Neuartige und effiziente Methode zur Fluoreszenzfärbung von Drosophila-Herzen mit Kryosektion

Zusammenfassung

Das Drosophila-Protokoll für Herzschnitte und Fluoreszenzbildgebung vereinfacht die Untersuchung von Herzstrukturen und -pathologien. Dieser Ansatz beinhaltet einfaches Schneiden, Färben und Imaging, wobei das technische Know-how, das für die herkömmliche Dissektion erforderlich ist, umgangen wird. Es verbessert die Zugänglichkeit und macht Drosophila zu einem breiter nutzbaren Modell für die kardiale Forschung in der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft.

Zusammenfassung

Drosophila-Herzmodelle werden häufig bei der Untersuchung der Herzalterung und der Modellierung menschlicher Herzerkrankungen eingesetzt. Das Sezieren von Drosophila-Herzen vor der Bildgebung ist jedoch ein akribischer, zeitintensiver Prozess, der fortgeschrittenes Training und motorische Fähigkeiten erfordert. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, stellen wir ein innovatives Protokoll vor, das Kryosektionen für die Fluoreszenzbildgebung von Drosophila-Herzgewebe verwendet. Das Protokoll wurde bei der Bildgebung des erwachsenen Drosophila-Herzens demonstriert, könnte aber für Entwicklungsstadien angepasst werden. Die Methode verbessert sowohl die Effizienz als auch die Zugänglichkeit der Fluoreszenzfärbung bei gleichzeitiger Wahrung der Integrität des Gewebes. Dieses Protokoll vereinfacht den Prozess, ohne die Qualität der Bildgebung zu beeinträchtigen, und verringert so die Abhängigkeit von Technikern mit hochentwickelter Ausbildung und motorischen Fähigkeiten. Konkret ersetzen wir komplexe Techniken, wie z.B. die Kapillarvakuumabsaugung, durch einfachere Methoden wie die Gewebeeinbettung. Dieser Ansatz ermöglicht es, kardiale Strukturen einfacher und reproduzierbarer zu visualisieren. Wir demonstrieren die Nützlichkeit dieses Protokolls, indem wir wichtige kardiale Marker effektiv erkennen und eine hochauflösende Fluoreszenz- und Immunfärbebildgebung erzielen, die komplizierte Details der Herzmorphologie und zellulären Organisation enthüllt. Diese Methode bietet Forschern, die die Herzbiologie von Drosophila erforschen, ein robustes und zugängliches Werkzeug, das detaillierte Analysen der Entwicklung, Funktion und Krankheitsmodelle des Herzens ermöglicht.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sind weltweit die häufigste Todesursache und jedes Jahr für etwa 17,9 Millionen Todesfälle verantwortlich, was fast 1/^{3 aller} Todesfälle weltweit ausmacht. Drosophila melanogaster (allgemein bekannt als Fruchtfliege) wurde häufig als Modellorganismus für die Untersuchung der genetischen, zellulären und molekularen Grundlagen der kardialen Entwicklung, Physiologie, des Stoffwechsels, des Alterns und der Kardiomyopathien verwendet 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Drosophila-Modelle wurden auch verwendet, um die Rolle des Herzmuskels bei der systemischen Regulation von Fettleibigkeit^{zu untersuchen 10}, einem Hauptrisikofaktor für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität. Studien zur Genomsequenzierung von Drosophila ¹¹ haben eine signifikante Konservierung von Genen beim Menschen gezeigt, einschließlich solcher, die mit der Entwicklung verschiedener Organe, einschließlich des Herzens, verbunden sind. Unter diesen hochkonservierten Genen sind einige an kardialen Funktionsstörungen beteiligt, wie z. B. Kardiomyopathien oder Kanalopathien³. Die jüngste Entwicklung effektiver Techniken zur Untersuchung der Herzleistung hat die Anwendungen des Modells erweitert, um langfristige Veränderungen in der Herzphysiologie von Erwachsenen aufgrund von Faktoren wie Bewegung, Ernährung und Alterung zu untersuchen⁸. Technische und logistische Herausforderungen behindern den Einsatz dieses Modellsystems jedoch oft. Eine Herausforderung bei der Verwendung von Drosophila in kardiologischen Studien ist eine präzise Dissektion des Herzens, bei der die Zytoarchitektur und die Myokardelemente erhalten bleiben.

