שיטה חדשנית ויעילה לצביעה פלואורסצנטית של לב דרוזופילה עם הקפאה

Summary

פרוטוקול חתך הלב וההדמיה הקרינה של דרוזופילה מפשט את חקר מבנה הלב והפתולוגיות. גישה זו כוללת חתך, צביעה והדמיה פשוטים, תוך עקיפת המומחיות הטכנית הדרושה לנתיחה מסורתית. זה משפר את הנגישות, מה שהופך את הדרוזופילה למודל שמיש יותר למחקר הקשור ללב בקרב הקהילה המדעית הרחבה יותר.

Abstract

מודלים של לב דרוזופילה נמצאים בשימוש נרחב בחקר הזדקנות הלב ומודלים של מחלות לב אנושיות. עם זאת, דיסקציה של לבבות דרוזופילה לפני הדמיה היא תהליך קפדני עתיר זמן הדורש הכשרה מתקדמת ומיומנויות מוטוריות. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, אנו מציגים פרוטוקול חדשני המשתמש בהקפאה להדמיה פלואורסצנטית של רקמת הלב של דרוזופילה. הפרוטוקול הודגם בהדמיה של לב דרוזופילה בוגר אך ניתן להתאים אותו לשלבי התפתחות. השיטה משפרת הן את היעילות והן את הנגישות של צביעה פלואורסצנטית תוך שמירה על שלמות הרקמה. פרוטוקול זה מפשט את התהליך מבלי לפגוע באיכות ההדמיה, ובכך מפחית את התלות בטכנאים בעלי הכשרה ומיומנויות מוטוריות מפותחות. באופן ספציפי, אנו מחליפים טכניקות מורכבות, כגון שאיבת ואקום נימית, בשיטות פשוטות יותר כמו הטמעת רקמות. גישה זו מאפשרת הדמיה של מבני לב בקלות רבה יותר וביכולת שחזור. אנו מדגימים את התועלת של פרוטוקול זה על ידי זיהוי יעיל של סמני לב מרכזיים והשגת הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה וצביעת חיסון החושפת פרטים מורכבים של מורפולוגיה של הלב וארגון התאים. שיטה זו מספקת כלי חזק ונגיש לחוקרים החוקרים את הביולוגיה הלבבית של דרוזופילה, ומאפשרת ניתוחים מפורטים של התפתחות הלב, תפקוד ומודלים של מחלות.

Introduction

מחלות לב וכלי דם (CVD) הן סיבת המוות המובילה בעולם, ואחראית לכ-17.9 מיליון מקרי מוות מדי שנה, המהווים כמעט^שליש מכלל מקרי המוות בעולם. Drosophila melanogaster (הידוע בכינויו זבוב הפירות) נמצא בשימוש נרחב כאורגניזם מודל לחקר הבסיס הגנטי, התאי והמולקולרי של התפתחות הלב, פיזיולוגיה, חילוף חומרים, הזדקנות וקרדיומיופתיה 1,2,3,4,5,6,7,8,9. מודלים של דרוזופילה שימשו גם לחקר תפקידו של שריר הלב בוויסות מערכתי של השמנת יתר¹⁰, גורם סיכון עיקרי לתחלואה ותמותה קרדיווסקולרית. מחקרי ריצוף גנום של דרוזופילה ¹¹ חשפו שימור משמעותי של גנים בבני אדם, כולל אלה הקשורים להתפתחות איברים שונים, כולל הלב. בין הגנים השמורים הללו, חלקם מעורבים בתפקוד לקוי של הלב, כגון קרדיומיופתיה או תעלות³. הפיתוח האחרון של טכניקות יעילות לחקר ביצועי הלב הרחיב את יישומי המודל כדי לחקור שינויים ארוכי טווח בפיזיולוגיה של הלב במבוגרים עקב גורמים כמו פעילות גופנית, תזונה והזדקנות⁸. עם זאת, אתגרים טכניים ולוגיסטיים מעכבים לעתים קרובות את השימוש במערכת מודל זו. אחד האתגרים בשימוש בדרוזופילה במחקרי לב הוא דיסקציה מדויקת של הלב באופן המשמר את הארכיטקטורה הציטו-ארכיטקטונית ואלמנטים של שריר הלב.

