Metodo nuovo ed efficiente per la colorazione a fluorescenza cardiaca di Drosophila con criosezione

Riepilogo

Il protocollo di imaging a fluorescenza e sezionamento cardiaco di Drosophila semplifica lo studio della struttura e delle patologie cardiache. Questo approccio prevede il sezionamento, la colorazione e l'imaging semplici, bypassando le competenze tecniche necessarie per la dissezione tradizionale. Migliora l'accessibilità, rendendo la Drosophila un modello più ampiamente utilizzabile per la ricerca cardiaca all'interno della più ampia comunità scientifica.

Abstract

I modelli cardiaci di Drosophila sono ampiamente utilizzati nello studio dell'invecchiamento cardiaco e nella modellazione delle malattie cardiache umane. Tuttavia, la dissezione dei cuori di Drosophila prima dell'imaging è un processo meticoloso e dispendioso in termini di tempo che richiede un allenamento avanzato e capacità motorie. Per affrontare queste sfide, presentiamo un protocollo innovativo che utilizza la criosezione per l'imaging a fluorescenza del tessuto cardiaco di Drosophila. Il protocollo è stato dimostrato nell'imaging del cuore adulto di Drosophila, ma potrebbe essere adattato per le fasi di sviluppo. Il metodo migliora sia l'efficienza che l'accessibilità della colorazione a fluorescenza, preservando l'integrità del tessuto. Questo protocollo semplifica il processo senza compromettere la qualità dell'imaging, riducendo così la dipendenza da tecnici con formazione e capacità motorie altamente sviluppate. In particolare, sostituiamo tecniche complesse, come l'aspirazione capillare a vuoto, con metodi più semplici come l'inclusione dei tessuti. Questo approccio consente la visualizzazione delle strutture cardiache con maggiore facilità e riproducibilità. Dimostriamo l'utilità di questo protocollo rilevando efficacemente i principali marcatori cardiaci e ottenendo immagini a fluorescenza e immunocolorazione ad alta risoluzione che svelano dettagli intricati della morfologia cardiaca e dell'organizzazione cellulare. Questo metodo fornisce uno strumento robusto e accessibile per i ricercatori che esplorano la biologia cardiaca della Drosophila, facilitando analisi dettagliate dello sviluppo cardiaco, della funzione e dei modelli di malattia.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte a livello globale, responsabili di circa 17,9 milioni di decessi ogni anno, pari a quasi 1/^{3 di tutti} i decessi globali. Drosophila melanogaster (comunemente noto come moscerino della frutta) è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per studiare le basi genetiche, cellulari e molecolari dello sviluppo cardiaco, della fisiologia, del metabolismo, dell'invecchiamento e delle cardiomiopatie 1,2,3,4,5,6,7,8,9. I modelli di Drosophila sono stati utilizzati anche per studiare il ruolo del muscolo cardiaco nella regolazione sistemica dell'obesità¹⁰, un importante fattore di rischio per la morbilità e la mortalità cardiovascolare. Gli studi di sequenziamento del genoma di Drosophila ¹¹ hanno rivelato una significativa conservazione dei geni negli esseri umani, compresi quelli associati allo sviluppo di vari organi, incluso il cuore. Tra questi geni altamente conservati, alcuni sono coinvolti nella disfunzione cardiaca, come le cardiomiopatie o le canalopatie³. Il recente sviluppo di tecniche efficaci per studiare le prestazioni cardiache ha ampliato le applicazioni del modello per esplorare i cambiamenti a lungo termine nella fisiologia cardiaca degli adulti dovuti a fattori come l'esercizio fisico, la dieta e l'invecchiamento⁸. Tuttavia, le sfide tecniche e logistiche spesso ostacolano l'uso di questo sistema modello. Una sfida con l'uso di Drosophila negli studi cardiaci è una dissezione precisa del cuore in modo da preservare la citoarchitettura e gli elementi miocardici.

