Kriyoseksiyon ile Drosophila Kalp Floresan Boyama için Yeni ve Etkili Yöntem

Özet

Drosophila kalp kesiti ve floresan görüntüleme protokolü, kalp yapısını ve patolojilerini incelemeyi basitleştirir. Bu yaklaşım, geleneksel diseksiyon için gereken teknik uzmanlığı atlayarak basit kesit alma, boyama ve görüntülemeyi içerir. Erişilebilirliği artırarak Drosophila'yı daha geniş bilimsel topluluk içinde kardiyak ile ilgili araştırmalar için daha yaygın olarak kullanılabilir bir model haline getirir.

Özet

Drosophila kalp modelleri, kardiyak yaşlanmanın incelenmesinde ve insan kalp hastalıklarının modellenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, görüntülemeden önce Drosophila kalplerinin diseksiyonu, ileri eğitim ve motor beceriler gerektiren titiz, zaman alan bir süreçtir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, Drosophila kalp dokusunun floresan görüntülemesi için kriyoseksiyonu kullanan yenilikçi bir protokol sunuyoruz. Protokol, yetişkin Drosophila kalbinin görüntülenmesinde gösterilmiştir, ancak gelişim aşamaları için uyarlanabilir. Yöntem, dokunun bütünlüğünü korurken floresan boyamanın hem verimliliğini hem de erişilebilirliğini artırır. Bu protokol, görüntüleme kalitesinden ödün vermeden süreci basitleştirir, böylece son derece gelişmiş eğitim ve motor becerilere sahip teknisyenlere olan bağımlılığı azaltır. Özellikle, kılcal vakumlu emme gibi karmaşık teknikleri doku gömme gibi daha basit yöntemlerle değiştiriyoruz. Bu yaklaşım, kardiyak yapıların daha kolay ve tekrarlanabilir bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Bu protokolün faydasını, temel kardiyak belirteçleri etkili bir şekilde tespit ederek ve kalp morfolojisi ve hücresel organizasyonun karmaşık ayrıntılarını ortaya çıkaran yüksek çözünürlüklü floresan ve immün boyama görüntülemesi elde ederek gösteriyoruz. Bu yöntem, Drosophila kardiyak biyolojisini araştıran araştırmacılar için sağlam ve erişilebilir bir araç sağlayarak kalp gelişimi, işlevi ve hastalık modellerinin ayrıntılı analizlerini kolaylaştırır.

Giriş

Kardiyovasküler hastalık (KVH), küresel olarak önde gelen ölüm nedenidir ve her yıl yaklaşık 17,9 milyon ölümden sorumludur ve tüm küresel ölümlerin yaklaşık 1/^3'ünü oluşturmaktadır. Drosophila melanogaster (yaygın olarak meyve sineği olarak bilinir), kardiyak gelişim, fizyoloji, metabolizma, yaşlanma ve kardiyomiyopatilerin^genetik, hücresel ve moleküler temelini incelemek için model bir organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Drosophila modelleri, kardiyovasküler morbidite ve mortalite için önemli bir risk faktörü olan obezitenin¹⁰ sistemik regülasyonunda kalp kasının rolünü incelemek için de kullanılmıştır. Drosophila genom dizileme çalışmaları¹¹, kalp de dahil olmak üzere çeşitli organların gelişmesiyle ilişkili olanlar da dahil olmak üzere insanlarda genlerin önemli ölçüde korunduğunu ortaya koymuştur. Bu yüksek oranda korunmuş genler arasında, bazıları kardiyomiyopatiler veya kanalopatiler gibi kardiyak disfonksiyonda rol oynar³. Kardiyak performansı incelemek için etkili tekniklerin son zamanlarda geliştirilmesi, egzersiz, diyet ve yaşlanma gibi faktörlere bağlı olarak yetişkin kardiyak fizyolojisindeki uzun vadeli değişiklikleri keşfetmek için modelin uygulamalarını genişletmiştir⁸. Bununla birlikte, teknik ve lojistik zorluklar genellikle bu model sistemin kullanımını engellemektedir. Drosophila'yı kardiyak çalışmalarda kullanmanın bir zorluğu, kalbin sitomimariyi ve miyokard elemanlarını koruyacak şekilde hassas bir şekilde diseksiyonudur.

