Новый и эффективный метод флуоресцентного окрашивания сердца дрозофилы с криосекцией

Резюме

Протокол секции сердца дрозофилы и флуоресцентной визуализации упрощает изучение структуры сердца и патологий. Этот подход включает в себя простое срезирование, окрашивание и визуализацию, минуя технические знания, необходимые для традиционного препарирования. Это повышает доступность, делая дрозофилу более широко используемой моделью для исследований, связанных с кардиологией, в более широком научном сообществе.

Аннотация

Модели сердца дрозофилы широко используются для изучения старения сердца и моделирования сердечных заболеваний человека. Тем не менее, вскрытие сердец дрозофилы перед визуализацией является кропотливым и трудоемким процессом, требующим продвинутой подготовки и двигательных навыков. Для решения этих проблем мы представляем инновационный протокол, который использует криосекцию для флуоресцентной визуализации сердечной ткани дрозофилы . Протокол был продемонстрирован при визуализации сердца взрослой дрозофилы , но может быть адаптирован для стадий развития. Метод повышает как эффективность, так и доступность флуоресцентного окрашивания при сохранении целостности ткани. Этот протокол упрощает процесс без ущерба для качества визуализации, тем самым снижая зависимость от техников с высокоразвитой подготовкой и двигательными навыками. В частности, мы заменяем сложные методы, такие как капиллярная вакуумная аспирация, более простыми методами, такими как встраивание тканей. Такой подход позволяет визуализировать сердечные структуры с большей легкостью и воспроизводимостью. Мы демонстрируем полезность этого протокола, эффективно обнаруживая ключевые сердечные маркеры и достигая флуоресцентной и иммуноокрашивающей визуализации с высоким разрешением, которая раскрывает сложные детали морфологии сердца и клеточной организации. Этот метод предоставляет надежный и доступный инструмент для исследователей, изучающих кардиобиологию дрозофилы , способствуя детальному анализу развития, функции и моделей заболеваний сердца.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире, ежегодно унося около 17,9 миллиона смертей, что составляет почти 1/3 всех случаев смерти в мире. Drosophila melanogaster (широко известная как плодовая муха) широко используется в качестве модельного организма для изучения генетических, клеточных и молекулярных основ развития сердца, физиологии, обмена веществ, старения и кардиомиопатий ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}. Модели дрозофил также использовались для изучения роли сердечной мышцы в системной регуляции ожирения10, основного фактора риска сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности. Исследования секвенирования генома дрозофилы ¹¹ выявили значительную сохранность генов у человека, в том числе связанных с развитием различных органов, в том числе сердца. Среди этих высококонсервативных генов некоторые участвуют в сердечной дисфункции, такие как кардиомиопатии или каналопатии^. Недавнее развитие эффективных методов изучения сердечной деятельности расширило возможности применения модели для изучения долгосрочных изменений в физиологии сердца взрослого человека, вызванных такими факторами, как физические упражнения, диета и старение^. Однако технические и логистические проблемы часто препятствуют использованию этой модельной системы. Одной из проблем при использовании дрозофилы в кардиологических исследованиях является точное препарирование сердца таким образом, чтобы сохранить цитоархитегерию и элементы миокарда.

Сердце дрозофилы или дорсальный сосуд состоит из трубчатой структуры, состоящей из одного слоя кардиомиоцитов, перикардиальных клеток, расположенных вдоль стенки сердца, поддерживаемых алярными мышцами, а у взрослых — сопровождаемых слоем вентральных продольных мышечных клеток¹². Точное рассечение для доступа к этим деликатным структурам является трудоемким и трудоемким процессом. Текущий стандарт включает в себя технически сложную диссекцию и капиллярную вакуумную аспирацию, требующую продвинутой подготовки и двигательных навыков 13,14,15,16. Как правило, вскрытие начинается с разреза вентральной стенки тела, и проблемы быстро проявляются из-за мельчайшей анатомии сердца, его хрупкой структуры и труднодоступного дорсального расположения. В сочетании с традиционными методами вскрытия это позволяет проводить точный анализ структуры и функции сердца, обеспечивая улучшенный инструмент для изучения сердечно-сосудистых заболеваний у дрозофил¹³. Например, используя это, Alayari et al. разработали протокол флуоресцентного мечения сердечных структур дрозофилы, облегчающий визуализацию морфологии и структуры сердца. Несмотря на эти усилия, традиционное рассечение сердца и окрашивание сталкиваются с рядом проблем, включая сложность поддержания целостности тканей и специализированную подготовку, необходимую для эффективного окрашивания сердца.

