²) ، وهذه الطرق لا تؤثر بشكل كبير على النتائج.
2. باستخدام مقص زنبركي ، قم بقطع الرأس وقص الأجنحة وإزالة الأرجل من 5 إلى 10 ذباب. ما تبقى هو الصدر والبطن ، ويشار إليهما معا باسم الجسم.
   ملاحظة: لمحاذاة أجسام الذباب بشكل مناسب في الخطوة 5 ، يجب ألا تتداخل أي أطوال متبقية للجناح أو الساق مع محاذاة مسطحة على طول الجزء السفلي من القالب. أنجز ذلك عن طريق قص الأجنحة والساقين بالقرب من الصدر قدر الإمكان.
3. باستخدام فرشاة ، ضع الجثث برفق في أنابيب 1.5 مل على الجليد حتى يتم جمع جميع المجموعات التجريبية.

4. تثبيت الأنسجة الكاملة

1. بعد إزالة الأنابيب من الجليد ، أضف 100 ميكرولتر من 10 ملي مولار EGTA ، درجة الحموضة 8 ، في كل أنبوب لإرخاء أنسجة القلب داخل البطن. تأكد من غمر جميع الأجسام لمدة 10 دقائق ووضعها على شاكر المدار. يمكن استخدام أجهزة الطرد المركزي التي توضع على سطح الطاولة لتسهيل غمر الأجسام.
2. قم بإزالة المحلول والتخلص منه في الأنبوب. ماصة 100 ميكرولتر من PBS في كل أنبوب لغسل الأنسجة لمدة 10 دقائق ، ووضعها على شاكر المدار. قم بإزالته وتجاهله بعد انقضاء الوقت.
3. ماصة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد في محلول PBS في كل أنبوب. التأكد من غمر جميع الأجسام في المحلول.
4. ضعه على شاكر مداري لمدة 15 دقيقة ، واضبط السرعة على حوالي 100 وحدة. تأكد من أن الإعداد لا يحرك الأنسجة بعيدا عن ملامسة المحلول.
5. بعد انقضاء هذا الوقت ، تخلص من PFA واستبدله ب 1x PBS لمدة 10 دقائق ، مع التأكد مرة أخرى من أن جميع الهيئات تتصل بالحل. أعد الأنابيب إلى شاكر المداري بسرعة مماثلة كما في الخطوة 4.4 لكل غسلة متبقية.
6. تخلص من المحلول السابق في كل مرة ، اغسل المنديل باستخدام PBS 2x لمدة 10 دقائق لكل منهما ، ليصبح المجموع 3 غسلات.
7. بعد التخلص من الغسيل النهائي ، انقل الأجسام إلى 10٪ سكروز في محلول PBS ، مما يضمن ملامسة المحلول داخل الأنبوب. للحصول على التشبع الأمثل ، اتركها طوال الليل أو لفترة كافية بحيث تغرق الأجسام في القاع.
   ملاحظة: يفضل استخدام الحماية بالتبريد طوال الليل، ولكن إذا كان التصوير في نفس اليوم ضروريا، فاترك أطول فترة ممكنة حتى يتسلل الواقي من الفراغ بالتبريد إلى الأنسجة.