Il cuore di Drosophila o vaso dorsale è costituito da una struttura tubolare costituita da un singolo strato di cardiomiociti, cellule pericardiche posizionate lungo la parete cardiaca, sostenute da muscoli alari, e negli adulti, accompagnate da uno strato di cellula muscolare longitudinale ventrale¹². Una dissezione accurata per accedere a queste delicate strutture è un processo che richiede tempo e lavoro. Lo standard attuale prevede una dissezione tecnicamente impegnativa e l'aspirazione capillare a vuoto, che richiedono una formazione avanzata e capacità motorie 13,14,15,16. In genere, la dissezione inizia incidendo la parete ventrale del corpo e le sfide si presentano rapidamente con la minuziosa anatomia del cuore, la sua fragile struttura e la posizione dorsale di difficile accesso. Questo, combinato con le tecniche di dissezione tradizionali, consente un'analisi precisa della struttura e della funzione cardiaca, fornendo uno strumento migliorato per lo studio delle malattie cardiovascolari in Drosophila¹³. Ad esempio, utilizzando questo, Alayari et al. hanno fornito un protocollo per etichettare in fluorescenza le strutture cardiache di Drosophila, facilitando la visualizzazione della morfologia e della struttura cardiaca. Nonostante questi sforzi, la dissezione e la colorazione cardiaca tradizionali devono affrontare diverse sfide, tra cui la difficoltà di mantenere l'integrità dei tessuti e la formazione specializzata necessaria per un'efficace colorazione cardiaca.

Il metodo offre una soluzione innovativa a questo problema sostituendo l'intera procedura con un protocollo più semplice che utilizza la crioinclusione del torace e dell'addome di Drosophila , seguita da immunocolorazione e imaging a fluorescenza. Questo approccio di facile apprendimento garantisce una visualizzazione più rapida e semplice delle strutture cardiache con una maggiore riproducibilità. Inoltre, descriviamo un metodo semplice che coinvolge il ghiaccio secco che garantisce un allineamento uniforme della cuticola addominale di Drosophila sullo stesso piano z, semplificando la fase di criosezione a valle. Dimostriamo l'efficacia di questo protocollo nel rilevare importanti marcatori cardiaci, la morfologia cardiaca e l'organizzazione cellulare con l'immunofluorescenza e la microscopia confocale. La facilità e l'elevata efficacia di questo approccio sono particolarmente utili per gli studi cardiaci basati su Drosophila ad alto rendimento.

Protocollo

1. Preparazione dell'attrezzatura

1. Assicurarsi che il criostato sia acceso e impostato a -20 °C. Attendere che trascorra un tempo adeguato affinché la temperatura raggiunga questo punto. Se la macchina è a temperatura ambiente, il raffreddamento alla temperatura di taglio ottimale può richiedere circa 5 ore.
2. Accendere lo scaldavetrini o l'incubatrice, assicurandosi che sia impostato a 37 °C. Assicurarsi che i vetrini abbiano il tempo sufficiente per raggiungere la temperatura desiderata.
   NOTA: In questa fase, i vetrini etichettati possono essere posizionati sullo scaldavivande o sull'incubatrice e lasciati a tempo indeterminato fino al sezionamento.
3. Assicurarsi che il ghiaccio secco sia pronto per l'uso. Il ghiaccio può essere rimosso dallo stoccaggio a – 80 °C una volta raggiunto il passaggio 5.

2. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare 50 ml di PBS. Preparare 10 mL di acido tetraacetico glicole etheline 10 mM in PBS. Preparare una soluzione di Paraformaldeide al 4% in PBS dove il volume finale è pari a 100 μL volte il numero di gruppi sperimentali.
2. Preparare una soluzione detergente di etanolo al 70% in acqua in un flacone spray. Preparare tutte le soluzioni coloranti fluorescenti.
   NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire una semplice colorazione utilizzando semplici coloranti o coloranti fluorescenti. In questo caso, descriveremo l'uso di 1x falloidina 594 in un rapporto 1:250 in PBS. Le concentrazioni di coloranti fluorescenti variano a seconda del reagente e degli obiettivi sperimentali. Dovrebbero essere effettuati test preliminari per trovare la concentrazione appropriata. La colorazione degli anticorpi non sarà dettagliata qui, ma dovrebbe essere applicabile utilizzando i metodi di colorazione convenzionali.