Das Drosophila-Herz oder das dorsale Gefäß besteht aus einer röhrenartigen Struktur, die aus einer einzigen Schicht von Kardiomyozyten besteht, Perikardzellen, die entlang der Herzwand positioniert sind und von Alary-Muskeln gestützt werden, und bei Erwachsenen, begleitet von einer Schicht ventraler Längsmuskelzelle¹². Das genaue Präparieren für den Zugang zu diesen empfindlichen Strukturen ist ein zeit- und arbeitsintensiver Prozess. Die derzeitige Norm beinhaltet technisch anspruchsvolle Dissektion und Kapillarvakuumabsaugung, die eine fortgeschrittene Ausbildung und motorische Fähigkeiten erfordert 13,14,15,16. In der Regel beginnt die Dissektion mit dem Einschneiden der ventralen Körperwand, und die Herausforderungen stellen sich schnell dar, wenn man die winzige Anatomie des Herzens, seine fragile Struktur und die schwer zugängliche dorsale Lage berücksichtigt. In Kombination mit traditionellen Präpariertechniken ermöglicht dies eine präzise Analyse der Herzstruktur und -funktion und bietet ein verbessertes Werkzeug für die Untersuchung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei Drosophila¹³. Auf diese Weise stellten Alayari et al. beispielsweise ein Protokoll für die fluoreszierende Markierung von Drosophila-Herzstrukturen zur Verfügung, das die Visualisierung der Herzmorphologie und -struktur erleichtert. Trotz dieser Bemühungen steht die traditionelle Herzdissektion und -färbung vor mehreren Herausforderungen, darunter die Schwierigkeit, die Gewebeintegrität zu erhalten, und die spezielle Ausbildung, die für eine effektive Herzfärbung erforderlich ist.

Die Methode bietet eine innovative Lösung für dieses Problem, indem sie das gesamte Verfahren durch ein einfacheres Protokoll ersetzt, das die Kryoeinbettung von Drosophila , Thorax und Abdomen verwendet, gefolgt von Immunfärbung und Fluoreszenzbildgebung. Dieser leicht zu erlernende Ansatz sorgt für eine schnellere und einfachere Visualisierung von Herzstrukturen mit höherer Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus beschreiben wir eine einfache Methode mit Trockeneis, die eine gleichmäßige Ausrichtung der abdominalen Nagelhaut von Drosophila auf derselben Z-Ebene gewährleistet und so den Kryosektionsschritt stromabwärts rationalisiert. Wir demonstrieren die Wirksamkeit dieses Protokolls bei der Detektion wichtiger kardialer Marker, der Herzmorphologie und der zellulären Organisation mit Immunfluoreszenz sowie konfokaler Mikroskopie. Die Einfachheit und hohe Wirksamkeit dieses Ansatzes ist besonders hilfreich für Hochdurchsatz-Drosophila-basierte Herzstudien.

Protokoll

1. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Stellen Sie sicher, dass der Kryostat eingeschaltet und auf -20 °C eingestellt ist. Lassen Sie ausreichend Zeit verstreichen, bis die Temperatur diesen Punkt erreicht hat. Wenn die Maschine bei Umgebungstemperatur ist, kann das Abkühlen auf die optimale Schnitttemperatur etwa 5 Stunden dauern.
2. Schalten Sie den Objektträgerwärmer oder -inkubator ein und stellen Sie sicher, dass er auf 37 °C eingestellt ist. Stellen Sie sicher, dass die Objektträger genügend Zeit haben, um die gewünschte Temperatur zu erreichen.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können beschriftete Objektträger auf den Wärmer oder Inkubator gelegt und auf unbestimmte Zeit bis zum Schneiden belassen werden.
3. Stellen Sie sicher, dass das Trockeneis einsatzbereit ist. Das Eis kann bei – 80 °C aus dem Lager entnommen werden, sobald Schritt 5 erreicht ist.

