Méthode nouvelle et efficace pour la coloration par fluorescence du cœur de la drosophile avec cryosectionnement

Résumé

Le protocole de sectionnement cardiaque et d’imagerie par fluorescence de la drosophile simplifie l’étude de la structure et des pathologies cardiaques. Cette approche implique une section, une coloration et une imagerie simples, en contournant l’expertise technique nécessaire à la dissection traditionnelle. Il améliore l’accessibilité, faisant de la drosophile un modèle plus largement utilisable pour la recherche liée à la cardiologie au sein de la communauté scientifique au sens large.

Résumé

Les modèles cardiaques de drosophile sont largement utilisés dans l’étude du vieillissement cardiaque et la modélisation des maladies cardiaques humaines. Cependant, la dissection des cœurs de drosophile avant l’imagerie est un processus méticuleux qui prend beaucoup de temps et qui nécessite une formation et une motricité avancées. Pour relever ces défis, nous présentons un protocole innovant qui utilise la cryosection pour l’imagerie par fluorescence du tissu cardiaque de la drosophile . Le protocole a été démontré en imagerie du cœur de la drosophile adulte, mais pourrait être adapté aux stades de développement. La méthode améliore à la fois l’efficacité et l’accessibilité de la coloration par fluorescence tout en préservant l’intégrité du tissu. Ce protocole simplifie le processus sans compromettre la qualité de l’imagerie, réduisant ainsi la dépendance à l’égard de techniciens ayant une formation et des capacités motrices très développées. Plus précisément, nous remplaçons les techniques complexes, telles que l’aspiration capillaire, par des méthodes plus simples comme l’enrobage tissulaire. Cette approche permet de visualiser les structures cardiaques avec plus de facilité et de reproductibilité. Nous démontrons l’utilité de ce protocole en détectant efficacement les principaux marqueurs cardiaques et en réalisant une imagerie de fluorescence et d’immunomarquage à haute résolution qui dévoile des détails complexes de la morphologie cardiaque et de l’organisation cellulaire. Cette méthode fournit un outil robuste et accessible pour les chercheurs qui explorent la biologie cardiaque de la drosophile , facilitant les analyses détaillées du développement cardiaque, de la fonction et des modèles de maladies.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde, responsables d’environ 17,9^{millions de décès} chaque année, soit près d’un tiers de tous les décès dans le monde. Drosophila melanogaster (communément appelée mouche des fruits) a été largement utilisée comme organisme modèle pour l’étude des bases génétiques, cellulaires et moléculaires du développement cardiaque, de la physiologie, du métabolisme, du vieillissement et des cardiomyopathies 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Des modèles de drosophile ont également été utilisés pour étudier le rôle du muscle cardiaque dans la régulation systémique de l’obésité¹⁰, un facteur de risque majeur de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. Des études de séquençage du génome de la drosophile ¹¹ ont révélé une conservation significative des gènes chez l’homme, y compris ceux associés au développement de divers organes, y compris le cœur. Parmi ces gènes très conservés, certains sont impliqués dans des dysfonctionnements cardiaques, comme les cardiomyopathies ou les canalopathies³. Le développement récent de techniques efficaces pour étudier la performance cardiaque a élargi les applications du modèle pour explorer les changements à long terme de la physiologie cardiaque adulte dus à des facteurs tels que l’exercice, l’alimentation et le vieillissement⁸. Cependant, des défis techniques et logistiques entravent souvent l’utilisation de ce système modèle. L’un des défis de l’utilisation de la drosophile dans les études cardiaques est une dissection précise du cœur de manière à préserver la cytoarchitecture et les éléments myocardiques.