Метод предлагает инновационное решение этой проблемы путем замены всей процедуры более простым протоколом, в котором используется криовстраивание грудной клетки и брюшной полости дрозофилы с последующим иммуноокрашиванием и флуоресцентной визуализацией. Этот простой в освоении подход обеспечивает более быструю и прямую визуализацию сердечных структур с большей воспроизводимостью. Кроме того, мы описываем простой метод с использованием сухого льда, который обеспечивает равномерное выравнивание кутикулы живота дрозофилы на одной и той же z-плоскости, оптимизируя этап криосекции вниз по потоку. Мы демонстрируем эффективность этого протокола в выявлении важных сердечных маркеров, морфологии сердца и клеточной организации с помощью иммунофлуоресцентной, а также конфокальной микроскопии. Простота и высокая эффективность этого подхода особенно полезны для высокопроизводительных кардиологических исследований на основе дрозофилы.

протокол

1. Подготовка оборудования

1. Убедитесь, что криостат включен и установлен на -20 °C. Подождите, пока пройдет достаточное время, чтобы температура достигла этого уровня. Если машина имеет температуру окружающей среды, охлаждение до оптимальной температуры резки может занять около 5 часов.
2. Включите подогреватель слайдов или инкубатор, установив его температуру на 37 °C. Следите за тем, чтобы горки успели нагреться до нужной температуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе промаркированные предметные стекла можно поместить на обогреватель или инкубатор и оставить на неопределенный срок до разделения.
3. Убедитесь, что сухой лед готов к использованию. Лед может быть извлечен из хранилища при температуре -80 °C после достижения шага 5.

2. Приготовление растворов

1. Приготовьте 50 мл PBS. Приготовьте 10 мл 10 мМ тетрауксусной кислоты этлингликоля в PBS. Приготовьте раствор 4% параформальдегида в PBS, где конечный объем равен 100 мкл числа экспериментальных групп.
2. Приготовьте чистящий раствор 70% этанола в воде в пульверизаторе. Приготовьте все растворы для флуоресцентного окрашивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе подробно описано, как выполнять простое окрашивание с использованием простых флуоресцентных красителей или красителей. В данном случае мы опишем применение 1х Фаллоидина 594 в соотношении 1:250 в PBS. Концентрация флуоресцентного красителя будет варьироваться в зависимости от реагента и целей эксперимента. Следует провести предварительное тестирование, чтобы найти подходящую концентрацию. Окрашивание антителами не будет подробно описано здесь, но должно быть применимо при использовании обычных методов окрашивания.

3. Забор ткани

1. Обезболите 5-10 мух с помощью коврика от мух CO₂ и расположите мух в пределах видимости под микроскопом с увеличением 1x-2x. Регулятор CO₂ должен регистрировать давление от 1 до 5 кПа на мат CO₂ .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют и другие методы обезболивания (например, FlyNap²), и эти методы не оказывают существенного влияния на результаты.
2. С помощью пружинных ножниц обезглавить, обрезать крылья, а также убрать ноги от 5 до 10 мух. То, что остается, это грудная клетка и брюшная полость, вместе которые будут называться телом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильного выравнивания корпусов мух на шаге 5 любые оставшиеся длины крыльев или ног не должны мешать выравниванию по ровной поверхности нижней части формы. Для этого подрежьте крылья и ноги как можно ближе к грудной клетке.
3. С помощью щетки аккуратно поместите тела в пробирки объемом 1,5 мл на льду, пока не будут собраны все экспериментальные группы.

4. Фиксация всей ткани

1. После извлечения трубок изо льда добавьте 100 мкл 10 мл 10 мМ EGTA, pH 8, в каждую трубку, чтобы расслабить сердечную ткань в брюшной полости. Убедитесь, что все тела погружены в воду на 10 минут и помещены на орбитальный вибростенд. Настольная центрифуга может использоваться для облегчения погружения тел в воду.
2. Извлеките и слейте раствор в пробирку. Пипеткой по 100 мкл PBS в каждую пробирку промыть салфетку в течение 10 мин, поместив на орбитальный шейкер. По истечении времени извлеките и выбросьте.
3. Пипетка 100 мкл 4% параформальдегида в растворе PBS в каждую пробирку. Убедитесь, что все тела погружены в раствор.
4. Поместите на орбитальный шейкер на 15 минут, установив скорость около 100 единиц. Следите за тем, чтобы установка не возбуждала ткани, находящиеся вне контакта с раствором.
5. По истечении этого времени выбросьте PFA и замените его на 1x PBS на 10 минут, снова убедившись, что все тела контактируют с раствором. Возвращайте пробирки в орбитальный шейкер с той же скоростью, что и в шаге 4.4, для каждой оставшейся промывки.
6. Каждый раз отбрасывая предыдущий раствор, промойте салфетку PBS 2x по 10 минут каждая, всего 3 стирки.
7. После того, как окончательная промывка будет отброшена, переложите тела в 10% раствор сахарозы в PBS, следя за тем, чтобы они контактировали с раствором внутри трубки. Для оптимального насыщения оставьте их на ночь или достаточно долго, чтобы тела опустились на дно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительна ночная криозащита, но если необходима визуализация в тот же день, дайте как можно больше времени для проникновения криопротектора в ткань.