לב הדרוזופילה או כלי הגב מורכב ממבנה דמוי צינור המורכב משכבה אחת של קרדיומיוציטים, תאי קרום הלב הממוקמים לאורך דופן הלב, נתמכים על ידי שרירי אלרי, ובמבוגרים, מלווים בשכבה של תא שריר אורך גחוני¹². נתיחה מדויקת כדי לגשת למבנים העדינים הללו היא תהליך עתיר זמן ועבודה. התקן הנוכחי כולל דיסקציה מאתגרת מבחינה טכנית ויניקת ואקום נימית, הדורשת הכשרה מתקדמת ומיומנויות מוטוריות 13,14,15,16. בדרך כלל, הדיסקציה מתחילה בחתך דופן הגוף הגחוני, והאתגרים מציגים את עצמם במהירות עם האנטומיה הזעירה של הלב, המבנה השברירי שלו והמיקום הגבי הקשה לגישה. זה בשילוב עם טכניקות דיסקציה מסורתיות, מאפשר ניתוח מדויק של מבנה הלב ותפקודו, ומספק כלי משופר לחקר מחלות לב וכלי דם בדרוזופילה¹³. לדוגמה, באמצעות זה, Alayari et al. סיפקו פרוטוקול לתיוג פלואורסצנטי של מבני לב דרוזופילה, מה שהקל על הדמיה של מורפולוגיה ומבנה לב. למרות מאמצים אלה, דיסקציה וצביעה מסורתית של הלב מתמודדת עם מספר אתגרים, כולל הקושי לשמור על שלמות הרקמות וההכשרה המיוחדת הנדרשת לצביעה יעילה של הלב.

השיטה מציעה פתרון חדשני לבעיה זו על ידי החלפת ההליך כולו בפרוטוקול פשוט יותר המשתמש בהקפאה של בית החזה והבטן של דרוזופילה ולאחר מכן צביעה חיסונית והדמיה פלואורסצנטית. גישה קלה ללמידה זו מבטיחה הדמיה מהירה ופשוטה יותר של מבני לב עם יכולת שחזור רבה יותר. בנוסף, אנו מתארים שיטה פשוטה הכוללת קרח יבש המבטיחה יישור אחיד של ציפורן הבטן של דרוזופילה באותו מישור z המייעל את שלב ההקפאה במורד הזרם. אנו מדגימים את היעילות של פרוטוקול זה בזיהוי סמנים לבביים חשובים, מורפולוגיה של הלב וארגון תאים באמצעות מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית כמו גם קונפוקלית. הקלות והיעילות הגבוהה של גישה זו מועילות במיוחד למחקרי לב מבוססי דרוזופילה בתפוקה גבוהה.

Protocol

1. הכנת ציוד

1. ודא שהקריוסטט מופעל ומוגדר ל-20 מעלות צלזיוס. אפשר לחלוף זמן מספיק עד שהטמפרטורה תגיע לנקודה זו. אם המכונה נמצאת בטמפרטורת הסביבה, הקירור לטמפרטורת חיתוך אופטימלית יכול להימשך כ-5 שעות.
2. הפעל את מחמם השקופיות או החממה, וודא שהוא מוגדר ל-37 מעלות צלזיוס. ודא שלמגלשות יש מספיק זמן להגיע לטמפרטורה הרצויה.
   הערה: בשלב זה, ניתן להניח שקופיות מסומנות על המחמם או החממה ולהשאיר ללא הגבלת זמן עד לחתך.
3. ודא שקרח יבש מוכן לשימוש. ניתן להסיר קרח מהאחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחר הגעה לשלב 5.

2. הכנת פתרונות

1. הכן 50 מ"ל PBS. הכן 10 מ"ל של 10 מ"מ חומצה טטראצטית אתלין גליקול ב- PBS. הכן תמיסה של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS כאשר הנפח הסופי שווה ל-100 מיקרוליטר כפול מספר קבוצות הניסוי.
2. הכינו תמיסת ניקוי של 70% אתנול במים בבקבוק ריסוס. הכן את כל פתרונות הצביעה הפלואורסצנטיים.
   הערה: פרוטוקול זה יפרט כיצד לבצע צביעה פשוטה באמצעות כתמים או צבעים פלואורסצנטיים פשוטים. במקרה זה, נתאר את השימוש ב-1x Phalloidin 594 ביחס של 1:250 ב-PBS. ריכוזי כתמים פלואורסצנטיים ישתנו בהתאם למגיב ולמטרות הניסוי. יש לבצע בדיקות מקדימות כדי למצוא את הריכוז המתאים. צביעת נוגדנים לא תפורט כאן אך צריכה להיות ישומה בשיטות צביעה קונבנציונליות.