Le cœur de la drosophile ou le vaisseau dorsal est constitué d’une structure tubulaire composée d’une seule couche de cardiomyocytes, des cellules péricardiques positionnées le long de la paroi cardiaque, soutenues par des muscles alaires, et chez l’adulte, accompagnées d’une couche de cellules musculaires longitudinales ventrales¹². Une dissection précise pour accéder à ces structures délicates est un processus qui demande beaucoup de temps et de main-d’œuvre. La norme actuelle implique une dissection techniquement difficile et une aspiration par aspiration capillaire, nécessitant une formation et des capacités motrices avancées 13,14,15,16. En règle générale, la dissection commence par l’incision de la paroi ventrale du corps, et les défis se présentent rapidement avec l’anatomie minuscule du cœur, sa structure fragile et sa position dorsale difficile d’accès. Ceci, combiné aux techniques de dissection traditionnelles, permet une analyse précise de la structure et de la fonction cardiaques, fournissant un outil amélioré pour l’étude des maladies cardiovasculaires chez la drosophile¹³. Par exemple, à l’aide de ce document, Alayari et al. ont fourni un protocole pour le marquage fluorescent des structures cardiaques de la drosophile, facilitant ainsi la visualisation de la morphologie et de la structure cardiaques. Malgré ces efforts, la dissection et la coloration cardiaques traditionnelles sont confrontées à plusieurs défis, notamment la difficulté de maintenir l’intégrité des tissus et la formation spécialisée requise pour une coloration cardiaque efficace.

La méthode offre une solution innovante à ce problème en remplaçant l’ensemble de la procédure par un protocole plus simple qui utilise la cryointégration du thorax et de l’abdomen de la drosophile , suivie d’une immunocoloration et d’une imagerie par fluorescence. Cette approche facile à apprendre garantit une visualisation plus rapide et plus simple des structures cardiaques avec une plus grande reproductibilité. De plus, nous décrivons une méthode simple impliquant de la glace sèche qui assure un alignement uniforme de la cuticule abdominale de la drosophile sur le même plan z, rationalisant l’étape de cryosection en aval. Nous démontrons l’efficacité de ce protocole dans la détection de marqueurs cardiaques importants, de la morphologie cardiaque et de l’organisation cellulaire avec l’immunofluorescence ainsi que la microscopie confocale. La facilité et la grande efficacité de cette approche sont particulièrement utiles pour les études cardiaques à haut débit basées sur la drosophile.

Protocole

1. Préparation de l’équipement

1. Assurez-vous que le cryostat est sous tension et réglé à -20 °C. Laisser s’écouler suffisamment de temps pour que la température atteigne ce point. Si la machine est à température ambiante, le refroidissement à la température de coupe optimale peut prendre environ 5 h.
2. Allumez le chauffe-lames ou l’incubateur, en vous assurant qu’il est réglé à 37 °C. Assurez-vous que les diapositives ont suffisamment de temps pour atteindre la température souhaitée.
   REMARQUE : À ce stade, les lames étiquetées peuvent être placées sur le réchaud ou l’incubateur et laissées indéfiniment jusqu’à la section.
3. Assurez-vous que la glace sèche est prête à l’emploi. La glace peut être retirée de l’entreposage à – 80 °C une fois l’étape 5 atteinte.

2. Préparation des solutions

1. Préparez 50 ml de PBS. Préparez 10 mL de 10 mM d’acide tétraacétique d’éthélyne glycol dans du PBS. Préparez une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS dont le volume final est égal à 100 μL multiplié par le nombre de groupes expérimentaux.
2. Préparez une solution de nettoyage à 70 % d’éthanol dans de l’eau dans un flacon pulvérisateur. Préparez toutes les solutions de coloration fluorescente.
   REMARQUE : Ce protocole détaille comment effectuer une coloration simple à l’aide de colorants ou de colorants fluorescents simples. Dans ce cas, nous décrirons l’utilisation de 1x Phalloidin 594 à un rapport de 1:250 en PBS. Les concentrations de colorants fluorescents varient en fonction du réactif et des objectifs expérimentaux. Des tests préliminaires doivent être effectués pour trouver la concentration appropriée. La coloration des anticorps ne sera pas détaillée ici, mais devrait être applicable à l’aide de méthodes de coloration conventionnelles.