5. Подготовка формы

1. На этом этапе достаньте сухой лед из хранилища и выберите несколько кусочков для помещения в небольшой металлический или пластиковый лоток. Размеры лотка должны быть такими, чтобы форму можно было вставить, поместив ее прямо поверх одного, большого, а лучше плоского, куска сухого льда.
2. Заполните этикетированную форму примерно на 50% составом для оптимальной температуры резки (OCT). Постарайтесь уменьшить появление пузырьков, давая составу течь медленно.
3. С помощью щетки аккуратно поместите тела на поверхность ОКТ внутри формы. На этом этапе несколько экспериментальных групп должны быть четко разделены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно предотвратить разведение соединения ОКТ из-за загрязнения раствором сахарозы щеткой. Кроме того, при введении глубоко в ОКТ с помощью щетки может образоваться множество пузырьков воздуха. Избегайте этих ошибок, чтобы предотвратить проблемы с секционированием в дальнейшем.
4. С помощью щипцов прижмите каждое тело ко дну формы со спинной стенкой грудной клетки и брюшной полости, как правило, вдоль дна. Затем отрегулируйте тело таким образом, чтобы живот имел приоритет как плоский вдоль дна формы. Выровняйте все тела в размерах X, Y и Z таким образом, чтобы каждый раздел содержал все объекты одновременно.
5. Может наблюдаться искривление брюшной полости, особенно у мужчин; Выровняйте это в меру своих возможностей. Это важно для сбора более длинных срезов в корональной плоскости. Избегайте прокола или раздавливания тел о дно формы во время этого процесса. Работайте методично, чтобы правильно выровнять каждый объект.
6. Как только все предметы будут на своих местах, возьмите форму и положите дно прямо поверх куска сухого льда. Проверьте, не начинает ли ОКТ замерзать через несколько секунд после контакта. Продолжайте до тех пор, пока все предметы не будут обернуты в замороженную часть формы.
7. Как только эта стадия будет достигнута, перенесите форму при температуре -20 °C, чтобы она замерзла по всей поверхности. Заполните оставшуюся часть формы, когда первая часть полностью застынет. Затем формы можно хранить при температуре -80 °C для последующего использования, завернув их в алюминиевую фольгу или сразу же разрезав.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте открытого контакта с воздухом при температуре -20 °C и -80 °C между двумя стадиями замерзания. Это может привести к образованию влаги между слоями.

6. Криосекция форм

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, рекомендуется подготовить и вырезать заготовку формы перед резкой экспериментальных групповых форм. Это позволяет нам обеспечить надлежащую функциональность колеса, лезвия и стекла с защитой от скручивания непосредственно перед разделкой ткани. Кроме того, дайте любым формам, поступающим из более холодного хранения, акклиматизироваться в криостате в течение 30 минут.

1. Прикрепите биту патрона к форме, нанеся обильное количество OCT на блок и поместив биту сверху, прижав ее плашмя. Дайте ему полностью застыть в криостате, обычно в течение 5 минут.
2. Извлеките биту и блок OCT из формы и поместите его в патрон, убедившись, что блок остается правильно ориентированным сверху вниз. Затяните ключ патрона до упора.
3. Совместите блок с лезвием с помощью ручек регулировки и регуляторов глубины патрона. Установите ширину сечения равной 20 μМ или ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более тонкие срезы более желательны для увеличения количества возможных собираемых срезов. Первые 2-6 участков каждого участка должны содержать желаемые свободные участки сердца, которые зависят от ориентации и ширины участка. Нужно постараться правильно ориентировать патрон перед резкой важных 2-6 секций.
4. Разрежьте каждый ломтик медленным, но последовательным движением, позволяя стеклу с защитой от перекатов захватить каждый кусочек. Собирайте секции с помощью подогретых горок. Дайте предметным стеклам высохнуть при комнатной температуре не менее 30 минут, но не более чем за 1 час до первого цикла стирки.

