Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning을 위한 새롭고 효율적인 방법

요약

초파리 심장 절편 및 형광 이미징 프로토콜은 심장 구조 및 병리학 연구를 단순화합니다. 이 접근 방식에는 간단한 절편, 염색 및 이미징이 포함되며, 기존 박리에 필요한 기술적 전문 지식을 우회합니다. 접근성을 향상시켜 Drosophila를 더 넓은 과학 커뮤니티 내에서 심장 관련 연구에 더 널리 사용할 수 있는 모델로 만듭니다.

초록

초파리 심장 모델은 심장 노화를 연구하고 인간의 심장 질환을 모델링하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 영상 촬영 전에 초파리 심장을 해부하는 것은 고급 교육과 운동 기술이 필요한 세심하고 시간이 많이 소요되는 과정입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 당사는 초파리 심장 조직의 형광 이미징을 위해 냉동 절편을 활용하는 혁신적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 성체 초파리 심장을 이미징하는 데 입증되었지만 발달 단계에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 방법은 형광 염색의 효율성과 접근성을 모두 향상시키는 동시에 조직의 무결성을 보존합니다. 이 프로토콜은 이미징 품질을 손상시키지 않으면서 프로세스를 단순화하여 고도로 발달된 교육 및 운동 기술을 갖춘 기술자에 대한 의존도를 줄입니다. 특히, 모세관 진공 흡입과 같은 복잡한 기술을 조직 임베딩과 같은 보다 간단한 방법으로 대체합니다. 이 접근 방식을 사용하면 심장 구조를 더 쉽고 재현성 있게 시각화할 수 있습니다. 당사는 주요 심장 마커를 효과적으로 검출하고 심장 형태 및 세포 조직의 복잡한 세부 사항을 밝히는 고해상도 형광 및 면역 염색 이미징을 달성함으로써 이 프로토콜의 유용성을 입증합니다. 이 방법은 초파리 심장 생물학을 탐구하는 연구자에게 강력하고 접근 가능한 도구를 제공하여 심장 발달, 기능 및 질병 모델에 대한 자세한 분석을 용이하게 합니다.

서문

심혈관 질환(CVD)은 전 세계적으로 가장 큰 사망 원인으로, 매년 약 1,790만 명의 사망자가 발생하며, 이는 전 세계^{사망자의 거의} 1/3을 차지합니다. Drosophila melanogaster (일반적으로 초파리로 알려져 있음)는 심장 발달, 생리학, 물질 대사, 노화 및 심근병증의 유전적, 세포 및 분자적 기초를 연구하기 위한 모델 유기체로 널리 사용되었습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9. 초파리 모델은 또한 심혈관 이환율 및 사망률의 주요 위험 요소인 비만¹⁰의 전신 조절에서 심장 근육의 역할을 연구하는 데 사용되었습니다. 초파리 게놈 염기서열 분석 연구(Drosophila genome sequencing studies)¹¹는 심장을 포함한 다양한 장기 발달과 관련된 유전자를 포함하여 인간의 유전자가 상당히 보존되어 있음을 밝혔다. 이렇게 고도로 보존된 유전자 중 일부는 심근병증(cardiomyopathies) 또는 채널병증(channelopathies)과 같은 심장 기능 장애에 관여한다³. 최근 심장 성능을 연구하기 위한 효과적인 기법이 개발됨에 따라 운동, 식이요법 및 노화와 같은 요인으로 인한 성인 심장 생리학의 장기적인 변화를 탐구하기 위해 모델의 적용이 확장되었습니다⁸. 그러나 기술 및 물류 문제로 인해 이 모델 시스템의 사용이 방해받는 경우가 많습니다. 심장 연구에서 초파리를 사용할 때의 한 가지 과제는 세포구조와 심근 요소를 보존하는 방식으로 심장을 정밀하게 해부하는 것입니다.

