使用冷冻切片进行 果蝇 心脏荧光染色的新型高效方法

摘要

果蝇心脏切片和荧光成像方案简化了心脏结构和病理的研究。这种方法涉及简单的切片、染色和成像，绕过了传统解剖所需的技术专业知识。它增强了可及性，使果蝇成为更广泛的科学界中更广泛使用的心脏相关研究模型。

摘要

果蝇 心脏模型广泛用于研究心脏衰老和人类心脏病建模。然而，在成像前解剖 果蝇 心脏是一个细致、耗时的过程，需要高级培训和运动技能。为了应对这些挑战，我们提出了一种创新的方案，该方案利用冷冻切片对 果蝇 心脏组织进行荧光成像。该方案已在成人 果蝇 心脏的成像中得到证明，但可以适用于发育阶段。该方法提高了荧光染色的效率和可及性，同时保持了组织的完整性。该协议在不影响成像质量的情况下简化了过程，从而减少了对具有高度培训和运动技能的技术人员的依赖。具体来说，我们用更直接的方法（如组织包埋）取代了复杂的技术，如毛细管真空抽吸。这种方法可以更容易地实现心脏结构的可视化和可重复性。我们通过有效检测关键心脏标志物并实现高分辨率荧光和免疫染色成像来揭示心脏形态和细胞组织的复杂细节，从而证明了该协议的实用性。该方法为探索 果蝇 心脏生物学的研究人员提供了一种强大且易于使用的工具，有助于对心脏发育、功能和疾病模型进行详细分析。

引言

心血管疾病 （CVD） 是全球主要死亡原因，每年造成约 1790 万人死亡，占全球死亡^总数的近 1/3。 黑腹果蝇（俗称果蝇）已被广泛用作模式生物，用于研究心脏发育、生理学、代谢、衰老和心肌病的遗传、细胞和分子基础 1,2,3,4,5,6,7,8,9。果蝇模型还被用于研究心肌在肥胖¹⁰ 的全身调节中的作用，肥胖是心血管发病率和死亡率的主要危险因素。果蝇基因组测序研究¹¹ 揭示了人类基因的显著保守性，包括与发育各种器官（包括心脏）相关的基因。在这些高度保守的基因中，有些与心肌病或离子通道病³ 有关。最近开发的有效研究心脏功能的技术扩大了该模型的应用范围，以探索由于运动、饮食和衰老等因素而导致的成人心脏生理学的长期变化⁸。然而，技术和物流方面的挑战往往会阻碍此模型系统的使用。在心脏研究中使用果蝇的一个挑战是以保留细胞结构和心肌元件的方式精确解剖心脏。

果蝇心脏或背血管由一个管状结构组成，该结构由单层心肌细胞组成，心包细胞位于心脏壁上，由小翼肌肉支撑，在成人中，伴有一层腹侧纵肌细胞¹²。准确解剖以接触这些精密结构是一个耗时耗力的过程。当前标准涉及技术上具有挑战性的解剖和毛细管真空抽吸，需要高级培训和运动技能 13,14,15,16。通常，解剖从切开腹体壁开始，随着心脏的微小解剖结构、脆弱的结构以及难以接近的背侧位置，挑战很快就会出现。这与传统的解剖技术相结合，可以精确分析心脏结构和功能，为研究果蝇¹³ 中的心血管疾病提供了改进的工具。例如，利用这个，Alayari 等人提供了一种荧光标记果蝇心脏结构的方案，促进了心脏形态和结构的可视化。尽管做出了这些努力，传统的心脏解剖和染色仍面临一些挑战，包括难以保持组织完整性以及有效心脏染色所需的专业培训。

该方法通过用更简单的方案代替整个程序来为这个问题提供创新的解决方案，该方案利用果 蝇 胸部和腹部的冷冻包埋，然后进行免疫染色和荧光成像。这种易于学习的方法可确保更快、更直接地可视化心脏结构，并具有更高的可重复性。此外，我们描述了一种涉及干冰的简单方法，该方法可确保 果蝇 腹部角质层在同一 z 平面上均匀对齐，从而简化下游的冷冻切片步骤。我们证明了该方案在用免疫荧光和共聚焦显微镜检测重要心脏标志物、心脏形态和细胞组织方面的有效性。这种方法的简便性和高效性对于基于果 蝇的高通量心脏研究特别有帮助。

研究方案

1. 设备准备

1. 确保低温恒温器已通电并设置为 -20 °C。 留出足够的时间让温度达到这一点。如果机器处于环境温度下，冷却到最佳切割温度可能需要大约 5 小时。
2. 打开玻片加热器或培养箱的电源，确保其设置为 37 °C。 确保玻片有足够的时间达到所需的温度。
   注意：在此阶段，可以将标记的载玻片放在加热器或培养箱上，并无限期放置直到切片。
3. 确保干冰已准备好使用。一旦达到第 5 步，就可以在 – 80 °C 下从储存中取出冰块。