Drosophila kalbi veya sırt damarı, tek bir kardiyomiyosit tabakasından, kalp duvarı boyunca konumlandırılmış, alary kasları tarafından desteklenen perikardiyal hücrelerden ve yetişkinlerde bir ventral longitudinal kas hücresi tabakasının eşlik ettiği tüp benzeri bir yapıdan oluşur¹². Bu hassas yapılara erişmek için doğru diseksiyon zaman ve emek yoğun bir süreçtir. Mevcut standart, ileri eğitim ve motor beceriler^{gerektiren teknik} olarak zorlu diseksiyon ve kılcal vakum aspirasyonunu içerir 13,14,15,16. Tipik olarak, diseksiyon ventral vücut duvarının kesilmesiyle başlar ve kalbin en küçük anatomisi, kırılgan yapısı ve erişilmesi zor sırt yerleşimi ile zorluklar hızlı bir şekilde kendini gösterir. Bu, geleneksel diseksiyon teknikleriyle birleştiğinde, kalp yapısının ve fonksiyonunun hassas bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır ve Drosophila^13'teki kardiyovasküler hastalıkları incelemek için gelişmiş bir araç sağlar. Örneğin, bunu kullanarak, Alayari ve ark. Drosophila kalp yapılarını floresan olarak etiketlemek için bir protokol sağladı ve kardiyak morfoloji ve yapının görselleştirilmesini kolaylaştırdı. Bu çabalara rağmen, geleneksel kalp diseksiyonu ve boyama, doku bütünlüğünü korumanın zorluğu ve etkili kalp boyama için gereken özel eğitim dahil olmak üzere çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır.

Yöntem, tüm prosedürü Drosophila toraks ve karnın kriyoembedmesini ve ardından immün boyama ve floresan görüntülemeyi kullanan daha basit bir protokolle değiştirerek bu soruna yenilikçi bir çözüm sunar. Bu öğrenmesi kolay yaklaşım, kardiyak yapıların daha fazla tekrarlanabilirlik ile daha hızlı ve daha basit bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Ek olarak, Drosophila abdominal kütikülünün aynı z-düzlemi üzerinde düzgün bir şekilde hizalanmasını sağlayan kuru buz içeren basit bir yöntemi açıklıyoruz ve kriyoseksiyon adımını aşağı akışta düzene sokuyoruz. Bu protokolün önemli kardiyak belirteçleri, kalp morfolojisini ve hücresel organizasyonu immünofloresan ve konfokal mikroskopi ile tespit etmedeki etkinliğini gösteriyoruz. Bu yaklaşımın kolaylığı ve yüksek etkinliği, yüksek verimli Drosophila bazlı kardiyak çalışmalar için özellikle yararlıdır.

Protokol

1. Ekipmanın hazırlanması

1. Kriyostatın açık olduğundan ve -20 °C'ye ayarlandığından emin olun. Sıcaklığın bu noktaya ulaşması için yeterli zamanın geçmesine izin verin. Makine ortam sıcaklığındaysa, optimum kesme sıcaklığına soğutma yaklaşık 5 saat sürebilir.
2. Sürgülü ısıtıcıyı veya inkübatörü açın ve 37 °C'ye ayarlandığından emin olun. Slaytların istenen sıcaklığa ulaşmak için yeterli zamana sahip olduğundan emin olun.
   NOT: Bu aşamada, etiketli slaytlar ısıtıcı veya inkübatör üzerine yerleştirilebilir ve bölümlere ayrılana kadar süresiz olarak bırakılabilir.
3. Kuru buzun kullanıma hazır olduğundan emin olun. Buz, 5. adıma ulaşıldığında – 80 °C'de depodan çıkarılabilir.

2. Çözeltilerin hazırlanması

1. 50 mL PBS hazırlayın. PBS'de 10 mL 10 mM Ethelyne glikol tetraasetik asit hazırlayın. PBS'de% 4'lük bir Paraformaldehit çözeltisi hazırlayın, burada nihai hacim deney grubu sayısının 100 μL'sine eşittir.
2. Bir sprey şişesinde su içinde% 70 etanol içeren bir temizleme solüsyonu hazırlayın. Tüm floresan boyama solüsyonlarını hazırlayın.
   NOT: Bu protokol, basit floresan boyalar veya boyalar kullanarak basit boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini detaylandıracaktır. Bu durumda, PBS'de 1:250 oranında 1x Phalloidin 594 kullanımını açıklayacağız. Floresan leke konsantrasyonları, reaktife ve deneysel hedeflere bağlı olarak değişecektir. Uygun konsantrasyonu bulmak için ön test yapılmalıdır. Antikor boyaması burada detaylandırılmayacaktır, ancak geleneksel boyama yöntemleri kullanılarak uygulanabilir olmalıdır.

