Método novo e eficiente para coloração de fluorescência cardíaca de Drosophila com crioseccionamento

Resumo

O protocolo de corte cardíaco e imagem de fluorescência da Drosophila simplifica o estudo da estrutura e patologias do coração. Essa abordagem envolve seccionamento, coloração e imagem simples, ignorando o conhecimento técnico necessário para a dissecção tradicional. Aumenta a acessibilidade, tornando a Drosophila um modelo mais amplamente utilizável para pesquisas cardíacas dentro da comunidade científica mais ampla.

Resumo

Os modelos cardíacos de Drosophila são amplamente empregados no estudo do envelhecimento cardíaco e na modelagem de doenças cardíacas humanas. No entanto, a dissecção dos corações de Drosophila antes da imagem é um processo meticuloso e demorado que requer treinamento avançado e habilidades motoras. Para enfrentar esses desafios, apresentamos um protocolo inovador que utiliza criosseccionamento para a imagem de fluorescência do tecido cardíaco de Drosophila . O protocolo foi demonstrado em imagens do coração adulto de Drosophila , mas pode ser adaptado para estágios de desenvolvimento. O método aumenta a eficiência e a acessibilidade da coloração de fluorescência, preservando a integridade do tecido. Este protocolo simplifica o processo sem comprometer a qualidade da imagem, reduzindo assim a dependência de técnicos com treinamento e habilidades motoras altamente desenvolvidos. Especificamente, substituímos técnicas complexas, como a sucção capilar a vácuo, por métodos mais diretos, como a incorporação de tecidos. Essa abordagem permite a visualização das estruturas cardíacas com maior facilidade e reprodutibilidade. Demonstramos a utilidade deste protocolo detectando efetivamente os principais marcadores cardíacos e obtendo imagens de fluorescência e imunocoloração de alta resolução que revelam detalhes intrincados da morfologia do coração e da organização celular. Este método fornece uma ferramenta robusta e acessível para pesquisadores que exploram a biologia cardíaca da Drosophila , facilitando análises detalhadas do desenvolvimento, função e modelos de doenças do coração.

Introdução

As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte em todo o mundo, responsáveis por aproximadamente 17,9 milhões de mortes a cada ano, representando quase 1/^{3 de todas} as mortes globais. A Drosophila melanogaster (comumente conhecida como mosca-da-fruta) tem sido amplamente utilizada como organismo modelo para estudar as bases genéticas, celulares e moleculares do desenvolvimento cardíaco, fisiologia, metabolismo, envelhecimento e cardiomiopatias 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Modelos de Drosophila também têm sido usados para estudar o papel do músculo cardíaco na regulação sistêmica da obesidade¹⁰, um importante fator de risco para morbidade e mortalidade cardiovascular. Estudos de sequenciamento do genoma de Drosophila ¹¹ revelaram conservação significativa de genes em humanos, incluindo aqueles associados ao desenvolvimento de vários órgãos, incluindo o coração. Dentre esses genes altamente conservados, alguns estão envolvidos em disfunções cardíacas, como cardiomiopatias ou canalopatias³. O recente desenvolvimento de técnicas eficazes para estudar o desempenho cardíaco expandiu as aplicações do modelo para explorar mudanças de longo prazo na fisiologia cardíaca adulta devido a fatores como exercício, dieta e envelhecimento⁸. No entanto, desafios técnicos e logísticos muitas vezes dificultam o uso desse sistema modelo. Um desafio com o uso de Drosophila em estudos cardíacos é uma dissecção precisa do coração de uma maneira que preserve a citoarquitetura e os elementos miocárdicos.

O coração da Drosophila ou vaso dorsal consiste em uma estrutura tubular composta por uma única camada de cardiomiócitos, células pericárdicas posicionadas ao longo da parede do coração, sustentadas por músculos alários e, em adultos, acompanhadas por uma camada de células musculares longitudinais ventrais¹². A dissecção precisa para acessar essas estruturas delicadas é um processo demorado e trabalhoso. O padrão atual envolve dissecção tecnicamente desafiadora e aspiração capilar a vácuo, exigindo treinamento avançado e habilidades motoras 13,14,15,16. Normalmente, a dissecção começa com a incisão da parede ventral do corpo, e os desafios se apresentam rapidamente com a anatomia minuciosa do coração, sua estrutura frágil e localização dorsal de difícil acesso. Isso, combinado com as técnicas tradicionais de dissecação, permite uma análise precisa da estrutura e função do coração, fornecendo uma ferramenta aprimorada para o estudo de doenças cardiovasculares em Drosophila¹³. Por exemplo, usando isso, Alayari et al. forneceram um protocolo para marcar fluorescentemente as estruturas cardíacas de Drosophila, facilitando a visualização da morfologia e estrutura cardíaca. Apesar desses esforços, a dissecção e coloração cardíaca tradicionais enfrentam vários desafios, incluindo a dificuldade de manter a integridade do tecido e o treinamento especializado necessário para uma coloração cardíaca eficaz.