2. Vorbereitung der Lösungen

1. Bereiten Sie 50 ml PBS vor. Bereiten Sie 10 ml 10 mM Ethelynglykoltetraessigsäure in PBS vor. Bereiten Sie eine Lösung von 4 % Paraformaldehyd in PBS vor, wobei das Endvolumen 100 μl mal der Anzahl der Versuchsgruppen entspricht.
2. Bereiten Sie eine Reinigungslösung aus 70% Ethanol in Wasser in einer Sprühflasche vor. Bereiten Sie alle fluoreszierenden Färbelösungen vor.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird detailliert beschrieben, wie eine einfache Färbung mit einfachen fluoreszierenden Färbungen oder Farbstoffen durchgeführt wird. In diesem Fall beschreiben wir die Verwendung von 1x Phalloidin 594 im Verhältnis 1:250 in PBS. Die Konzentrationen der Fluoreszenzfärbung variieren je nach Reagenz und experimentellen Zielen. Es sollten Voruntersuchungen durchgeführt werden, um die geeignete Konzentration zu finden. Die Antikörperfärbung soll hier nicht näher erläutert werden, sollte aber mit herkömmlichen Färbemethoden anwendbar sein.

3. Entnahme von Gewebe

1. Betäuben Sie 5-10 Fliegen mit einer CO₂ -Fliegenmatte und positionieren Sie die Fliegen unter dem Mikroskop bei 1x-2-facher Vergrößerung in Sichtweite. Der CO₂ -Regler sollte zwischen 1 und 5 kPa an der CO₂ -Matte registrieren.
   HINWEIS: Es stehen auch andere Methoden zur Anästhesie zur Verfügung (z. B. FlyNap²), die die Ergebnisse nicht wesentlich beeinflussen.
2. Enthaupten Sie mit einer Federschere, schneiden Sie die Flügel ab und entfernen Sie die Beine von 5 bis 10 Fliegen. Was übrig bleibt, sind der Brustkorb und der Bauch, zusammen werden sie als Körper bezeichnet.
   HINWEIS: Um die Fliegenkörper in Schritt 5 richtig auszurichten, dürfen verbleibende Flügel- oder Beinlängen eine flache Ausrichtung entlang des Bodens der Form nicht beeinträchtigen. Erreichen Sie dies, indem Sie die Flügel und Beine so nah wie möglich am Brustkorb abschneiden.
3. Legen Sie die Körper mit einem Pinsel vorsichtig in beschriftete 1,5-ml-Röhrchen auf Eis, bis alle Versuchsgruppen eingesammelt sind.

4. Fixierung des gesamten Gewebes

1. Nachdem Sie die Röhrchen aus dem Eis genommen haben, geben Sie 100 μl 10 mM EGTA, pH 8, in jedes Röhrchen, um das Herzgewebe im Bauch zu entspannen. Stellen Sie sicher, dass alle Körper 10 Minuten lang untergetaucht und auf den Orbitalschüttler gelegt werden. Eine Tischzentrifuge kann verwendet werden, um das Eintauchen der Körper zu erleichtern.
2. Entfernen Sie die Lösung und entsorgen Sie sie in der Tube. Pipettieren Sie 100 μl PBS in jedes Röhrchen, um das Gewebe 10 Minuten lang zu waschen, und legen Sie es auf den Orbitalschüttler. Entfernen und verwerfen Sie nach Ablauf der Zeit.
3. Pipettieren Sie 100 μl 4%iges Paraformaldehyd in PBS-Lösung in jedes Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass alle Körper in die Lösung eingetaucht sind.
4. 15 Minuten lang auf einen Schwinger stellen und die Geschwindigkeit auf ca. 100 Einheiten einstellen. Stellen Sie sicher, dass die Einstellung das Gewebe nicht aus dem Kontakt mit der Lösung bewegt.
5. Nach Ablauf dieser Zeit entsorgen Sie das PFA und ersetzen Sie es durch 1x PBS für 10 Minuten, wobei Sie erneut sicherstellen, dass alle Körper mit der Lösung in Kontakt kommen. Die Röhrchen werden bei jedem verbleibenden Waschgang mit einer ähnlichen Geschwindigkeit wie in Schritt 4.4 wieder in den Orbitalschüttler zurückgeführt.
6. Verwerfen Sie jedes Mal die vorherige Lösung und waschen Sie das Tuch mit PBS 2x für jeweils 10 Minuten, also insgesamt 3 Wäschen.
7. Nachdem die letzte Wäsche verworfen wurde, geben Sie die Körper in eine 10%ige Saccharose in PBS-Lösung und stellen Sie sicher, dass sie mit der Lösung im Röhrchen in Kontakt kommen. Für eine optimale Sättigung lassen Sie sie über Nacht oder lange genug stehen, bis die Körper zu Boden sinken.
   HINWEIS: Eine Kryoprotektion über Nacht wird bevorzugt, aber wenn eine Bildgebung am selben Tag erforderlich ist, lassen Sie so lange wie möglich zu, bis das Kryoprotektivum in das Gewebe eingedrungen ist.