2. 溶液的制备

1. 准备 50 mL 的 PBS。在 PBS 中制备 10 mL 的 10 mM 乙烯基乙二醇四乙酸。在 PBS 中制备 4% 多聚甲醛的溶液，其中最终体积等于 100 μL 乘以实验组数。
2. 在喷雾瓶中制备 70% 乙醇水溶液的清洁溶液。准备所有荧光染色溶液。
   注：该方案将详细说明如何使用简单的荧光染色剂或染料进行简单染色。在这种情况下，我们将描述在 PBS 中以 1：250 的比例使用 1x 鬼笔环肽 594。荧光染色剂浓度将根据试剂和实验目标而变化。应进行初步测试以找到合适的浓度。抗体染色在此处不详述，但应适用于使用常规染色方法。

3. 组织收集

1. 使用 CO₂ 苍蝇垫麻醉 5-10 只苍蝇，并在显微镜下以 1x-2x 放大倍率将苍蝇置于视野内。CO₂ 调节器应记录到 CO₂ 垫的 1 到 5 kPa 之间。
   注意：可以使用其他麻醉方法（例如，FlyNap²），并且这些方法不会显着影响结果。
2. 使用弹簧剪刀，斩首，夹住翅膀，然后去除 5 到 10 只苍蝇的腿。剩下的是胸部和腹部，合称为身体。
   注意：要在步骤 5 中适当对齐飞体，任何剩余的机翼或腿长度不得干扰沿模具底部的平面对齐。通过尽可能靠近胸部剪断翅膀和腿来实现这一点。
3. 使用刷子，将尸体轻轻放入冰上标记的 1.5 mL 试管中，直到收集完所有实验组。

4. 固定整个组织

1. 从冰中取出试管后，向每根试管中加入 100 μL 10 mM EGTA（pH 值为 8），以放松腹部内的心脏组织。确保所有身体浸没 10 分钟并放置在轨道摇床上。可以使用台式离心机来促进身体浸没。
2. 取出并丢弃试管中的溶液。在每个试管中吸取 100 μL PBS 以洗涤组织 10 分钟，然后放在定轨振荡器上。时间过后删除并丢弃。
3. 将 100 μL 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液移液到每个试管中。确保所有物体都浸没在溶液中。
4. 置于轨道摇床上 15 分钟，将速度设置为 100 个单位左右。确保该设置不会搅动与溶液接触的组织。
5. 这段时间过后，丢弃 PFA 并用 1x PBS 替换它 10 分钟，再次确保所有身体都接触溶液。对于剩余的每次洗涤，以与步骤 4.4 中相似的速度将试管放回轨道摇床中。
6. 每次丢弃先前的溶液，用 PBS 洗涤组织 2 次，每次 10 分钟，总共洗涤 3 次。
7. 丢弃最终洗涤液后，将小体转移到 PBS 溶液中的 10% 蔗糖中，确保它们与试管内的溶液接触。为了获得最佳饱和度，请将它们放置过夜或放置足够长的时间，以便身体沉入底部。
   注意：首选过夜冷冻保护，但如果需要当天成像，请留出尽可能长的时间让冷冻保护剂渗透到组织中。

5. 模具准备

1. 此时，从仓库中取出干冰，并选择几块放入一个小金属或塑料托盘中。托盘的尺寸应使模具可以插入，将其直接放在一块大的、最好是平坦的干冰上。
2. 用最佳切削温度 （OCT） 化合物填充贴标的模具大约 50%。尝试通过让化合物缓慢流动来减少气泡的引入。
3. 使用刷子，小心地将实体放在模具内的 OCT 表面上。在这个阶段，多个实验组应该明显分开。
   注：重要的是要防止 OCT 化合物因刷子被蔗糖溶液污染而稀释。此外，使用画笔将 OCT 深处放置会产生许多气泡。避免这些错误，以防止以后出现切片问题。
4. 使用镊子，将每个身体推到模具底部，胸部和腹部的背壁，通常沿着底部。然后，调整身体，使腹部优先沿模具底部平坦。对齐 X、Y 和 Z 维度中的所有主体，以便每个部分同时包含所有主体。
5. 腹部可能弯曲，尤其是雄性;尽技术人员的最大能力将其平整。这对于在冠状面收集较长的切片至关重要。在此过程中，避免将主体刺穿或挤压到模具底部。有条不紊地工作以正确对齐每个主题。
6. 一旦所有受试者都就位，拿起模具并将底部直接放在一块干冰的顶部。检查 OCT 是否在接触后片刻后开始冻结。让这个过程继续下去，直到所有受试者都被包裹在模具的冷冻部分。
7. 一旦达到此阶段，将模具转移到 -20 °C 以完全冻结。当第一部分完全冻结时，填充模具的剩余部分。然后可以将模具储存在 -80 °C 以备后用，方法是将它们包裹在铝箔中或立即切割。
   注：在两个冷冻阶段之间，避免露天暴露在 -20 °C 和 -80 °C 的空气中。这会导致层之间产生水分。

6. 模具的冷冻切片

注意：通常建议在切割实验组模具之前准备并切割一个空白模具。这使我们能够在切片组织之前立即确保轮子、刀片和防卷玻璃的正常功能。此外，让来自较冷储存的任何霉菌在低温恒温器中适应 30 分钟。