7. Флуоресцентное окрашивание

1. Сразу после высыхания удалите излишки ОКТ вокруг участков с помощью лезвия бритвы. Будьте осторожны, чтобы не столкнуться с тканью на этом этапе. Если предметное стекло предполагается окрашивать позже, храните его при температуре -80 °C.
2. Обведите эту границу на каждом слайде с помощью гидрофобного маркера. Эта граница будет служить для удержания растворов для стирки и пятен на ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе описывается, как выполнять окрашивание и промывку с помощью пипетки, также можно использовать ведра и штативы. Просто замените пипетирование растворов поверх предметных стекол на погружение предметных стекол в каждый из свежих растворов. Как мы недавно сделали для визуализации мозга¹⁷, процедура иммуноокрашивания может быть применена и к окрашиванию сердца.
3. Промойте все предметные стекла 3 раза в течение 5 минут каждый с помощью PBS, аккуратно пипетируя верхнюю часть предметного стекла, по возможности избегая пипетирования непосредственно поверх ткани. Выполните это с помощью пипетки объемом 1000 мкл и связанных с ней наконечников. Старайтесь не выделять раствор быстро, так как это может привести к высвобождению тканей с поверхности предметного стекла.
4. Выбросьте средства для стирки и нанесите пипеткой раствор флуоресцентного пятила (1:250, 1x Phalloidin) на салфетки. Дайте ему поинкубироваться в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
5. После этого момента объекты становятся светочувствительными. Выполняйте все последующие действия в темное время суток или накрыв горки. Выбросьте флуоресцентное пятно и с помощью пипетки объемом 1000 мкл промойте 3 раза в течение 5 минут PBS.

8. Монтаж и подготовка к визуализации

1. Выбросьте окончательную смывку, оставив небольшое количество PBS на предметном стекле. Пипеткой нанесите 3-5 капель монтажного материала на предметное стекло с помощью пипетки объемом 1000 μл, избегая прямого размещения на ткани.
2. Поместите покровное стекло на предметное стекло таким образом, чтобы образование пузырьков воздуха было сведено к минимуму. Для удобства используйте щипцы, чтобы поместить покровную заслонку на один край и постепенно опускайте другую сторону, пока она не окажется на одном уровне со слайдом. Осторожно обращайтесь со свежеустановленными предметными стеклами и храните их в горизонтальном положении не менее 24 часов при температуре 4 °C.
3. Заклейте слайды лаком для ногтей, или, если монтажный материал затвердевает, избегайте этого. Лак для ногтей, содержащий неон или блестки, использовать не стоит. В зависимости от флуоресцентного пятна выполните визуализацию немедленно или сохраните слайды для последующего захвата.

9. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений использовался микроскоп Olympus BX 63 с объективами 10x, 40x и 60x. Также использовались соответствующие фильтры для DAPI, липидного пятна 488 и фаллоидина 594.

1. Перед визуализацией осмотрите предметные стекла и очистите их с помощью салфетки и 70% этанола в водном растворе. Если слайды отображаются сразу после монтажа, будьте особенно осторожны при очистке, чтобы не повредить покровное стекло.
2. Выберите правильное время экспозиции для каждого канала в зависимости от самых ярких флуоресцентных объектов в рамках всего эксперимента. Избегайте перенасыщения при создании как можно более яркого изображения и уменьшении фона. Быстро осмотрите каждую экспериментальную группу с помощью просмотра каждого канала в режиме реального времени, чтобы убедиться, что экспозиция настроена правильно.
3. Сосредоточьтесь на каждой теме, используя один и тот же канал для всех тем для согласованности. Затем запечатлейте каждый объект. Захватите все экспериментальные группы, используемые для сравнения, в один и тот же день, чтобы избежать различий в флуоресцентном распаде между сравниваемыми группами.
4. После получения изображения храните слайды в темноте при температуре 4 °C для последующей повторной съемки.

Результаты

Описанный выше метод облегчает изучение сердца дрозофилы с помощью флуоресцентной визуализации без утомительного вскрытия. В этом и заключается основное преимущество данного метода, так как обычный метод рассечения сердца требует развития сложных двигательны...

Обсуждение

Мы разработали эффективный протокол подготовки сердечной трубки дрозофилы к визуализации с помощью флуоресцентной или конфокальной визуализации. Этому предшествует обсуждение широко используемого, но трудоемкого и трудоемкого метода доступа и мониторинга ци...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500