5. Vorbereitung der Form

1. Nehmen Sie an dieser Stelle das Trockeneis aus dem Lager und wählen Sie einige Stücke aus, die Sie in eine kleine Metall- oder Plastikschale legen möchten. Die Abmessungen des Tabletts sollten so sein, dass die Form eingesetzt werden kann, indem sie direkt auf ein einzelnes, großes und vorzugsweise flaches Stück Trockeneis gelegt wird.
2. Füllen Sie eine etikettierte Form zu ca. 50 % mit der Mischung für optimale Schnitttemperatur (OCT). Versuchen Sie, die Bildung von Blasen zu reduzieren, indem Sie die Verbindung langsam fließen lassen.
3. Lege die Körper vorsichtig mit einem Pinsel auf die Oberfläche des OCT in der Form. Mehrere Versuchsgruppen sollten in diesem Stadium klar voneinander getrennt werden.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine Verdünnung der OCT-Verbindung durch Verunreinigung mit der Saccharoselösung durch den Pinsel zu verhindern. Darüber hinaus kann das Platzieren tief in das OCT mit dem Pinsel viele Luftblasen erzeugen. Vermeiden Sie diese Fehler, um spätere Probleme bei der Segmentierung zu vermeiden.
4. Schieben Sie jeden Körper mit einer Pinzette mit der Rückenwand des Brustkorbs und des Bauches auf den Boden der Form, in der Regel entlang des Bodens. Passen Sie dann den Körper so an, dass der Bauch am Boden der Form als flach priorisiert wird. Richten Sie alle Körper in den Dimensionen X, Y und Z so aus, dass jeder Abschnitt alle Motive gleichzeitig enthält.
5. Es kann zu einer Krümmung des Abdomens kommen, insbesondere bei den Männchen; Glätten Sie dies so gut wie möglich für den Techniker. Dies ist unerlässlich, damit längere Schnitte in der Koronalebene entnommen werden können. Vermeiden Sie es, die Körper während dieses Vorgangs gegen den Boden der Form zu stechen oder zu quetschen. Arbeiten Sie methodisch, um jedes Motiv richtig auszurichten.
6. Sobald alle Motive an Ort und Stelle sind, nimm die Form und lege den Boden direkt auf ein Stück Trockeneis. Überprüfen Sie, ob das OCT nach einigen Augenblicken nach dem Kontakt zu gefrieren beginnt. Lassen Sie dies so lange weitergehen, bis alle Motive in den gefrorenen Teil der Form eingehüllt sind.
7. Sobald dieses Stadium erreicht ist, stellen Sie die Form auf -20 °C um, um sie vollständig einzufrieren. Füllen Sie den restlichen Teil der Form, wenn der erste Teil vollständig gefroren ist. Die Formen können dann bei -80 °C für den späteren Gebrauch gelagert werden, indem sie in Alufolie eingewickelt oder sofort geschnitten werden.
   HINWEIS: Vermeiden Sie eine offene Exposition an der Luft bei -20 °C und -80 °C zwischen den beiden Gefrierstufen. Dies kann dazu führen, dass sich Feuchtigkeit zwischen den Schichten bildet.