1. 将卡盘钻头连接到模具上，方法是在块上涂抹大量 OCT，然后将钻头放在顶部，将其压平。让它在低温恒温器中完全冻结，通常在 5 分钟内。
2. 从模具中松开钻头和 OCT 块并将其放入卡盘中，确保块从上到下保持正确方向。拧紧卡盘键，直到钻头固定。
3. 使用调节旋钮和卡盘深度控制将缸体与刀片对齐。将截面宽度设置为 20 μM 或更低。
   注意：更薄的截面更可取，以增加可能收集的截面数量。每个主题的前 2-6 个部分应包含心脏所需的畅通无阻的部分，这是方向和截面宽度的函数。在切割重要的 2-6 个部分之前，必须尝试正确确定卡盘的方向。
4. 以缓慢但一致的动作切割每一片，让防滚玻璃捕捉每一片。使用加热的玻片收集切片。让玻片在室温下干燥至少 30 分钟，但在第一轮洗涤前不超过 1 小时。

7. 荧光染色

1. 干燥期结束后，立即使用剃须刀片去除切片周围多余的 OCT。在这个阶段要小心避免接触组织。如果打算在以后的时间点对载玻片进行染色，请将它们储存在 -80 °C。
2. 使用疏水记号笔在每张幻灯片上勾勒出此边界。此边框将用于将洗涤液和染色液保留在组织上。
   注：该方案概述了如何使用移液器方法进行染色和洗涤，也可以使用载玻片桶和架子。只需将载玻片浸入每种新鲜溶液中，即可将溶液移液放在载玻片顶部。正如我们最近对脑成像¹⁷ 所做的那样，免疫染色程序也可以应用于心脏染色。
3. 通过在载玻片顶部轻轻移液，将所有载玻片洗涤 3 次，每次 5 分钟，尽可能避免直接在组织顶部移液。使用 1000 μL 移液器和相关吸头执行此作。尽量不要快速喷射溶液，因为这会导致组织从载玻片表面释放。
4. 弃去最终的洗涤液，并将荧光染色溶液（1：250,1x 鬼笔环肽）移液到组织上。让它在室温下在黑暗中孵育 1 小时。
5. 在此之后，被摄体对光敏感。在黑暗中或通过覆盖载玻片来执行所有后续步骤。弃去荧光染色剂，并使用 1000 μL 移液器，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

8. 成像的安装和准备

1. 丢弃最终洗涤液，在载玻片上留下少量 PBS。使用 1000 μL 移液器将 3-5 滴封固剂滴到载玻片上，避免直接沉积在组织上。
2. 将盖玻片放在载玻片上，以尽量减少气泡的产生。为方便起见，使用镊子将盖玻片放在一侧，然后逐渐降低另一侧，直到它与载玻片齐平。小心处理新安装的载玻片，并在 4 °C 下平放至少 24 小时。
3. 使用指甲油密封载玻片，或者如果封固剂变硬，请避免这样做。不应使用含有霓虹灯或闪光的指甲油。根据荧光染色，立即进行成像，或者储存载玻片以备以后捕获。

9. 成像

注意：使用配备 10 倍、40 倍和 60 倍镜头的奥林巴斯 BX 63 显微镜进行图像捕获。还使用了 DAPI、Lipid Spot 488 和 Phalloidin 594 的适当过滤器。

1. 成像前，检查载玻片并使用纸巾擦拭和 70% 乙醇水溶液清洁它们。如果载玻片在封片后立即成像，请在清洁时格外小心，以免干扰盖玻片。
2. 根据整个实验中最亮的荧光受试者为每个通道选择合适的曝光时间。避免过度饱和，同时生成尽可能明亮的图像并减少背景。使用每个通道的实时视图快速调查每个实验组，以确保曝光设置正确。
3. 专注于每个科目，在所有科目中使用相同的频道以保持一致性。然后，捕获每个主题。捕获同一天用于比较的所有实验组，以避免比较组之间荧光衰减的差异。
4. 成像后，将载玻片存放在 4 °C 的黑暗中，以便以后重新捕获图像。

结果

上述方法有助于使用荧光成像研究果 蝇 心脏，而无需繁琐的解剖。这是这种方法的主要好处，因为传统的心脏解剖方法需要发展复杂的运动技能。如图 1 所示，该方法对于新研究人员来说比心脏解剖更容易上手，并且允许实验灵活性。或者，在 OCT 模具阶段使用 -80 °C 储存，样品可以保存以备数周后使用。技术人员不需要经过足够长的培训?...

讨论

我们开发了一种有效的方案，用于准备果蝇心脏管，以便使用荧光或共聚焦成像进行可视化。在此之前，讨论了一种常用但耗时耗力的方法，用于访问和监测果蝇心脏的细胞学完整性。我们创新高效的方法通过利用直接冷冻包埋为传统方法提供了一种简洁高效的替代方案，从而保留了果蝇心脏管的结构完整性。在使用显微镜技术可视化果蝇解剖...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500