초파리 심장 또는 등쪽 혈관은 심근세포(cardiomyocytes)의 단일 층으로 구성된 튜브 모양의 구조로 구성되며, 심장 벽을 따라 위치한 심낭 세포는 관절 근육(alary muscle)에 의해 지지되며, 성인의 경우 복부 종근 세포(ventral longitudinal muscle cell) 층을 동반합니다¹². 이러한 섬세한 구조물에 접근하기 위한 정확한 해부는 시간과 노동 집약적인 과정입니다. 현재 표준은 기술적으로 까다로운 해부 및 모세관 진공 흡입을 포함하며 고급 교육 및 운동 기술을 요구합니다 13,14,15,16. 일반적으로 박리는 복부 체벽을 절개하는 것으로 시작하며, 심장의 미세한 해부학적 구조, 취약한 구조 및 접근하기 어려운 등쪽 위치로 인해 문제가 빠르게 발생합니다. 이는 전통적인 해부 기법과 결합되어 심장 구조와 기능을 정밀하게 분석할 수 있게 하여 초파리의 심혈관 질환을 연구하기 위한 개선된 도구를 제공합니다 ¹³. 예를 들어, Alayari 등은 이를 사용하여 초파리 심장 구조를 형광 라벨링하는 프로토콜을 제공하여 심장 형태 및 구조의 시각화를 용이하게 했습니다. 이러한 노력에도 불구하고 전통적인 심장 박리 및 염색은 조직의 무결성을 유지하는 데 어려움이 있고 효과적인 심장 염색에 필요한 전문 교육을 포함하여 몇 가지 문제에 직면해 있습니다.

이 방법은 전체 절차를 초파리, 흉부 및 복부의 동결 임베딩을 활용한 후 면역 염색 및 형광 이미징을 활용하는 더 간단한 프로토콜로 대체함으로써 이 문제에 대한 혁신적인 솔루션을 제공합니다. 이 배우기 쉬운 접근 방식은 재현성을 높여 심장 구조를 더 빠르고 간단하게 시각화할 수 있도록 합니다. 또한, 드라이아이스와 관련된 간단한 방법을 설명하여 동일한 z-평면에서 초파리 복부 큐티클의 균일한 정렬을 보장하여 동결 절편 단계를 하류로 간소화합니다. 우리는 면역형광 및 컨포칼 현미경을 통해 중요한 심장 마커, 심장 형태 및 세포 조직을 감지하는 데 이 프로토콜의 효과를 입증합니다. 이 접근법의 용이성과 높은 효능은 고처리량 초파리 기반 심장 연구에 특히 유용합니다.

프로토콜

1. 장비 준비

1. 저온 유지 장치의 전원이 켜져 있고 -20 °C로 설정되어 있는지 확인하십시오. 온도가 이 지점에 도달할 때까지 충분한 시간이 경과할 수 있습니다. 기계가 주변 온도에 있는 경우 최적의 절단 온도로 냉각하는 데 약 5시간이 걸릴 수 있습니다.
2. 슬라이드 워머 또는 인큐베이터의 전원을 켜고 37°C로 설정되어 있는지 확인합니다. 슬라이드가 원하는 온도에 도달할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 하십시오.
   참고: 이 단계에서 라벨이 부착된 슬라이드는 워머 또는 인큐베이터에 놓고 절단될 때까지 무기한 방치할 수 있습니다.
3. 드라이아이스를 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오. 얼음은 80단계에 도달하면 -5°C에서 보관에서 제거할 수 있습니다.

2. 용액 준비

1. PBS 50mL를 준비합니다. PBS에 10mM 에델린 글리콜 테트라아세트산 10mL를 준비합니다. PBS에서 4% 파라포름알데히드 용액을 준비하며, 최종 부피는 실험군 수의 100μL 곱하기와 같습니다.
2. 스프레이 병에 70% 에탄올의 물을 섞은 세척액을 준비합니다. 모든 형광 염색 용액을 준비합니다.
   참고: 이 프로토콜은 간단한 형광 염색 또는 염료를 사용하여 간단한 염색을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 경우 PBS에서 1:250 비율로 1x Phalloidin 594의 사용을 설명합니다. 형광 염색 농도는 시약과 실험 목표에 따라 달라집니다. 적절한 농도를 찾기 위해 예비 테스트를 수행해야 합니다. 항체 염색은 여기에 자세히 설명되어 있지 않지만 기존 염색 방법을 사용하여 적용할 수 있습니다.