3. Prélèvement de tissus

1. Anesthésiez 5 à 10 mouches à l’aide d’un tapis anti-mouches CO₂ et positionnez les mouches visibles au microscope à un grossissement de 1x-2x. Le régulateur de CO₂ doit enregistrer entre 1 et 5 kPa sur le tapis de CO₂ .
   REMARQUE : D’autres méthodes d’anesthésie sont disponibles (par exemple, FlyNap²), et ces méthodes n’affectent pas significativement les résultats.
2. À l’aide de ciseaux à ressort, décapitez, coupez les ailes et retirez les pattes de 5 à 10 mouches. Ce qui reste, c’est le thorax et l’abdomen, ensemble on appellera le corps.
   REMARQUE : Pour aligner correctement les corps de mouches à l’étape 5, les longueurs d’aile ou de jambe restantes ne doivent pas interférer avec un alignement à plat le long du fond du moule. Pour ce faire, coupez les ailes et les pattes aussi près que possible du thorax.
3. À l’aide d’un pinceau, placez délicatement les corps dans des tubes de 1,5 mL étiquetés sur de la glace jusqu’à ce que tous les groupes expérimentaux aient été recueillis.

4. Fixation du tissu entier

1. Après avoir retiré les tubes de la glace, ajoutez 100 μL de 10 mM d’EGTA, pH 8, dans chaque tube pour détendre le tissu cardiaque dans l’abdomen. Assurez-vous que tous les corps sont immergés pendant 10 minutes et placés sur l’agitateur orbital. Une centrifugeuse de table peut être utilisée pour faciliter l’immersion des corps.
2. Retirez et jetez la solution dans le tube. Pipeter 100 μL de PBS dans chaque tube pour laver le tissu pendant 10 min, en le plaçant sur l’agitateur orbital. Retirer et jeter une fois le temps écoulé.
3. Pipeter 100 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans une solution de PBS dans chaque tube. Assurez-vous que tous les corps sont immergés dans la solution.
4. Placez sur un agitateur orbital pendant 15 min, en réglant la vitesse à environ 100 unités. Assurez-vous que le réglage n’agite pas les tissus hors de contact avec la solution.
5. Une fois ce temps écoulé, jetez le PFA et remplacez-le par 1x PBS pendant 10 min, en vous assurant à nouveau que tous les corps sont en contact avec la solution. Remettez les tubes dans l’agitateur orbital à une vitesse similaire à celle de l’étape 4.4 pour chaque lavage restant.
6. En jetant la solution précédente à chaque fois, lavez le mouchoir avec du PBS 2x pendant 10 min chacun, pour un total de 3 lavages.
7. Une fois le lavage final jeté, transférez les corps dans une solution de saccharose à 10 % dans du PBS, en vous assurant qu’ils entrent en contact avec la solution à l’intérieur du tube. Pour une saturation optimale, laissez-les toute la nuit ou suffisamment longtemps pour que les corps coulent au fond.
   REMARQUE : La cryoprotection de nuit est préférable, mais si une imagerie le jour même est nécessaire, laissez le cryoprotecteur s’infiltrer le plus longtemps possible dans les tissus.