3. Doku toplanması

1. CO₂ sinek matı kullanarak 5-10 sineği uyuşturun ve sinekleri mikroskop altında 1x-2x büyütmede görüş alanına yerleştirin. CO 2 regülatörü, CO_{2 matına} 1 ila 5 kPa arasında kayıt yapmalıdır.
   NOT: Anestezi için başka yöntemler de mevcuttur (örneğin, FlyNap²) ve bu yöntemler sonuçları önemli ölçüde etkilemez.
2. Yaylı makas kullanarak kafasını kesin, kanatları kırpın ve bacakları 5 ila 10 sinekten çıkarın. Geriye kalan göğüs kafesi ve karındır, birlikte vücut olarak anılacaktır.
   NOT: 5. adımda sinek gövdelerini uygun şekilde hizalamak için, kalan kanat veya bacak uzunlukları, kalıbın alt kısmı boyunca düz bir hizalamaya müdahale etmemelidir. Bunu, kanatları ve bacakları göğüs kafesine mümkün olduğunca yakın kırparak gerçekleştirin.
3. Bir fırça kullanarak, tüm deney grupları toplanana kadar gövdeleri buz üzerindeki etiketli 1,5 mL'lik tüplere nazikçe yerleştirin.

4. Tüm dokunun fiksasyonu

1. Tüpleri buzdan çıkardıktan sonra, karın içindeki kalp dokusunu rahatlatmak için her tüpe 100 μL 10 mM EGTA, pH 8 ekleyin. Tüm cisimlerin 10 dakika boyunca suya batırıldığından ve yörünge çalkalayıcıya yerleştirildiğinden emin olun. Masa üstü santrifüj, gövdelerin suya daldırılmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir.
2. Tüpteki çözeltiyi çıkarın ve atın. Dokuyu 10 dakika boyunca yıkamak için her tüpe 100 μL PBS pipetleyin ve orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Süre geçtikten sonra çıkarın ve atın.
3. Her tüpe PBS çözeltisinde 100 μL% 4 Paraformaldehit pipetleyin. Tüm cisimlerin çözeltiye batırıldığından emin olun.
4. Hızı yaklaşık 100 birime ayarlayarak 15 dakika boyunca bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin. Ayarın dokuları solüsyonla teması dışında çalkalamadığından emin olun.
5. Bu süre geçtikten sonra, PFA'yı atın ve 1 dakika boyunca 10x PBS ile değiştirin, tekrar tüm gövdelerin çözelti ile temas ettiğinden emin olun. Tüpleri, kalan her yıkama için adım 4.4'teki ile benzer bir hızda orbital çalkalayıcıya geri koyun.
6. Her seferinde önceki solüsyonu atarak, mendili PBS 2x ile her biri 10 dakika, toplam 3 yıkama için yıkayın.
7. Son yıkama atıldıktan sonra, gövdeleri PBS çözeltisinde% 10'luk bir sükroza aktarın ve tüp içindeki çözelti ile temas ettiklerinden emin olun. Optimum doygunluk için, onları gece boyunca veya vücutlar dibe batacak şekilde yeterince uzun süre bırakın.
   NOT: Gece boyunca kriyoproteksiyon tercih edilir, ancak aynı gün görüntüleme gerekliyse, kriyoprotektanın dokuya sızması için mümkün olduğunca uzun bir süre bekleyin.