3. Raccolta dei tessuti

1. Anestetizzare 5-10 mosche utilizzando un tappetino antimosche CO₂ e posizionare le mosche in vista al microscopio con un ingrandimento di 1x-2x. Il regolatore di CO₂ deve registrare tra 1 e 5 kPa sul tappetino di CO₂ .
   NOTA: Sono disponibili altri metodi per l'anestesia (ad esempio, FlyNap²) e questi metodi non influiscono in modo significativo sui risultati.
2. Usando le forbici a molla, decapitare, tagliare le ali e rimuovere le zampe da 5 a 10 mosche. Ciò che rimane è il torace e l'addome, insieme saranno indicati come il corpo.
   NOTA: Per allineare correttamente i corpi delle mosche nel passaggio 5, le lunghezze rimanenti delle ali o delle zampe non devono interferire con un allineamento piatto lungo la parte inferiore dello stampo. A tale scopo, aggancia le ali e le zampe il più vicino possibile al torace.
3. Usando un pennello, posizionare delicatamente i corpi in provette da 1,5 ml etichettate su ghiaccio fino a quando tutti i gruppi sperimentali non sono stati raccolti.

4. Fissazione dell'intero tessuto

1. Dopo aver rimosso le provette dal ghiaccio, aggiungere 100 μl di EGTA da 10 mM, pH 8, in ciascuna provetta per rilassare il tessuto cardiaco all'interno dell'addome. Assicurarsi che tutti i corpi siano immersi per 10 minuti e posizionati sull'agitatore orbitale. La centrifuga da tavolo può essere utilizzata per facilitare l'immersione dei corpi.
2. Rimuovere ed eliminare la soluzione nel tubo. Pipettare 100 μL di PBS in ciascuna provetta per lavare il tessuto per 10 minuti, posizionandolo sull'agitatore orbitale. Rimuovere e gettare allo scadere del tempo.
3. Pipettare 100 μl di paraformaldeide al 4% in soluzione PBS in ciascuna provetta. Assicurarsi che tutti i corpi siano immersi nella soluzione.
4. Porre su uno shaker orbitale per 15 minuti, impostando la velocità a circa 100 unità. Assicurarsi che l'impostazione non agiti i tessuti fuori dal contatto con la soluzione.
5. Trascorso questo tempo, scartare il PFA e sostituirlo con 1x PBS per 10 minuti, assicurandosi nuovamente che tutti i corpi siano a contatto con la soluzione. Rimettere i tubi nell'agitatore orbitale a una velocità simile a quella del passaggio 4.4 per ogni lavaggio rimanente.
6. Scartando ogni volta la soluzione precedente, lavare il fazzoletto con PBS 2x per 10 min ciascuno, per un totale di 3 lavaggi.
7. Dopo aver eliminato il lavaggio finale, trasferire i corpi in una soluzione di saccarosio al 10% in PBS, assicurandosi che entrino in contatto con la soluzione all'interno del tubo. Per una saturazione ottimale, lasciali durante la notte o abbastanza a lungo in modo che i corpi affondino sul fondo.
   NOTA: La crioprotezione notturna è preferibile, ma se è necessario l'imaging in giornata, attendere il più a lungo possibile affinché il crioprotettore si infiltri nel tessuto.