5. Préparation du moule

1. À ce stade, récupérez la glace sèche de l’entrepôt et sélectionnez quelques morceaux à placer dans un petit plateau en métal ou en plastique. Les dimensions du plateau doivent être telles que le moule puisse être inséré, en le plaçant directement sur un seul gros morceau de glace sèche de préférence plat.
2. Remplissez un moule étiqueté à environ 50 % avec un composé à température de coupe optimale (OCT). Essayez de réduire l’introduction de bulles en laissant le composé s’écouler lentement.
3. À l’aide d’un pinceau, placez soigneusement les corps à la surface de l’OCT à l’intérieur du moule. À ce stade, plusieurs groupes expérimentaux doivent être distinctement séparés.
   REMARQUE : Il est important d’éviter la dilution du composé OCT par contamination par la solution de saccharose par la brosse. De plus, le placement profond dans l’OCT à l’aide du pinceau peut créer de nombreuses bulles d’air. Évitez ces erreurs pour éviter des problèmes de sectionnement plus tard.
4. À l’aide d’une pince, poussez chaque corps vers le bas du moule avec la paroi dorsale du thorax et de l’abdomen, généralement le long du bas. Ensuite, ajustez le corps de manière à ce que l’abdomen soit prioritairement comme étant plat le long du fond du moule. Alignez tous les corps dans les dimensions X, Y et Z de sorte que chaque section contienne tous les sujets simultanément.
5. Il peut y avoir une courbure de l’abdomen, en particulier chez les mâles ; Aplatissez-le au mieux des capacités du technicien. Ceci est essentiel pour que les sections plus longues soient collectées dans le plan coronal. Évitez de percer ou d’écraser les corps contre le fond du moule pendant ce processus. Travaillez méthodiquement pour aligner correctement chaque sujet.
6. Une fois que tous les sujets sont en place, prenez le moule et placez le fond directement sur un morceau de glace sèche. Vérifiez si l’OCT commence à geler après quelques instants après le contact avec les Européens. Laissez cela continuer jusqu’à ce que tous les sujets soient enveloppés dans la partie congelée du moule.
7. Une fois cette étape atteinte, transférez le moule à -20 °C pour qu’il soit entièrement congelé. Remplissez la partie restante du moule lorsque la première partie est complètement congelée. Les moules peuvent ensuite être stockés à -80 °C pour une utilisation ultérieure en les enveloppant dans du papier d’aluminium ou en les coupant immédiatement.
   REMARQUE : Évitez l’exposition à l’air libre à -20 °C et -80 °C entre les deux étapes de congélation. Cela peut provoquer le développement d’humidité entre les couches.

6. Cryosectionnement des moules

REMARQUE : Il est généralement conseillé de préparer et de découper un moule vierge avant de découper des moules de groupe expérimentaux. Cela nous permet de nous assurer du bon fonctionnement de la roue, de la lame et du verre anti-roulis immédiatement avant de sectionner les tissus. De plus, laissez les moules provenant d’un stockage plus froid s’acclimater dans le cryostat pendant 30 min.

1. Fixez le mors de mandrin au moule en appliquant une quantité généreuse d’OCT sur le bloc et en plaçant le foret sur le dessus, en le pressant à plat. Laissez-le geler complètement dans le cryostat, généralement dans les 5 minutes.
2. Libérez le foret et le bloc OCT du moule et placez-les dans le mandrin, en veillant à ce que le bloc reste correctement orienté de haut en bas. Serrez la clé du mandrin jusqu’à ce que l’embout soit bien fixé.
3. Alignez le bloc avec la lame à l’aide des boutons de réglage et des commandes de profondeur du mandrin. Réglez la largeur de section sur 20 μM ou moins.
   REMARQUE : Des sections plus fines sont plus souhaitables pour augmenter le nombre de sections possibles collectées. Les 2 à 6 premières sections de chaque sujet doivent contenir les parties non obstruées souhaitées du cœur, ce qui est fonction de l’orientation et de la largeur de la section. Il faut essayer de bien orienter le mandrin avant de couper les 2 à 6 sections importantes.
4. Coupez chaque tranche en utilisant un mouvement lent mais constant, permettant au verre anti-roulis de capturer chaque tranche. Collectez des sections à l’aide de diapositives réchauffées. Laissez les lames sécher à température ambiante pendant au moins 30 minutes mais pas plus d'1 heure avant la première série de lavages.

7. Coloration par fluorescence

1. Immédiatement après la période de séchage, retirez l’excès d’OCT entourant les sections à l’aide d’une lame de rasoir. Veillez à ne pas rencontrer le tissu à ce stade. Si la lame est destinée à être colorée à un moment ultérieur, stockez-les à -80 °C.
2. Tracez le contour de cette bordure sur chaque diapositive à l’aide d’un marqueur hydrophobe. Cette bordure servira à garder les solutions de lavage et de coloration sur le tissu.
   REMARQUE : Ce protocole décrit comment effectuer la coloration et le lavage à l’aide d’une méthode de pipette, des seaux à lames et des racks peuvent également être utilisés. Il suffit de remplacer le pipetage des solutions sur les lames par l’immersion des lames dans chacune des solutions fraîches. Comme nous l’avons fait récemment pour l’imagerie cérébrale¹⁷, une procédure d’immunomarquage peut également être appliquée à la coloration cardiaque.
3. Lavez toutes les lames 3 fois pendant 5 minutes chacune avec du PBS en pipetant doucement sur le dessus de la lame, en évitant de pipeter directement sur le tissu lorsque cela est possible. Pour ce faire, utilisez la pipette de 1000 μL et les pointes associées. Essayez de ne pas projeter rapidement la solution car cela peut provoquer la libération de tissus de la surface de la lame.
4. Jeter le lavage final et pipeter la solution de coloration à fluorescence (1:250, 1x Phalloïdine) sur les tissus. Laissez incuber pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
5. Après ce point, les sujets sont sensibles à la lumière. Effectuez toutes les étapes suivantes dans l’obscurité ou en couvrant les diapositives. Jetez la coloration de fluorescence et, à l’aide de la pipette de 1000 μL, lavez 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS.