3. איסוף רקמות

1. הרדמו 5-10 זבובים באמצעות מחצלת זבובים CO₂ ומקמו את הזבובים בטווח הראייה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של 1x-2x. ווסת CO₂ צריך לרשום בין 1 ל-5 kPa למחצלת CO₂ .
   הערה: קיימות שיטות אחרות להרדמה (למשל, FlyNap²), ושיטות אלו אינן משפיעות באופן משמעותי על התוצאות.
2. בעזרת מספריים קפיציים, ערפו את הראש, קצצו את הכנפיים והוציאו את הרגליים מ -5 עד 10 זבובים. מה שנשאר הוא בית החזה והבטן, ביחד ייקראו הגוף.
   הערה: כדי ליישר גופי זבוב כראוי בשלב 5, אסור שכל אורכי הכנפיים או הרגליים שנותרו יפריעו ליישור שטוח לאורך תחתית התבנית. השיגו זאת על ידי קיצוץ הכנפיים והרגליים קרוב ככל האפשר לבית החזה.
3. בעזרת מברשת, הניחו בעדינות את הגופות בצינורות מסומנים של 1.5 מ"ל על קרח עד שכל קבוצות הניסוי נאספו.

4. קיבוע של רקמה שלמה

1. אחרי הוצאת הצינורות מהקרח, הוסיפו 100 מיקרוליטר של 10 מ"מ EGTA, pH 8, לכל צינור כדי להרפות את רקמת הלב בתוך הבטן. ודא שכל הגופים שקועים למשך 10 דקות ומונחים על שייקר המסלול. ניתן להשתמש בצנטריפוגה שולחנית כדי להקל על הגופים לטבול.
2. הסר והשליך את התמיסה בצינור. פיפטה 100 מיקרוליטר של PBS בכל צינור לשטיפת רקמות למשך 10 דקות, הנחת שייקר המסלול. הסר והשליך לאחר שחלף הזמן.
3. פיפטה 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד בתמיסת PBS לכל צינור. ודא שכל הגופים שקועים בתמיסה.
4. הניחו על שייקר מסלולי למשך 15 דקות, והגדירו את המהירות לכ-100 יחידות. ודא שההגדרה אינה מעוררת את הרקמות מחוץ למגע עם התמיסה.
5. לאחר שחלף זמן זה, השליכו את ה-PFA והחליפו אותו ב-1x PBS למשך 10 דקות, וודא שוב שכל הגופים יוצרים קשר עם הפתרון. החזר את הצינורות לשייקר המסלול במהירות דומה לשלב 4.4 עבור כל שטיפה שנותרה.
6. זורקים את התמיסה הקודמת בכל פעם, שוטפים את הטישו עם PBS 2x למשך 10 דקות כל אחד, בסך הכל 3 כביסות.
7. לאחר השלכת הכביסה הסופית, העבירו את הגופות לסוכרוז של 10% בתמיסת PBS, והבטיחו שהם באים במגע עם התמיסה בתוך הצינור. לקבלת רוויה אופטימלית, השאירו אותם למשך הלילה או מספיק זמן כך שהגופים ישקעו לתחתית.
   הערה: עדיפה הגנה מפני הקפאה למשך הלילה, אך אם יש צורך בהדמיה באותו יום, אפשר זמן רב ככל האפשר לחומר ההקפאה לחדור לרקמה.