5. تحضير القالب

1. في هذه المرحلة ، استرجع الثلج الجاف من التخزين وحدد بضع قطع لوضعها في صينية معدنية أو بلاستيكية صغيرة. يجب أن تكون أبعاد الدرج بحيث يمكن إدخال القالب ، ووضعه مباشرة فوق قطعة واحدة كبيرة ويفضل أن تكون مسطحة من الثلج الجاف.
2. املأ قالبا مسمى حوالي 50٪ بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT). حاول تقليل إدخال الفقاعات عن طريق ترك المركب يتدفق ببطء.
3. باستخدام فرشاة ، ضع الأجسام بعناية على سطح OCT داخل القالب. يجب فصل مجموعات تجريبية متعددة بشكل واضح في هذه المرحلة.
   ملاحظة: من المهم منع تخفيف مركب OCT من خلال التلوث بمحلول السكروز بواسطة الفرشاة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التنسيب في عمق OCT باستخدام الفرشاة إلى إنشاء العديد من فقاعات الهواء. تجنب هذه الأخطاء لمنع مشكلات التقسيم لاحقا.
4. باستخدام الملقط ، ادفع كل جسم إلى أسفل القالب مع الجدار الظهري للصدر والبطن ، بشكل عام على طول القاع. بعد ذلك ، اضبط الجسم بحيث يتم إعطاء الأولوية للبطن على أنه مسطح على طول الجزء السفلي من القالب. قم بمحاذاة جميع الأجسام في أبعاد X و Y و Z بحيث يحتوي كل قسم على جميع الموضوعات في وقت واحد.
5. قد يكون هناك انحناء في البطن ، خاصة عند الذكور. قم بتسطيح هذا بأفضل ما يمكن للفني. هذا ضروري لجمع الأقسام الأطول في المستوى الإكليلي. تجنب ثقب أو سحق الأجسام على قاع القالب أثناء هذه العملية. اعمل بشكل منهجي لمحاذاة كل موضوع بشكل صحيح.
6. بمجرد وضع جميع الموضوعات في مكانها ، خذ القالب وضع الجزء السفلي مباشرة فوق قطعة من الثلج الجاف. تحقق لمعرفة ما إذا كان OCT يبدأ في التجمد بعد بضع لحظات بعد الاتصال. اسمح لهذا بالاستمرار حتى يتم تغليف جميع الموضوعات في الجزء المجمد من القالب.
7. بمجرد الوصول إلى هذه المرحلة ، انقل القالب إلى -20 درجة مئوية للتجميد طوال الوقت. املأ الجزء المتبقي من القالب عندما يتم تجميد الجزء الأول تماما. يمكن بعد ذلك تخزين القوالب عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا عن طريق لفها بورق الألمنيوم أو قطعها على الفور.
   ملاحظة: تجنب التعرض المفتوح للهواء عند -20 درجة مئوية و -80 درجة مئوية بين مرحلتي التجميد. هذا يمكن أن يتسبب في تطور الرطوبة بين الطبقات.

6. التقطيع بالتبريد للقوالب

ملاحظة: ينصح عموما بإعداد قالب فارغ وقطعه قبل قطع قوالب المجموعة التجريبية. يتيح لنا ذلك ضمان الوظيفة المناسبة للعجلة والشفرة والزجاج المضاد للانزلاق مباشرة قبل تقسيم الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، اسمح لأي قوالب قادمة من التخزين البارد بالتأقلم في ناظم البرد لمدة 30 دقيقة.

1. قم بتوصيل لقمة الظرف بالقالب عن طريق وضع كمية وفيرة من OCT على الكتلة ووضع القطعة في الأعلى ، والضغط عليها بشكل مسطح. اترك هذا يتجمد تماما في ناظم البرد ، عادة في غضون 5 دقائق.
2. حرر البت وكتلة OCT من القالب وضعها في الظرف ، مع التأكد من بقاء الكتلة موجهة بشكل صحيح من أعلى إلى أسفل. شد مفتاح الظرف حتى يتم تأمين البت.
3. قم بمحاذاة الكتلة مع الشفرة باستخدام مقابض الضبط وأدوات التحكم في عمق الظرف. اضبط عرض القسم على 20 ميكرومتر أو أقل.
   ملاحظة: المقاطع الرقيقة مرغوبة أكثر لزيادة عدد الأقسام الممكنة التي تم جمعها. يجب أن تحتوي الأقسام الأولى 2-6 من كل موضوع على الأجزاء المطلوبة الخالية من العوائق من القلب وهي دالة على الاتجاه وعرض القسم. يجب على المرء أن يحاول الحصول على اتجاه ظرف الحق قبل قطع الأقسام المهمة من 2 إلى 6.
4. قص كل شريحة باستخدام حركة بطيئة ولكن متسقة ، مما يسمح للزجاج المضاد للدحرجة بالتقاط كل شريحة. اجمع الأقسام باستخدام الشرائح الدافئة. اترك الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل ولكن ليس أكثر من ساعة واحدة قبل الجولة الأولى من الغسيل.