3. 조직의 채취

1. CO₂ 플라이 매트를 사용하여 5-10마리의 파리를 마취하고 1x-2x 배율로 현미경으로 볼 수 있는 파리를 배치합니다. CO₂ 조절기는 CO₂ 매트에 1에서 5kPa 사이를 등록해야 합니다.
   참고: 다른 마취 방법(예: FlyNap²)을 사용할 수 있으며 이러한 방법은 결과에 큰 영향을 미치지 않습니다.
2. 봄 가위를 사용하여 목을 자르고 날개를 자르고 다리를 5 마리에서 10 마리까지 제거합니다. 남아있는 것은 흉부와 복부이며, 함께 몸이라고 불릴 것입니다.
   참고: 5단계에서 플라이 바디를 적절하게 정렬하려면 남아 있는 날개 또는 다리 길이가 금형 바닥을 따라 평평한 정렬을 방해하지 않아야 합니다. 날개와 다리를 흉부에 최대한 가깝게 잘라서 이 작업을 수행합니다.
3. 브러시를 사용하여 모든 실험 그룹이 수집될 때까지 얼음 위에 표시된 1.5mL 튜브에 시체를 부드럽게 넣습니다.

4. 전체적인 조직의 정착

1. 얼음에서 튜브를 제거한 후 각 튜브에 10mM EGTA, pH 8 100μL를 추가하여 복부 내 심장 조직을 이완시킵니다. 모든 물체가 10분 동안 물에 잠기고 오비탈 셰이커에 놓였는지 확인합니다. 탁상용 원심분리기를 사용하여 본체가 쉽게 잠길 수 있습니다.
2. 튜브의 용액을 제거하고 버립니다. 각 튜브에 PBS 100μL를 피펫팅하여 10분 동안 조직을 세척한 후 안와 쉐이커에 놓습니다. 시간이 경과한 후 제거하고 폐기하십시오.
3. PBS 용액의 4% 파라포름알데히드 100μL를 각 튜브에 피펫으로 넣습니다. 모든 본체가 솔루션에 잠겨 있는지 확인합니다.
4. 오비탈 셰이커에 15분 동안 놓고 속도를 약 100 유닛으로 설정합니다. 설정이 용액과 접촉하지 않은 조직을 흔들지 않는지 확인하십시오.
5. 이 시간이 경과한 후 PFA를 버리고 10분 동안 1x PBS로 교체하여 모든 물체가 용액에 접촉하는지 다시 확인합니다. 남은 각 세척에 대해 4.4단계와 유사한 속도로 튜브를 오비탈 셰이커에 다시 넣습니다.
6. 매번 이전 용액을 버리고 PBS로 조직을 2회 각각 10분씩 총 3회 세척합니다.
7. 최종 세척을 폐기한 후 본체를 PBS 용액의 10% 자당으로 옮겨 튜브 내의 용액과 접촉하도록 합니다. 최적의 채도를 위해 밤새 또는 시체가 바닥으로 가라앉을 만큼 충분히 오래 두십시오.
   참고: 야간 동결 보호가 선호되지만 당일 촬영이 필요한 경우 동결 보호제가 조직에 침투할 수 있도록 가능한 한 오랜 시간을 허용하십시오.