6. Kryosektion von Formen

HINWEIS: Es ist im Allgemeinen ratsam, eine Rohform vorzubereiten und zu schneiden, bevor Sie Formen der Versuchsgruppe schneiden. Auf diese Weise können wir die ordnungsgemäße Funktion des Rades, der Klinge und des Rollschutzglases unmittelbar vor dem Schneiden des Gewebes sicherstellen. Lassen Sie außerdem Schimmelpilze, die aus kälterer Lagerung stammen, 30 Minuten lang im Kryostaten akklimatisieren.

1. Befestigen Sie den Bohrfutter an der Form, indem Sie eine großzügige Menge OCT auf den Block auftragen und den Bohrer darauf legen und flach drücken. Lassen Sie diesen im Kryostaten vollständig einfrieren, in der Regel innerhalb von 5 min.
2. Lösen Sie den Bohrer und den OCT-Block aus der Form und setzen Sie ihn in das Spannfutter ein, wobei Sie darauf achten, dass der Block von oben nach unten richtig ausgerichtet bleibt. Ziehen Sie den Bohrschlüssel fest, bis der Bohrer fest sitzt.
3. Richten Sie den Block mit den Einstellknöpfen und den Futtertiefenreglern mit der Klinge aus. Stellen Sie die Schnittbreite auf 20 μM oder weniger ein.
   HINWEIS: Dünnere Schnitte sind wünschenswerter, um die Anzahl der gesammelten möglichen Schnitte zu erhöhen. Die ersten 2-6 Abschnitte jedes Themas sollten die gewünschten freien Teile des Herzens enthalten, was eine Funktion der Ausrichtung und der Abschnittsbreite ist. Man muss versuchen, die Ausrichtung des Spannfutters richtig zu machen, bevor man die wichtigen 2-6 Abschnitte schneidet.
4. Schneiden Sie jede Scheibe mit langsamen, aber gleichmäßigen Bewegungen, sodass das Anti-Roll-Glas jede Scheibe erfassen kann. Sammeln Sie Abschnitte mit erwärmten Folien. Lassen Sie die Objektträger mindestens 30 Minuten, aber nicht länger als 1 Stunde vor der ersten Waschrunde bei Raumtemperatur trocknen.

7. Fluoreszenz-Färbung

1. Entfernen Sie unmittelbar nach der Trocknungsphase überschüssiges OCT um die Partien herum mit einer Rasierklinge. Seien Sie vorsichtig, um zu diesem Zeitpunkt nicht mit dem Gewebe in Berührung zu kommen. Wenn der Objektträger zu einem späteren Zeitpunkt gebeizt werden soll, lagern Sie ihn bei -80 °C.
2. Umrande diesen Rand auf jeder Folie mit einem hydrophoben Marker. Dieser Rand dient dazu, Wasch- und Fleckenlösungen auf dem Gewebe zu halten.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird beschrieben, wie das Färben und Waschen mit einer Pipettenmethode durchgeführt wird. Es können auch Objektträgereimer und -gestelle verwendet werden. Ersetzen Sie einfach das Pipettieren der Lösungen auf den Objektträgern durch das Eintauchen der Objektträger in jede der frischen Lösungen. Wie wir es kürzlich für die Bildgebung des Gehirns¹⁷ getan haben, kann ein Immunfärbeverfahren auch bei der Herzfärbung angewendet werden.
3. Waschen Sie alle Objektträger 3x für jeweils 5 Minuten mit PBS, indem Sie vorsichtig auf den Objektträger pipettieren und das Pipettieren direkt auf das Gewebe vermeiden, wenn möglich. Führen Sie dies mit der 1000-μl-Pipette und den zugehörigen Spitzen durch. Versuchen Sie, die Lösung nicht zu schnell zu spritzen, da dies dazu führen kann, dass sich Gewebe von der Oberfläche des Objektträgers löst.
4. Die letzte Wäsche verwerfen und die Fluoreszenzfärbelösung (1:250, 1x Phalloidin) auf das Gewebe pipettieren. Lassen Sie es 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
5. Ab diesem Zeitpunkt sind die Motive lichtempfindlich. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte im Dunkeln oder durch Abdecken der Folien aus. Entsorgen Sie den Fluoreszenzfleck und waschen Sie ihn mit der 1000-μl-Pipette 3x für 5 Minuten mit PBS.