5. הכנת עובש

1. בשלב זה, הוציאו את הקרח היבש מהאחסון ובחרו כמה חתיכות להצבה במגש מתכת או פלסטיק קטן. מידות המגש צריכות להיות כאלה שניתן להכניס את התבנית, ולהניח אותה ישירות על גבי חתיכת קרח יבש אחת, גדולה, ורצוי שטוחה.
2. מלאו תבנית מסומנת כ-50% בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). נסה להפחית את הכנסת הבועות על ידי מתן אפשרות לתרכובת לזרום לאט.
3. בעזרת מברשת, הניחו בזהירות את הגופות על פני ה-OCT בתוך התבנית. יש להפריד באופן ברור בין קבוצות ניסוי מרובות בשלב זה.
   הערה: חשוב למנוע דילול של תרכובת ה-OCT באמצעות זיהום בתמיסת הסוכרוז על ידי המברשת. בנוסף, מיקום עמוק לתוך ה-OCT באמצעות המברשת יכול ליצור בועות אוויר רבות. הימנע מטעויות אלה כדי למנוע בעיות חתך מאוחר יותר.
4. בעזרת מלקחיים דוחפים כל גוף לתחתית התבנית עם דופן הגב של בית החזה והבטן, בדרך כלל לאורך החלק התחתון. לאחר מכן, התאימו את הגוף כך שהבטן תקבל עדיפות כשטוחה לאורך החלק התחתון של התבנית. יישר את כל הגופים בממדים X, Y ו-Z כך שכל קטע יכיל את כל הנושאים בו זמנית.
5. תיתכן עקמומיות של הבטן, במיוחד אצל הזכרים; שטח את זה כמיטב יכולתו של הטכנאי. זה חיוני לאיסוף קטעים ארוכים יותר במישור העטרה. הימנע מניקוב או ריסוק הגופות בתחתית התבנית במהלך תהליך זה. עבוד באופן שיטתי כדי ליישר כל נושא בצורה נכונה.
6. לאחר שכל הנושאים נמצאים במקומם, קחו את התבנית והניחו את החלק התחתון ישירות על פיסת קרח יבש. בדוק אם ה-OCT מתחיל לקפוא לאחר מספר רגעים לאחר המגע. אפשר לזה להימשך עד שכל הנושאים נעטפים בחלק הקפוא של התבנית.
7. לאחר הגעה לשלב זה, העבירו את התבנית ל-20 מעלות צלזיוס להקפאה לאורך כל הדרך. ממלאים את החלק הנותר של התבנית כשהחלק הראשון קפוא לחלוטין. לאחר מכן ניתן לאחסן את התבניות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר על ידי עטיפתן בנייר אלומיניום או לחתוך אותן מיד.
   הערה: הימנע מחשיפה פתוחה לאוויר ב-20 מעלות צלזיוס ו-80 מעלות צלזיוס בין שני ההקפאהtags. זה יכול לגרום להתפתחות לחות בין השכבות.

6. הקפאת תבניות

הערה: בדרך כלל רצוי להכין ולחתוך תבנית ריקה לפני חיתוך תבניות קבוצתיות ניסוי. זה מאפשר לנו להבטיח את הפונקציונליות התקינה של הגלגל, הלהב והזכוכית נגד גלגול מיד לפני חיתוך רקמה. בנוסף, אפשר לכל תבניות המגיעות מאחסון קר יותר להתאקלם בקריוסטט למשך 30 דקות.

1. חבר את סיבית הצ'אק לתבנית על ידי מריחת כמות נדיבה של OCT על הבלוק והנחת הביט מעל, לחיצה עליו שטוח. אפשר לזה לקפוא לחלוטין בקריוסטט, בדרך כלל תוך 5 דקות.
2. שחרר את הביט ואת בלוק ה-OCT מהתבנית והנח אותו לתוך הצ'אק, וודא שהבלוק נשאר מכוון כראוי מלמעלה למטה. הדק את מפתח הצ'אק עד שהביט מאובטח.
3. יישר את הבלוק עם הלהב באמצעות כפתורי הכוונון ובקרות עומק הצ'אק. הגדר את רוחב המקטע ל-20 מיקרומטר ומטה.
   הערה: חלקים דקים יותר רצויים יותר כדי להגדיל את מספר החלקים האפשריים שנאספו. 2-6 החלקים הראשונים של כל נושא צריכים להכיל את החלקים הרצויים ללא הפרעה של הלב שהם פונקציה של הכיוון ורוחב החתך. יש לנסות ולקבל את כיוון הצ'אק נכון לפני שחותכים את 2-6 החלקים החשובים.
4. חותכים כל פרוסה בהילוך איטי אך עקבי, ומאפשרים לזכוכית נגד גלגול ללכוד כל פרוסה. אסוף קטעים באמצעות שקופיות מחוממות. הניחו לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, אך לא יותר משעה לפני סבב הכביסה הראשון.