5. 금형 준비

1. 이 시점에서 저장소에서 드라이 아이스를 꺼내 작은 금속 또는 플라스틱 트레이에 넣을 몇 가지 조각을 선택하십시오. 트레이의 치수는 금형을 삽입할 수 있는 것이어야 하며, 하나의 크고 가급적이면 평평한 드라이아이스 조각 위에 직접 놓을 수 있어야 합니다.
2. 라벨이 부착된 금형에 최적 절삭 온도(OCT) 화합물을 약 50% 채웁니다. 화합물이 천천히 흐르도록 하여 기포의 유입을 줄이십시오.
3. 브러시를 사용하여 금형 내의 OCT 표면에 본체를 조심스럽게 놓습니다. 이 단계에서는 여러 실험군을 뚜렷하게 구분해야 합니다.
   알림: 브러시에 의한 자당 용액 오염으로 인해 OCT 화합물이 희석되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 또한 브러시를 사용하여 OCT 깊숙이 배치하면 많은 기포가 생성될 수 있습니다. 나중에 섹션 문제를 방지하기 위해 이러한 실수를 피하십시오.
4. 집게를 사용하여 일반적으로 바닥을 따라 흉부와 복부의 등벽이 있는 금형의 바닥으로 각 몸을 밀어 넣습니다. 그런 다음 복부가 금형 바닥을 따라 평평하게 우선시되도록 몸을 조정합니다. X, Y 및 Z 치수의 모든 바디를 정렬하여 각 섹션에 모든 주제가 동시에 포함되도록 합니다.
5. 복부의 곡률이 있을 수 있으며, 특히 남성의 경우 더욱 그렇습니다. 기술자의 능력을 최대한 발휘할 수 있도록 이를 평평하게 만듭니다. 이것은 코로나 평면에서 더 긴 절편을 수집하는 데 필수적입니다. 이 과정에서 금형 바닥에 몸체에 구멍을 내거나 찌그러뜨리지 마십시오. 각 주제를 올바르게 정렬하기 위해 체계적으로 작업합니다.
6. 모든 피험자가 제자리에 놓이면 틀을 잡고 바닥을 드라이 아이스 조각 바로 위에 놓습니다. 접촉 후 몇 분 후에 OCT가 멈추기 시작하는지 확인하십시오. 모든 피험자가 주형의 얼어붙은 부분에 갇힐 때까지 이 과정을 계속한다.
7. 이 단계에 도달하면 금형을 -20°C로 옮겨 전체적으로 동결시킵니다. 첫 번째 부분이 완전히 얼었을 때 금형의 나머지 부분을 채웁니다. 그런 다음 금형을 -80°C에서 보관하여 알루미늄 호일로 감싸거나 즉시 절단하여 나중에 사용할 수 있습니다.
   알림: 두 동결 단계 사이에 -20°C 및 -80°C에서 공기에 대한 개방 노출을 피하십시오. 이로 인해 층 사이에 수분이 발생할 수 있습니다.

6. 금형의 냉동 절편

참고: 일반적으로 실험 그룹 주형을 절단하기 전에 빈 주형을 준비하고 절단하는 것이 좋습니다. 이를 통해 조직을 절단하기 직전에 휠, 블레이드 및 안티롤 유리의 적절한 기능을 보장할 수 있습니다. 또한, 더 차가운 보관에서 나오는 모든 곰팡이가 저온 유지 장치에 30분 동안 적응하도록 합니다.

1. 블록에 OCT를 넉넉히 바르고 비트를 위에 놓고 평평하게 눌러 척 비트를 금형에 부착합니다. 이것을 저온 유지 장치에서 일반적으로 5분 이내에 완전히 얼리도록 합니다.
2. 금형에서 비트와 OCT 블록을 분리하고 척에 넣어 블록이 위에서 아래로 올바른 방향을 유지하도록 합니다. 비트가 고정될 때까지 척 키를 조입니다.
3. 조정 손잡이와 척 깊이 컨트롤을 사용하여 블록을 블레이드에 맞춥니다. 단면 폭을 20μM 이하로 설정합니다.
   참고: 더 얇은 절편은 수집 가능한 절편의 수를 늘리는 데 더 바람직합니다. 각 주제의 처음 2-6개 섹션에는 방향과 섹션 너비의 함수인 원하는 심장의 방해받지 않는 부분이 포함되어야 합니다. 중요한 2-6 섹션을 절단하기 직전에 척의 방향을 파악해야 합니다.
4. 느리지만 일관된 동작으로 각 슬라이스를 자르면 안티롤 유리가 각 슬라이스를 캡처할 수 있습니다. 데워진 슬라이드를 사용하여 섹션을 수집합니다. 첫 번째 세탁 전에 최소 30분에서 1시간 이내에 슬라이드를 실온에서 건조시키십시오.

7. 형광 염색

1. 건조 기간 직후에는 면도날을 사용하여 섹션을 둘러싼 과도한 OCT를 제거합니다. 이 단계에서 조직을 만나지 않도록 주의하십시오. 슬라이드를 나중에 염색하려는 경우 -80°C에서 보관하십시오.
2. 소수성 마커를 사용하여 각 슬라이드에서 이 테두리의 윤곽을 그립니다. 이 테두리는 조직에 세척 및 얼룩 용액을 유지하는 역할을 합니다.
   참고: 이 프로토콜은 피펫 방법을 사용하여 염색 및 세척을 수행하는 방법을 간략하게 설명하며 슬라이드 버킷 및 랙도 사용할 수 있습니다. 슬라이드 위에 있는 용액의 피펫팅을 각각의 새로운 용액에 슬라이드를 담그는 것으로 대체하기만 하면 됩니다. 최근 뇌 영상에 대해 한 것처럼¹⁷, 면역염색 절차는 심장 염색에도 적용될 수 있다.
3. 모든 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하되 가능한 한 조직 위에 직접 피펫팅하는 것을 피하고 슬라이드 위에서 부드럽게 피펫팅하여 세척합니다. 1000 μL 피펫 및 관련 팁을 사용하여 이 작업을 수행합니다. 용액을 빠르게 분사하면 슬라이드 표면에서 조직이 분리될 수 있으므로 용액을 빠르게 분사하지 마십시오.
4. 최종 세척을 버리고 형광 염색 용액(1:250, 1x Phalloidin)을 조직에 피펫팅합니다. 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
5. 이 시점 이후, 피사체는 빛에 민감해집니다. 모든 후속 단계는 어두운 곳에서 수행하거나 슬라이드를 덮어 수행합니다. 형광 염색을 버리고 1000μL 피펫을 사용하여 PBS로 5분 동안 3회 세척합니다.