8. Montage und Vorbereitung für die Bildgebung

1. Entsorgen Sie die letzte Wäsche und lassen Sie eine kleine Menge PBS auf dem Objektträger. Pipettieren Sie 3-5 Tropfen Eindeckmedium mit der 1000-μl-Pipette auf den Objektträger, wobei ein direkter Einsatz auf dem Gewebe vermieden wird.
2. Legen Sie das Deckglas so auf den Objektträger, dass die Bildung von Luftblasen minimiert wird. Um es einfacher zu machen, verwenden Sie eine Pinzette, um das Deckglas an einer Kante zu platzieren, und senken Sie die andere Seite allmählich ab, bis es bündig mit dem Schieber ist. Behandeln Sie die frisch montierten Objektträger vorsichtig und lagern Sie sie mindestens 24 h liegend bei 4 °C.
3. Versiegeln Sie Dias mit Nagellack, oder vermeiden Sie dies, wenn das Montagemedium aushärtet. Nagellack, der Neon oder Glitzer enthält, sollte nicht verwendet werden. Je nach Fluoreszenzfärbung können Sie sofort eine Bildgebung durchführen oder Objektträger für eine spätere Aufnahme aufbewahren.

9. Bildgebung

HINWEIS: Für die Bildaufnahme wurde ein Olympus BX 63 Mikroskop mit 10x-, 40x- und 60x-Objektiven verwendet. Die entsprechenden Filter für DAPI, Lipid Spot 488 und Phalloidin 594 wurden ebenfalls verwendet.

1. Untersuchen Sie vor der Bildgebung die Objektträger und reinigen Sie sie mit einem Taschentuch und 70 % Ethanol in Wasserlösung. Wenn Dias unmittelbar nach der Montage abgebildet werden, seien Sie bei der Reinigung besonders vorsichtig, um das Deckglas nicht zu beschädigen.
2. Wählen Sie die richtigen Belichtungszeiten für jeden Kanal basierend auf den hellsten fluoreszierenden Motiven innerhalb des gesamten Experiments. Vermeiden Sie Übersättigung, während Sie ein möglichst helles Bild erzeugen und den Hintergrund reduzieren. Überwachen Sie schnell jede Versuchsgruppe mit einer Live-Ansicht jedes Kanals, um sicherzustellen, dass die Belichtungen richtig eingestellt sind.
3. Konzentrieren Sie sich auf jedes Thema und verwenden Sie für Konsistenz in allen Fächern denselben Kanal. Erfassen Sie dann jedes Motiv. Erfassen Sie alle Versuchsgruppen, die am selben Tag zum Vergleich verwendet wurden, um Unterschiede im Fluoreszenzzerfall zwischen den verglichenen Gruppen zu vermeiden.
4. Bewahren Sie die Dias nach der Bildgebung im Dunkeln bei 4 °C auf, um sie später erneut aufzunehmen.

Ergebnisse

Die oben beschriebene Methode ermöglicht die Untersuchung des Drosophila-Herzens mittels Fluoreszenzbildgebung ohne langwierige Dissektion. Dies ist der Hauptvorteil dieser Methode, da die herkömmliche Methode der Herzdissektion die Entwicklung komplexer motorischer Fähigkeiten erfordert. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ist die Methode für neue Forscher zugänglicher als die Herzdissektion und ermöglicht die Flexibilität des Experiments. Alter...

Diskussion

Wir haben ein effizientes Protokoll für die Vorbereitung eines Drosophila-Herzschlauchs für die Visualisierung mittels Fluoreszenz- oder konfokaler Bildgebung entwickelt. Dem geht eine Diskussion über eine häufig verwendete, aber zeit- und arbeitsintensive Methode voraus, um auf die zytologische Integrität des Drosophila-Herzens zuzugreifen und diese zu überwachen. Unsere innovative und effiziente Methode bietet eine prägnante und effiziente Alternative zu herkö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500