O método oferece uma solução inovadora para esse problema, substituindo todo o procedimento por um protocolo mais simples que utiliza crioincorporação de tórax e abdômen de Drosophila , seguido de imunocoloração e imagem de fluorescência. Essa abordagem fácil de aprender garante uma visualização mais rápida e direta das estruturas cardíacas com maior reprodutibilidade. Além disso, descrevemos um método simples envolvendo gelo seco que garante o alinhamento uniforme da cutícula abdominal da Drosophila no mesmo plano z, simplificando a etapa de criossecção a jusante. Demonstramos a eficácia deste protocolo na detecção de marcadores cardíacos importantes, morfologia cardíaca e organização celular com microscopia imunofluorescente e confocal. A facilidade e a alta eficácia dessa abordagem são particularmente úteis para estudos cardíacos baseados em Drosophila de alto rendimento.

Protocolo

1. Preparação do equipamento

1. Certifique-se de que o criostato esteja ligado e ajustado para -20 °C. Aguarde o tempo adequado para que a temperatura atinja esse ponto. Se a máquina estiver à temperatura ambiente, o resfriamento até a temperatura ideal de corte pode levar cerca de 5 horas.
2. Ligue o aquecedor de lâminas ou a incubadora, certificando-se de que esteja ajustado para 37 °C. Certifique-se de que as lâminas tenham tempo suficiente para atingir a temperatura desejada.
   NOTA: Nesta fase, as lâminas rotuladas podem ser colocadas no aquecedor ou incubadora e deixadas indefinidamente até o seccionamento.
3. Certifique-se de que o gelo seco esteja pronto para uso. O gelo pode ser removido do armazenamento a – 80 °C uma vez atingida a etapa 5.

2. Preparação de soluções

1. Prepare 50 mL de PBS. Prepare 10 mL de ácido tetracético Ethelyne glicol 10 mM em PBS. Prepare uma solução de paraformaldeído a 4% em PBS, onde o volume final é igual a 100 μL vezes o número de grupos experimentais.
2. Prepare uma solução de limpeza de etanol a 70% em água em um borrifador. Prepare todas as soluções de coloração fluorescente.
   NOTA: Este protocolo detalhará como realizar uma coloração simples usando manchas ou corantes fluorescentes simples. Neste caso, descreveremos o uso de 1x Faloidina 594 na proporção de 1:250 em PBS. As concentrações de corantes fluorescentes variam dependendo do reagente e dos objetivos experimentais. Testes preliminares devem ser feitos para encontrar a concentração apropriada. A coloração de anticorpos não será detalhada aqui, mas deve ser aplicável usando métodos convencionais de coloração.

3. Coleta de tecido

1. Anestesiar 5-10 moscas usando um tapete de mosca CO₂ e posicionar as moscas à vista sob o microscópio com ampliação de 1x-2x. O regulador de CO₂ deve registrar entre 1 e 5 kPa na esteira de CO₂ .
   NOTA: Outros métodos de anestesia estão disponíveis (por exemplo, FlyNap²) e esses métodos não afetam significativamente os resultados.
2. Usando uma tesoura de mola, decapite, corte as asas e remova as pernas de 5 a 10 moscas. O que resta é o tórax e o abdômen, juntos serão chamados de corpo.
   NOTA: Para alinhar os corpos das moscas adequadamente na etapa 5, quaisquer comprimentos restantes de asa ou perna não devem interferir em um alinhamento plano ao longo da parte inferior do molde. Faça isso cortando as asas e as pernas o mais próximo possível do tórax.
3. Usando um pincel, coloque suavemente os corpos em tubos rotulados de 1,5 mL no gelo até que todos os grupos experimentais tenham sido coletados.

4. Fixação de tecido total

1. Depois de remover os tubos do gelo, adicione 100 μL de 10 mM EGTA, pH 8, em cada tubo para relaxar o tecido cardíaco dentro do abdômen. Certifique-se de que todos os corpos estejam submersos por 10 minutos e colocados no agitador orbital. A centrífuga de mesa pode ser usada para facilitar a submersão dos corpos.
2. Remova e descarte a solução no tubo. Pipetar 100 μL de PBS em cada tubo para lavar o tecido por 10 min, colocando no agitador orbital. Remova e descarte após o tempo ter decorrido.
3. Pipetar 100 μL de paraformaldeído a 4% em solução de PBS em cada tubo. Certifique-se de que todos os corpos estejam submersos na solução.
4. Coloque em um agitador orbital por 15 min, ajustando a velocidade para cerca de 100 unidades. Certifique-se de que a configuração não agite os tecidos fora do contato com a solução.
5. Após esse tempo, descarte o PFA e substitua-o por 1x PBS por 10 min, garantindo novamente que todos os corpos estejam entrando em contato com a solução. Retorne os tubos ao agitador orbital a uma velocidade semelhante à da etapa 4.4 para cada lavagem restante.
6. Descartando a solução anterior a cada vez, lave o lenço com PBS 2x por 10 min cada, totalizando 3 lavagens.
7. Após a lavagem final ser descartada, transfira os corpos para uma sacarose a 10% em solução de PBS, garantindo que eles entrem em contato com a solução dentro do tubo. Para uma saturação ideal, deixe-os durante a noite ou por tempo suficiente para que os corpos afundem.
   NOTA: A crioproteção noturna é preferida, mas se for necessária uma imagem no mesmo dia, aguarde o maior tempo possível para que o crioprotetor se infiltre no tecido.