7. تلطيخ مضان

1. مباشرة بعد فترة التجفيف ، قم بإزالة OCT الزائد المحيط بالأقسام باستخدام شفرة حلاقة. احرص على تجنب مواجهة الأنسجة في هذه المرحلة. إذا كان من المفترض تلطيخ الشريحة في وقت لاحق ، فقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
2. حدد هذه الحدود على كل شريحة باستخدام علامة كارهة للماء. ستعمل هذه الحدود على الحفاظ على محاليل الغسيل والبقع على الأنسجة.
   ملاحظة: يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء التلوين والغسيل باستخدام طريقة الماصة، ويمكن أيضا استخدام جرافات الشرائح والرفوف. ما عليك سوى استبدال سحب المحاليل أعلى الشرائح بغمر الشرائح في كل من المحاليل الجديدة. كما فعلنا مؤخرا لتصوير الدماغ¹⁷ ، يمكن تطبيق إجراء تلطيخ مناعي على تلطيخ القلب أيضا.
3. اغسل جميع الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام PBS عن طريق سحب العينة برفق أعلى الشريحة، وتجنب سحب العينات مباشرة فوق الأنسجة عندما يكون ذلك ممكنا. قم بإجراء ذلك باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر والنصائح المرتبطة بها. حاول ألا تنفث المحلول بسرعة لأن هذا قد يتسبب في تحرير الأنسجة من سطح الشريحة.
4. تخلص من الغسيل النهائي وقم بسحب محلول صبغة التألق (1: 250 ، 1x Phalloidin) على الأنسجة. اسمح لهذا بالحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
5. بعد هذه النقطة تكون الموضوعات حساسة للضوء. قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام أو عن طريق تغطية الشرائح. تخلص من بقعة التألق ، وباستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBS.

8. التركيب والتحضير للتصوير

1. تخلص من الغسيل النهائي ، واترك كمية صغيرة من PBS على الشريحة. الماصة 3-5 قطرات من وسائط التثبيت على الشريحة باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر، لتجنب الانتشار المباشر على الأنسجة.
2. ضع الغطاء على الشريحة بحيث يتم تقليل إنتاج فقاعات الهواء. للسهولة ، استخدم الملقط لوضع الغطاء على حافة واحدة وخفض الجانب الآخر تدريجيا حتى يتدفق مع الشريحة. تعامل مع الشرائح المثبتة حديثا بعناية وقم بتخزينها بشكل مسطح لمدة 24 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية.
3. قم بإغلاق الشرائح باستخدام طلاء الأظافر ، أو إذا كانت وسائط التثبيت تصلب ، فتجنب ذلك. لا ينبغي استخدام طلاء الأظافر الذي يحتوي على النيون أو اللمعان. اعتمادا على بقعة الفلورسنت ، قم بإجراء التصوير على الفور أو يمكن تخزين شرائح التخزين لالتقاطها لاحقا.

9. التصوير

ملاحظة: تم استخدام مجهر أوليمبوس BX 63 مع عدسات 10x و 40x و 60x لالتقاط الصور. كما تم استخدام المرشحات المناسبة ل DAPI و Lipid Spot 488 و Phalloidin 594.

1. قبل التصوير ، افحص الشرائح ونظفها باستخدام مناديل ورقية و 70٪ إيثانول في محلول مائي. إذا تم تصوير الشرائح مباشرة بعد التركيب، فاحرص على توخي الحذر الشديد عند التنظيف لتجنب إزعاج الغطاء.
2. حدد أوقات التعريض الضوئي المناسبة لكل قناة بناء على ألمع موضوعات التألق في التجربة الإجمالية. تجنب التشبع الزائد أثناء إنشاء صورة ساطعة قدر الإمكان وتقليل الخلفية. قم بمسح كل مجموعة تجريبية بسرعة باستخدام عرض مباشر لكل قناة للتأكد من ضبط مرات التعرض بشكل مناسب.
3. ركز على كل موضوع، باستخدام نفس القناة عبر جميع الموضوعات لتحقيق الاتساق. ثم التقط كل موضوع. التقط جميع المجموعات التجريبية المستخدمة للمقارنة في نفس اليوم لتجنب الاختلافات في تسوس الفلورسنت بين المجموعات المقارنة.
4. بعد التصوير ، قم بتخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية لاستعادة الصورة لاحقا.

النتائج

تسهل الطريقة الموضحة أعلاه دراسة ذبابة الفاكهة باستخدام التصوير الفلوري دون تشريح ممل. هذه هي الفائدة الرئيسية لهذه الطريقة ، حيث تتطلب الطريقة التقليدية لتشريح القلب تطوير المهارات الحركية المعقدة. كما هو موضح في الشكل 1 ، فإن الطريقة أكثر سهولة م?...

Discussion

لقد طورنا بروتوكولا فعالا لإعداد أنبوب قلبي ذبابة الفاكهة للتصور باستخدام التصوير الفلوري أو متحد البؤر. يسبق ذلك مناقشة لطريقة شائعة الاستخدام ولكنها كثيفة الاستخدام للوقت والعمالة للوصول إلى السلامة الخلوية لذبابة الفاكهة ومراقبة السلامة الخلوية لذبابة الف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500