5. Preparazione dello stampo

1. A questo punto, recupera il ghiaccio secco dal deposito e seleziona alcuni pezzi da posizionare in un piccolo vassoio di metallo o plastica. Le dimensioni della teglia devono essere tali da poter inserire lo stampo, posizionandolo direttamente sopra un unico pezzo di ghiaccio secco, grande e preferibilmente piatto.
2. Riempire uno stampo etichettato per circa il 50% con il composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT). Cerca di ridurre l'introduzione di bolle lasciando che il composto scorra lentamente.
3. Usando un pennello, posizionare con cura i corpi sulla superficie dell'OCT all'interno dello stampo. Più gruppi sperimentali dovrebbero essere nettamente separati in questa fase.
   NOTA: È importante prevenire la diluizione del composto OCT attraverso la contaminazione con la soluzione di saccarosio da parte del pennello. Inoltre, il posizionamento in profondità nell'OCT utilizzando il pennello può creare molte bolle d'aria. Evita questi errori per evitare problemi di sezionamento in un secondo momento.
4. Usando una pinza, spingi ogni corpo sul fondo dello stampo con la parete dorsale del torace e dell'addome, generalmente lungo il fondo. Quindi, regola il corpo in modo che l'addome abbia la priorità di essere piatto lungo la parte inferiore dello stampo. Allinea tutti i corpi nelle dimensioni X, Y e Z in modo che ogni sezione contenga tutti i soggetti contemporaneamente.
5. Ci può essere una curvatura dell'addome, in particolare nei maschi; Appiattiscilo al meglio delle capacità del tecnico. Questo è essenziale per la raccolta di sezioni più lunghe nel piano coronale. Evitare di forare o schiacciare i corpi contro il fondo dello stampo durante questo processo. Lavora metodicamente per allineare correttamente ogni soggetto.
6. Una volta che tutti i soggetti sono a posto, prendi lo stampo e posiziona il fondo direttamente sopra un pezzo di ghiaccio secco. Controlla se l'OCT inizia a congelarsi dopo alcuni istanti dal contatto. Lasciare che continui fino a quando tutti i soggetti non sono avvolti nella parte congelata dello stampo.
7. Una volta raggiunta questa fase, trasferire lo stampo a -20 °C per congelare completamente. Riempire la parte rimanente dello stampo quando la prima porzione è completamente congelata. Gli stampi possono quindi essere conservati a -80 °C per un uso successivo avvolgendoli in un foglio di alluminio o tagliati immediatamente.
   NOTA: Evitare l'esposizione all'aria aperta a -20 °C e -80 °C tra le due fasi di congelamento. Ciò può causare lo sviluppo di umidità tra gli strati.

6. Criosezione di stampi

NOTA: In genere si consiglia di preparare e tagliare uno stampo vuoto prima di tagliare gli stampi del gruppo sperimentale. Questo ci permette di garantire la corretta funzionalità della ruota, della lama e del vetro antirollio immediatamente prima del sezionamento del tessuto. Inoltre, lasciare acclimatare gli stampi provenienti da una conservazione più fredda nel criostato per 30 minuti.

1. Fissare la punta del mandrino allo stampo applicando una generosa quantità di OCT al blocco e posizionando la punta sopra, premendola in piano. Lasciarlo congelare completamente nel criostato, di solito entro 5 minuti.
2. Rilasciare la punta e il blocco OCT dallo stampo e posizionarlo nel mandrino, assicurandosi che il blocco rimanga correttamente orientato dall'alto verso il basso. Serrare la chiave del mandrino finché la punta non è fissata.
3. Allineare il blocco con la lama utilizzando le manopole di regolazione e i controlli della profondità del mandrino. Impostare la larghezza della sezione su 20 μM o inferiore.
   NOTA: Le sezioni più sottili sono più desiderabili per aumentare il numero di possibili sezioni raccolte. Le prime 2-6 sezioni di ciascun soggetto dovrebbero contenere le porzioni desiderate del cuore non ostruite, che è una funzione dell'orientamento e della larghezza della sezione. Bisogna cercare di ottenere l'orientamento corretto del mandrino prima di tagliare le importanti 2-6 sezioni.
4. Taglia ogni fetta con un movimento lento ma costante, consentendo al vetro antirollio di catturare ogni fetta. Raccogli le sezioni utilizzando diapositive riscaldate. Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per almeno 30 minuti ma non più di 1 ora prima del primo ciclo di lavaggi.

7. Colorazione a fluorescenza

1. Subito dopo il periodo di asciugatura, rimuovere l'OCT in eccesso che circonda le sezioni utilizzando una lametta. Fare attenzione a evitare di incontrare il tessuto in questa fase. Se il vetrino deve essere macchiato in un secondo momento, conservarlo a -80 °C.
2. Delinea questo bordo su ogni diapositiva usando un pennarello idrofobo. Questo bordo servirà a mantenere le soluzioni di lavaggio e colorazione sul tessuto.
   NOTA: Questo protocollo descrive come eseguire la colorazione e il lavaggio utilizzando un metodo a pipetta, possono essere utilizzati anche secchi a slitta e rack. È sufficiente sostituire il pipettaggio delle soluzioni sulla parte superiore dei vetrini con l'immersione dei vetrini in ciascuna delle soluzioni fresche. Come abbiamo fatto di recente per l'imaging cerebrale¹⁷, una procedura di immunocolorazione può essere applicata anche alla colorazione cardiaca.
3. Lavare tutti i vetrini 3 volte per 5 minuti ciascuno con PBS pipettandoli delicatamente sulla parte superiore del vetrino, evitando di pipettare direttamente sulla parte superiore del tessuto quando possibile. Eseguire questa operazione utilizzando la pipetta da 1000 μl e i puntali associati. Cerca di non spruzzare rapidamente la soluzione in quanto ciò può causare il rilascio di tessuti dalla superficie del vetrino.
4. Scartare il lavaggio finale e pipettare la soluzione colorante a fluorescenza (1:250, 1x falloidina) sui fazzoletti. Lasciarlo incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
5. Dopo questo punto i soggetti sono sensibili alla luce. Eseguire tutti i passaggi successivi al buio o coprendo le diapositive. Eliminare la colorazione di fluorescenza e, utilizzando la pipetta da 1000 μl, lavare 3 volte per 5 minuti con PBS.