5. Preparação do molde

1. Neste ponto, retire o gelo seco do armazenamento e selecione algumas peças para colocar em uma pequena bandeja de metal ou plástico. As dimensões da bandeja devem ser tais que o molde possa ser inserido, colocando-o diretamente em cima de um único pedaço de gelo seco grande e, de preferência, plano.
2. Preencha um molde rotulado aproximadamente 50% com composto de temperatura de corte ideal (OCT). Tente reduzir a introdução de bolhas deixando o composto fluir lentamente.
3. Usando um pincel, coloque cuidadosamente os corpos na superfície da OCT dentro do molde. Vários grupos experimentais devem ser separados distintamente nesta fase.
   NOTA: É importante evitar a diluição do composto OCT através da contaminação com a solução de sacarose pela escova. Além disso, a colocação profunda na OCT usando o pincel pode criar muitas bolhas de ar. Evite esses erros para evitar problemas de seccionamento posteriormente.
4. Usando uma pinça, empurre cada corpo para o fundo do molde com a parede dorsal do tórax e do abdômen, geralmente ao longo da parte inferior. Em seguida, ajuste o corpo de forma que o abdômen seja priorizado como plano ao longo da parte inferior do molde. Alinhe todos os corpos nas dimensões X, Y e Z de modo que cada seção contenha todos os assuntos simultaneamente.
5. Pode haver uma curvatura do abdômen, principalmente nos machos; Achate isso da melhor maneira possível do técnico. Isso é essencial para que seções mais longas sejam coletadas no plano coronal. Evite perfurar ou esmagar os corpos contra o fundo do molde durante este processo. Trabalhe metodicamente para alinhar cada assunto corretamente.
6. Quando todos os assuntos estiverem no lugar, pegue o molde e coloque o fundo diretamente em cima de um pedaço de gelo seco. Verifique se a OCT começa a congelar após alguns momentos após o contato. Deixe isso continuar até que todos os assuntos estejam envolvidos na parte congelada do molde.
7. Quando este estágio for atingido, transfira o molde para -20 °C para congelar completamente. Preencha a parte restante do molde quando a primeira porção estiver completamente congelada. Os moldes podem então ser armazenados a -80 °C para uso posterior, envolvendo-os em papel alumínio ou cortados imediatamente.
   NOTA: Evite a exposição aberta ao ar a -20 °C e -80 °C entre os dois estágios de congelamento. Isso pode causar o desenvolvimento de umidade entre as camadas.

6. Crioseccionamento de moldes

NOTA: Geralmente, é aconselhável preparar e cortar um molde em branco antes de cortar os moldes experimentais do grupo. Isso nos permite garantir a funcionalidade adequada da roda, lâmina e vidro anti-rolamento imediatamente antes de seccionar o tecido. Além disso, permita que quaisquer moldes provenientes de armazenamento mais frio se aclimatem no criostato por 30 min.

1. Prenda a broca do mandril ao molde aplicando uma quantidade generosa de OCT no bloco e colocando a broca por cima, pressionando-a plana. Deixe congelar completamente no criostato, geralmente dentro de 5 min.
2. Solte a broca e o bloco OCT do molde e coloque-o no mandril, garantindo que o bloco permaneça devidamente orientado de cima para baixo. Aperte a chave do mandril até que a broca esteja segura.
3. Alinhe o bloco com a lâmina usando os botões de ajuste e os controles de profundidade do mandril. Defina a largura da seção para 20 μM ou menos.
   NOTA: Seções mais finas são mais desejáveis para aumentar o número de seções possíveis coletadas. As primeiras 2-6 seções de cada sujeito devem conter as partes desobstruídas desejadas do coração, que é uma função da orientação e da largura da seção. Deve-se tentar obter a orientação correta do mandril antes de cortar as importantes 2-6 seções.
4. Corte cada fatia usando movimentos lentos, mas consistentes, permitindo que o vidro anti-rolo capture cada fatia. Colete seções usando slides aquecidos. Deixe as lâminas secarem em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos, mas não mais do que 1 hora antes da primeira rodada de lavagens.