5. Kalıp hazırlama

1. Bu noktada, kuru buzu depodan alın ve küçük bir metal veya plastik tepsiye yerleştirmek için birkaç parça seçin. Tepsinin boyutları, kalıbın yerleştirilebileceği ve doğrudan tek, büyük ve tercihen düz bir kuru buz parçasının üzerine yerleştirilebileceği şekilde olmalıdır.
2. Etiketli bir kalıbı yaklaşık% 50 oranında Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun. Bileşiğin yavaşça akmasına izin vererek kabarcıkların girişini azaltmaya çalışın.
3. Bir fırça kullanarak, gövdeleri kalıbın içindeki OCT yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Bu aşamada birden fazla deney grubu belirgin bir şekilde ayrılmalıdır.
   NOT: OCT bileşiğinin fırça ile sakaroz çözeltisi ile kontaminasyon yoluyla seyreltilmesini önlemek önemlidir. Ek olarak, fırçayı kullanarak OCT'nin derinliklerine yerleştirmek birçok hava kabarcığı oluşturabilir. Daha sonra bölümleme sorunlarını önlemek için bu hatalardan kaçının.
4. Forseps kullanarak, her bir gövdeyi, genellikle alt kısım boyunca, göğüs ve karın bölgesinin sırt duvarı ile kalıbın dibine doğru itin. Ardından, gövdeyi, karın kalıbın alt kısmı boyunca düz olacak şekilde önceliklendirilecek şekilde ayarlayın. X, Y ve Z boyutlarındaki tüm gövdeleri, her bölüm tüm konuları aynı anda içerecek şekilde hizalayın.
5. Özellikle erkeklerde karın bölgesinde eğrilik olabilir; Bunu teknisyenin elinden gelen en iyi şekilde düzleştirin. Bu, koronal düzlemde daha uzun bölümlerin toplanması için gereklidir. Bu işlem sırasında gövdeleri kalıbın dibine doğru delmekten veya ezmekten kaçının. Her konuyu doğru şekilde hizalamak için metodik olarak çalışın.
6. Tüm denekler yerine oturduktan sonra, kalıbı alın ve alt kısmı doğrudan bir parça kuru buzun üzerine yerleştirin. Temastan birkaç dakika sonra OCT'nin donmaya başlayıp başlamadığını kontrol edin. Bunun, tüm denekler kalıbın donmuş kısmına sarılana kadar devam etmesine izin verin.
7. Bu aşamaya ulaşıldığında, kalıbı tamamen dondurmak için -20 °C'ye aktarın. İlk kısım tamamen donduğunda kalıbın kalan kısmını doldurun. Kalıplar daha sonra alüminyum folyoya sarılarak veya hemen kesilerek daha sonra kullanılmak üzere -80 °C'de saklanabilir.
   NOT: İki dondurma aşaması arasında -20 °C ve -80 °C'de havaya açıkta maruz kalmaktan kaçının. Bu, katmanlar arasında nem oluşmasına neden olabilir.

6. Kalıpların kriyopeksiyonu

NOT: Deney grubu kalıpları kesmeden önce genellikle boş bir kalıp hazırlanması ve kesilmesi tavsiye edilir. Bu, dokuyu bölmeden hemen önce tekerlek, bıçak ve yuvarlanma önleyici camın düzgün çalışmasını sağlamamızı sağlar. Ek olarak, daha soğuk depodan gelen küflerin 30 dakika boyunca kriyostatta alışmasına izin verin.

1. Bloğa bol miktarda OCT uygulayarak ve ucu üstüne yerleştirerek ve düz bir şekilde bastırarak ayna ucunu kalıba takın. Bunun kriyostatta, genellikle 5 dakika içinde tamamen donmasına izin verin.
2. Ucu ve OCT bloğunu kalıptan çıkarın ve bloğun yukarıdan aşağıya doğru düzgün bir şekilde yönlendirildiğinden emin olarak aynaya yerleştirin. Uç sabitlenene kadar mandren anahtarını sıkın.
3. Ayar düğmelerini ve ayna derinliği kontrollerini kullanarak bloğu bıçakla hizalayın. Kesit genişliğini 20 μM veya daha düşük bir değere ayarlayın.
   NOT: Toplanan olası bölümlerin sayısını artırmak için daha ince bölümler daha çok tercih edilir. Her deneğin ilk 2-6 bölümü, oryantasyon ve kesit genişliğinin bir fonksiyonu olan kalbin istenen engelsiz kısımlarını içermelidir. Önemli 2-6 bölümü kesmeden önce aynanın yönünü doğru bir şekilde elde etmeye çalışmalısınız.
4. Her dilimi yavaş ama tutarlı bir hareketle kesin ve rulo önleyici camın her dilimi yakalamasına izin verin. Isıtılmış slaytları kullanarak bölümleri toplayın. Slaytların oda sıcaklığında en az 30 dakika, ancak ilk yıkama turundan en fazla 1 saat önce kurumasına izin verin.