7. צביעה פלואורסצנטית

1. מיד לאחר תקופת הייבוש, הסר עודפי OCT המקיפים את החלקים באמצעות סכין גילוח. היזהר להימנע ממפגש עם הרקמה בשלב זה. אם השקופית מיועדת להיות מוכתמת בנקודת זמן מאוחרת יותר, אחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. שרטט את הגבול הזה בכל שקופית באמצעות סמן הידרופובי. גבול זה ישמש לשמירה על תמיסות שטיפה וכתמים על הרקמה.
   הערה: פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מכתים וכביסה בשיטת פיפטה, ניתן להשתמש גם בדלי החלקה ומתלים. כל שעליך לעשות הוא להחליף את פיפטינג התמיסות על גבי המגלשות בהטבעת שקופיות בכל אחד מהפתרונות הטריים. כפי שעשינו לאחרונה עבור הדמיית מוח¹⁷, ניתן ליישם הליך צביעה חיסונית גם על צביעת לב.
3. שטפו את כל המגלשות 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם PBS על ידי פיפטינג בעדינות על גבי המגלשה, הימנעו מפיפטינג ישירות על גבי הטישו במידת האפשר. בצע זאת באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר והטיפים הנלווים. נסו לא לסנן את התמיסה במהירות מכיוון שהדבר עלול לגרום לרקמות להשתחרר מפני השטח של המגלשה.
4. השליכו את הכביסה הסופית ושפכו את תמיסת הכתם הקרינה (1:250, 1x פלואידין) על הרקמות. הניחו לזה לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
5. לאחר נקודה זו, הנבדקים רגישים לאור. בצע את כל השלבים הבאים בחושך או על ידי כיסוי השקופיות. השליכו את כתם הקרינה, ובעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר שטפו 3 פעמים למשך 5 דקות עם PBS.

8. הרכבה והכנה להדמיה

1. השליכו את הכביסה הסופית והשאירו כמות קטנה של PBS על השקופית. פיפטה 3-5 טיפות של מדיית הרכבה על המגלשה באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר, הימנעות מפריסה ישירה על רקמה.
2. הנח את הכיסוי על השקופית כך שייצור בועות האוויר ימוזער. להקלה, השתמש במלקחיים כדי למקם את החלקת הכיסוי בקצה אחד ולהוריד בהדרגה את הצד השני עד שהוא סומק עם המגלשה. טפל במגלשות הטריות שהותקנו בזהירות ואחסן אותן שטוחות לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. אטום שקופיות באמצעות לק, או אם אמצעי ההרכבה מתקשה, הימנע מכך. אין להשתמש בלק המכיל ניאון או נצנצים. בהתאם לכתם הפלואורסצנטי, בצע הדמיה באופן מיידי או אחסן שקופיות ניתן לאחסן ללכידה מאוחרת יותר.

9. הדמיה

הערה: מיקרוסקופ Olympus BX 63 עם עדשות 10x, 40x ו-60x שימש לצילום תמונה. נעשה שימוש גם במסננים המתאימים ל-DAPI, Lipid Spot 488 ו-Phalloidin 594.

1. לפני ההדמיה, בדוק את השקופיות ונקה אותן באמצעות מגבון טישו ואתנול 70% בתמיסת מים. אם שקופיות מצולמות מיד לאחר ההרכבה, היזהר במיוחד בעת הניקוי כדי למנוע הפרעה לכיסוי.
2. בחר זמני חשיפה מתאימים עבור כל ערוץ בהתבסס על נושאי הפלואורסצנט הבהירים ביותר בניסוי הכולל. הימנע מרוויית יתר תוך יצירת תמונה בהירה ככל האפשר והקטנת הרקע. סקר במהירות כל קבוצת ניסוי עם תצוגה חיה של כל ערוץ כדי לוודא שהחשיפות מוגדרות כראוי.
3. התמקד בכל נושא, תוך שימוש באותו ערוץ בכל נושאי הצילום לעקביות. לאחר מכן, צלמו כל נושא. לכוד את כל קבוצות הניסוי המשמשות להשוואה באותו יום כדי למנוע הבדלים בדעיכה פלואורסצנטית בין קבוצות ההשוואה.
4. לאחר ההדמיה, אחסן שקופיות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס לצילום מחדש של תמונה מאוחר יותר.

תוצאות

השיטה שתוארה לעיל מקלה על חקר לב הדרוזופילה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית ללא דיסקציה מייגעת. זהו היתרון העיקרי של שיטה זו, שכן השיטה הקונבנציונלית לדיסקציה של לב דורשת פיתוח מיומנויות מוטוריות מורכבות. כפי שמודגם באיור 1, השיטה נגישה יותר מדיסקציה של ...

Discussion

פיתחנו פרוטוקול יעיל להכנת צינור לב דרוזופילה להדמיה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית או קונפוקלית. קדם לכך דיון בשיטה נפוצה אך עתירת זמן ועבודה לגישה ולניטור השלמות הציטולוגית של לב דרוזופילה. השיטה החדשנית והיעילה שלנו מציעה אלטרנטיבה תמציתית ויעילה לגישות מסור...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500