7. Coloração de fluorescência

1. Imediatamente após o período de secagem, remova o excesso de OCT ao redor das seções usando uma lâmina de barbear. Tenha cuidado para evitar encontrar o tecido nesta fase. Se a lâmina for destinada a ser corada posteriormente, armazene-a a -80 °C.
2. Contorne essa borda em cada slide usando um marcador hidrofóbico. Essa borda servirá para manter as soluções de lavagem e coloração no tecido.
   NOTA: Este protocolo descreve como realizar a coloração e lavagem usando um método de pipeta, baldes deslizantes e racks também podem ser usados. Basta substituir a pipetagem de soluções em cima das lâminas pela submersão das lâminas em cada uma das soluções novas. Como fizemos recentemente para imagens cerebrais¹⁷, um procedimento de imunocoloração também pode ser aplicado à coloração cardíaca.
3. Lave todas as lâminas 3x por 5 min cada com PBS pipetando suavemente em cima da lâmina, evitando pipetar diretamente em cima do tecido quando possível. Faça isso usando a pipeta de 1000 μL e pontas associadas. Tente não jatear rapidamente a solução, pois isso pode fazer com que os tecidos se soltem da superfície da lâmina.
4. Descarte a lavagem final e pipete a solução de coloração de fluorescência (1:250, 1x Faloidina) nos tecidos. Deixe incubar por 1 h em temperatura ambiente no escuro.
5. Após este ponto, os assuntos são sensíveis à luz. Execute todas as etapas subsequentes no escuro ou cobrindo os slides. Descarte a mancha de fluorescência e, usando a pipeta de 1000 μL, lave 3x por 5 min com PBS.

8. Montagem e preparação para imagem

1. Descarte a lavagem final, deixando uma pequena quantidade de PBS na lâmina. Pipete 3-5 gotas de mídia de montagem na lâmina usando a pipeta de 1000 μL, evitando a implantação direta no tecido.
2. Coloque a lamínula na lâmina de forma que a produção de bolhas de ar seja minimizada. Para facilitar, use uma pinça para colocar a lamínula em uma borda e abaixe gradualmente o outro lado até que esteja nivelado com a lâmina. Manuseie as lâminas recém-montadas com cuidado e guarde-as planas por pelo menos 24 h a 4 °C.
3. Sele as lâminas usando esmalte ou, se a mídia de montagem estiver endurecendo, evite isso. Esmaltes contendo neon ou glitter não devem ser usados. Dependendo da coloração fluorescente, execute a imagem imediatamente ou armazene as lâminas que podem ser armazenadas para captura posterior.

9. Imagem

NOTA: Um microscópio Olympus BX 63 com lentes de 10x, 40x e 60x foi usado para captura de imagem. Os filtros apropriados para DAPI, Lipid Spot 488 e Phalloidin 594 também foram usados.

1. Antes de fazer a imagem, inspecione as lâminas e limpe-as com um lenço de papel e etanol a 70% em solução aquosa. Se as lâminas forem fotografadas imediatamente após a montagem, tome cuidado extra ao limpar para evitar perturbar a lamínula.
2. Selecione os tempos de exposição adequados para cada canal com base nos assuntos fluorescentes mais brilhantes dentro do experimento geral. Evite a supersaturação enquanto gera uma imagem o mais brilhante possível e reduz o fundo. Pesquise rapidamente cada grupo experimental com uma visualização ao vivo de cada canal para garantir que as exposições sejam definidas adequadamente.
3. Concentre-se em cada assunto, usando o mesmo canal em todos os assuntos para consistência. Em seguida, capture cada assunto. Capturar todos os grupos experimentais usados para comparação no mesmo dia para evitar diferenças no decaimento fluorescente entre os grupos comparados.
4. Após a obtenção de imagens, armazene as lâminas no escuro a 4 °C para posterior recaptura da imagem.

Resultados

O método descrito acima facilita o estudo do coração da Drosophila usando imagens de fluorescência sem dissecção tediosa. Este é o principal benefício deste método, pois o método convencional de dissecção cardíaca requer o desenvolvimento de habilidades motoras complexas. Ilustrado na Figura 1, o método é mais acessível do que a dissecção cardíaca para novos pesquisadores e permite flexibilidade de experimentos. Alternativamente, ...

Discussão

Desenvolvemos um protocolo eficiente para preparar um tubo cardíaco de Drosophila para visualização usando imagens fluorescentes ou confocais. Isso é precedido por uma discussão de um método comumente usado, mas demorado e trabalhoso, para acessar e monitorar a integridade citológica do coração de Drosophila. Nosso método inovador e eficiente oferece uma alternativa concisa e eficiente às abordagens tradicionais, utilizando a crioincorporação direta, que pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500