7. Floresan boyama

1. Kuruma süresinin hemen ardından, bir tıraş bıçağı kullanarak bölümleri çevreleyen fazla OCT'yi çıkarın. Bu aşamada doku ile karşılaşmamaya dikkat edin. Slaytın daha sonraki bir zaman noktasında lekelenmesi amaçlanıyorsa, bunları -80 °C'de saklayın.
2. Hidrofobik bir işaretleyici kullanarak her slaytta bu kenarlığın ana hatlarını çizin. Bu sınır, doku üzerinde yıkama ve leke solüsyonlarının tutulmasına hizmet edecektir.
   NOT: Bu protokol, bir pipet yöntemi kullanılarak boyama ve yıkamanın nasıl yapılacağını ana hatlarıyla belirtir, sürgülü kovalar ve raflar da kullanılabilir. Slaytların üzerine çözeltilerin pipetlenmesini, slaytların her bir taze çözeltiye daldırılmasıyla değiştirin. Son zamanlarda beyin görüntüleme¹⁷ için yaptığımız gibi, kardiyak boyamaya da bir immün boyama prosedürü uygulanabilir.
3. Tüm slaytları 3 kez 5 dakika boyunca PBS ile slaytın üzerine nazikçe pipetleyerek yıkayın ve mümkünse doğrudan dokunun üzerine pipetlemekten kaçının. Bunu 1000 μL'lik pipeti ve ilgili uçları kullanarak gerçekleştirin. Solüsyonu hızlı bir şekilde püskürtmemeye çalışın, çünkü bu, dokuların slaytın yüzeyinden ayrılmasına neden olabilir.
4. Son yıkamayı atın ve floresan leke solüsyonunu (1:250, 1x Phalloidin) dokulara pipetleyin. Bunun karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe etmesine izin verin.
5. Bu noktadan sonra nesneler ışığa duyarlıdır. Sonraki tüm adımları karanlıkta veya slaytları kapatarak gerçekleştirin. Floresan lekesini atın ve 1000 μL'lik pipeti kullanarak 3 kez PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın.

8. Görüntüleme için montaj ve hazırlık

1. Slaytta az miktarda PBS bırakarak son yıkamayı atın. 1000 μL'lik pipeti kullanarak slayta 3-5 damla montaj ortamı pipetleyin ve doku üzerine doğrudan yerleştirmeyi önleyin.
2. Lameli slaytın üzerine, hava kabarcığı oluşumu en aza indirilecek şekilde yerleştirin. Kolaylık sağlamak için, lamel bir kenara yerleştirmek için forseps kullanın ve diğer tarafı sürgü ile aynı hizaya gelene kadar kademeli olarak indirin. Yeni monte edilmiş kızakları dikkatli tutun ve 24 °C'de en az 4 saat düz bir şekilde saklayın.
3. Slaytları oje kullanarak kapatın veya montaj ortamı sertleşiyorsa bundan kaçının. Neon ya da sim içeren oje kullanılmamalıdır. Floresan lekesine bağlı olarak, hemen görüntüleme yapın veya slaytları daha sonra yakalamak üzere saklayın.

9. Görüntüleme

NOT: Görüntü yakalama için 10x, 40x ve 60x lensli bir Olympus BX 63 mikroskobu kullanılmıştır. DAPI, Lipid Spot 488 ve Phalloidin 594 için uygun filtreler de kullanıldı.

1. Görüntülemeden önce, slaytları inceleyin ve bir mendil ve su solüsyonunda %70 etanol kullanarak temizleyin. Montajdan hemen sonra slaytlar görüntülenirse, lamel bozulmasını önlemek için temizlerken ekstra özen gösterin.
2. Genel deneydeki en parlak floresan nesnelere dayalı olarak her kanal için uygun pozlama sürelerini seçin. Mümkün olduğunca parlak bir görüntü oluştururken ve arka planı azaltırken aşırı doygunluktan kaçının. Pozlamaların uygun şekilde ayarlandığından emin olmak için her kanalın canlı görüntüsüyle her deney grubunu hızlı bir şekilde araştırın.
3. Tutarlılık için tüm konularda aynı kanalı kullanarak her konuya odaklanın. Ardından, her konuyu yakalayın. Karşılaştırılan gruplar arasındaki floresan bozunması farklılıklarını önlemek için karşılaştırma için kullanılan tüm deney gruplarını aynı gün yakalayın.
4. Görüntülemeden sonra, daha sonra görüntüyü yeniden yakalamak için slaytları karanlıkta 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan yöntem, sıkıcı diseksiyon olmadan floresan görüntüleme kullanarak Drosophila kalbinin incelenmesini kolaylaştırır. Geleneksel kalp diseksiyonu yöntemi karmaşık motor becerilerin geliştirilmesini gerektirdiğinden, bu yöntemin ana yararı budur. Şekil 1'de gösterildiği gibi, yöntem yeni araştırmacılar için kalp diseksiyonundan daha ulaşılabilir ve deney esnekliğine izin veriyor. Alternatif olarak, OCT k...

Tartışmalar

Floresan veya konfokal görüntüleme kullanarak görselleştirme için bir Drosophila kalp tüpü hazırlamak için etkili bir protokol geliştirdik. Bundan önce, Drosophila kalbinin sitolojik bütünlüğüne erişmek ve izlemek için yaygın olarak kullanılan, ancak zaman ve emek yoğun bir yöntemin tartışılması ile devam edilir. Yenilikçi ve verimli yöntemimiz, Drosophila kalp tüpünün yapısal bütünlüğünü koruyan doğrudan kriyo-gömme kul...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500