8. Montaggio e preparazione per l'imaging

1. Scartare il lavaggio finale, lasciando una piccola quantità di PBS sul vetrino. Pipettare 3-5 gocce di terreno di montaggio sul vetrino utilizzando la pipetta da 1000 μl, evitando il dispiegamento diretto sui tessuti.
2. Posizionare il vetrino coprioggetti sul vetrino in modo tale da ridurre al minimo la produzione di bolle d'aria. Per comodità, usa una pinza per posizionare il vetrino coprioggetti su un bordo e abbassa gradualmente l'altro lato fino a quando non è a filo con il vetrino. Maneggiare con cura le guide appena montate e conservarle in piano per almeno 24 ore a 4 °C.
3. Sigillare le diapositive con lo smalto per unghie o, se il supporto di montaggio si sta indurendo, evitarlo. Non utilizzare smalti per unghie contenenti neon o glitter. A seconda della colorazione fluorescente, eseguire immediatamente l'imaging o conservare i vetrini per un'acquisizione successiva.

9. Imaging

NOTA: Per l'acquisizione delle immagini è stato utilizzato un microscopio Olympus BX 63 con obiettivi 10x, 40x e 60x. Sono stati utilizzati anche i filtri appropriati per DAPI, Lipid Spot 488 e Phalloidin 594.

1. Prima dell'imaging, ispezionare i vetrini e pulirli con un panno e una soluzione acquosa di etanolo al 70%. Se le diapositive vengono visualizzate immediatamente dopo il montaggio, prestare particolare attenzione durante la pulizia per evitare di disturbare il vetrino coprioggetti.
2. Seleziona i tempi di esposizione corretti per ciascun canale in base ai soggetti fluorescenti più luminosi all'interno dell'esperimento complessivo. Evita la saturazione eccessiva generando un'immagine il più luminosa possibile e riducendo lo sfondo. Esamina rapidamente ogni gruppo sperimentale con una visualizzazione in tempo reale di ciascun canale per assicurarti che le esposizioni siano impostate in modo appropriato.
3. Concentrati su ogni argomento, utilizzando lo stesso canale su tutti i soggetti per coerenza. Quindi, cattura ogni soggetto. Cattura tutti i gruppi sperimentali utilizzati per il confronto nello stesso giorno per evitare differenze nel decadimento fluorescente tra i gruppi confrontati.
4. Dopo l'imaging, conservare i vetrini al buio a 4 °C per una successiva acquisizione dell'immagine.

Risultati

Il metodo sopra descritto facilita lo studio del cuore di Drosophila utilizzando l'imaging a fluorescenza senza noiosa dissezione. Questo è il principale vantaggio di questo metodo, poiché il metodo convenzionale di dissezione cardiaca richiede lo sviluppo di capacità motorie complesse. Illustrato nella Figura 1, il metodo è più accessibile rispetto alla dissezione cardiaca per i nuovi ricercatori e consente la flessibilità dell'esperimento. I...

Discussione

Abbiamo sviluppato un protocollo efficiente per la preparazione di un tubo cardiaco di Drosophila per la visualizzazione mediante imaging fluorescente o confocale. Questo è preceduto da una discussione su un metodo comunemente usato ma che richiede tempo e lavoro per accedere e monitorare l'integrità citologica del cuore di Drosophila. Il nostro metodo innovativo ed efficiente offre un'alternativa concisa ed efficiente agli approcci tradizionali utilizzando la crioinc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500