8. Montage et préparation pour l’imagerie

1. Jetez le dernier lavage, en laissant une petite quantité de PBS sur la lame. Pipetez 3 à 5 gouttes de support de montage sur la lame à l’aide de la pipette de 1000 μL, en évitant le déploiement direct sur le tissu.
2. Placez la lamelle sur la glissière de manière à minimiser la production de bulles d’air. Pour plus de facilité, utilisez une pince pour placer la lamelle sur un bord et abaissez progressivement l’autre côté jusqu’à ce qu’elle affleure la glissière. Manipulez les diapositives fraîchement montées avec précaution et rangez-les à plat pendant au moins 24 h à 4 °C.
3. Scellez les lames avec du vernis à ongles, ou si le support de montage durcit, évitez cela. Il ne faut pas utiliser de vernis à ongles contenant du néon ou des paillettes. En fonction de la coloration fluorescente, effectuez immédiatement l’imagerie ou stockez les lames pour une capture ultérieure.

9. Imagerie

REMARQUE : Un microscope Olympus BX 63 avec des objectifs 10x, 40x et 60x a été utilisé pour la capture d’images. Les filtres appropriés pour DAPI, Lipid Spot 488 et Phalloidin 594 ont également été utilisés.

1. Avant l’imagerie, inspectez les lames et nettoyez-les à l’aide d’une lingette mouchoir et d’une solution aqueuse à 70 % d’éthanol. Si les diapositives sont imagées immédiatement après le montage, faites très attention lors du nettoyage pour ne pas déranger la lamelle.
2. Sélectionnez les temps d’exposition appropriés pour chaque canal en fonction des sujets fluorescents les plus brillants de l’expérience globale. Évitez la sursaturation tout en générant une image aussi lumineuse que possible et en réduisant l’arrière-plan. Examinez rapidement chaque groupe expérimental avec une vue en direct de chaque canal pour vous assurer que les expositions sont réglées correctement.
3. Concentrez-vous sur chaque sujet, en utilisant le même canal pour tous les sujets pour plus de cohérence. Ensuite, capturez chaque sujet. Capturer tous les groupes expérimentaux utilisés pour la comparaison le même jour afin d’éviter les différences de décomposition fluorescente entre les groupes comparés.
4. Après l’imagerie, stockez les lames dans l’obscurité à 4 °C pour une capture d’image ultérieure.

Résultats

La méthode décrite ci-dessus facilite l’étude du cœur de la drosophile à l’aide de l’imagerie par fluorescence sans dissection fastidieuse. C’est le principal avantage de cette méthode, car la méthode conventionnelle de dissection cardiaque nécessite le développement de capacités motrices complexes. Comme l’illustre la figure 1, la méthode est plus accessible que la dissection cardiaque pour les nouveaux chercheurs et permet une...

Discussion

Nous avons développé un protocole efficace pour préparer un tube cardiaque de drosophile pour la visualisation à l’aide de l’imagerie fluorescente ou confocale. Ceci est précédé d’une discussion sur une méthode couramment utilisée mais nécessitant beaucoup de temps et de travail pour accéder et surveiller l’intégrité cytologique du cœur de la drosophile. Notre méthode innovante et efficace offre une alternative concise et efficace aux approches tr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500