8. 이미징을 위한 장착 및 준비

1. 최종 세척을 버리고 슬라이드에 소량의 PBS를 남깁니다. 1000 μL 피펫을 사용하여 슬라이드에 장착 매체를 3-5방울 떨어뜨려 조직에 직접 배치하는 것을 방지합니다.
2. 기포 생성을 최소화하도록 슬라이드에 커버슬립을 놓습니다. 쉽게 하려면 집게를 사용하여 커버슬립을 한쪽 가장자리에 놓고 슬라이드와 같은 높이가 될 때까지 다른 쪽을 서서히 내립니다. 새로 장착한 슬라이드는 조심스럽게 다루고 4°C에서 최소 24시간 동안 평평하게 보관하십시오.
3. 매니큐어를 사용하여 슬라이드를 밀봉하거나 장착 매체가 경화되는 경우 이를 피하십시오. 네온이나 반짝이가 포함된 매니큐어는 사용해서는 안 됩니다. 형광 염색에 따라 즉시 이미징을 수행하거나 나중에 캡처하기 위해 슬라이드를 저장할 수 있습니다.

9. 이미징

참고: 이미지 캡처에는 10x, 40x 및 60x 렌즈가 장착된 Olympus BX 63 현미경이 사용되었습니다. DAPI, 지질 스폿 488 및 팔로이딘 594에 대한 적절한 필터도 사용되었습니다.

1. 이미징하기 전에 슬라이드를 검사하고 티슈 와이프와 수용액에 70% 에탄올을 사용하여 청소합니다. 장착 직후 슬라이드를 이미지화하는 경우 커버슬립을 방해하지 않도록 청소할 때 각별히 주의하십시오.
2. 전체 실험 내에서 가장 밝은 형광 발광 대상을 기준으로 각 채널에 대한 적절한 노출 시간을 선택합니다. 과포화를 피하면서 가능한 한 밝은 이미지를 생성하고 배경을 줄입니다. 각 채널의 실시간 보기를 통해 각 실험 그룹을 신속하게 조사하여 노출이 적절하게 설정되었는지 확인합니다.
3. 일관성을 위해 모든 주제에서 동일한 채널을 사용하여 각 주제에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 각 피사체를 캡처합니다. 비교된 그룹 간의 형광 붕괴 차이를 피하기 위해 같은 날 비교에 사용된 모든 실험 그룹을 캡처합니다.
4. 이미징 후 나중에 이미지를 다시 캡처할 수 있도록 슬라이드를 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.

결과

위에서 설명한 방법은 지루한 해부 없이 형광 이미징을 사용하여 초파리 심장 연구를 용이하게 합니다. 이것이 이 방법의 주요 이점인데, 기존의 심장 박리 방법은 복잡한 운동 기술의 개발을 필요로 하기 때문입니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 이 방법은 새로운 연구자가 심장 박리보다 접근하기 쉽고 실험에 유연성을 제공합니다. 또는 OCT 금...

토론

우리는 형광 또는 컨포칼 이미징을 사용하여 시각화를 위해 초파리 심장관을 준비하기 위한 효율적인 프로토콜을 개발했습니다. 이에 앞서 초파리 심장의 세포학적 무결성에 접근하고 모니터링하기 위해 일반적으로 사용되지만 시간과 노동 집약적인 방법에 대한 논의가 있습니다. 당사의 혁신적이고 효율적인 방법은 초파리 심장관의 구조적 무결성...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500