Method Article
توضح هذه المقالة بروتوكولا للتألق المناعي متعدد الإرسال المحسن لتوصيف البنية ثلاثية الأبعاد للنقائل الصفاقية.
يعد عدم التجانس المكاني للبيئة المكروية للورم (TME) محددا حاسما للاستجابة العلاجية ، خاصة بالنسبة لعوامل الأورام المناعية ، حيث يعتمد النجاح على توزيع مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا المناعية. على مدى العقد الماضي ، تم إدخال العديد من التقنيات المتطورة لتحقيق دقة مفصلة ل TME باستخدام أقسام ثنائية الأبعاد إما من الأنسجة الثابتة بالفورمالين أو الأنسجة المدمجة في البارافين (FFPE) أو المجمدة الثابتة. في حين أن هذه الأقسام الرقيقة أسهل في شرائها وتحليلها ، إلا أنها تفتقر إلى البنية ثلاثية الأبعاد اللازمة لتوصيف الورم بشكل موثوق وشامل. لمعالجة هذا القيد ، تم تطوير تقنية تركيب الأنسجة وتصويرها لتمكين التحليل ثلاثي الأبعاد لآفات الورم في حالتها الأصلية في الجسم الحي . يحدد هذا البروتوكول شراء أنسجة الورم البشري ، وتركيب العينات على منصات مطبوعة حسب الطلب ، وإجراءات تلطيخ عينات ما بعد التثبيت. تم تكييف تقنية التألق المناعي متعدد الإرسال ، IBEX (التبييض التكراري يمتد تعدد الإرسال) ، لتوصيف TME ثلاثي الأبعاد مع ما يصل إلى 15 علامة للخلايا السرطانية والمناعية واللحمية باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا. تم تحقيق أعماق تصوير تصل إلى 100 ميكرومتر باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر مقلوب بالضوء الأبيض مع محول تصوير مطبوع حسب الطلب وأطباق زجاجية تجارية لضمان التوجيه الأمثل للأنسجة. يسلط هذا البروتوكول الضوء على إمكانات طريقة IBEX لتوسيع دراسات التألق المناعي متعدد الإرسال ، مما يوفر فهما أكثر شمولا لتكوين TME.
الأورام الصلبة متغيرة للغاية ، مع تركيبة معقدة من أنواع الخلايا (الخبيثة وغير الخبيثة) ، وبروتينات المصفوفة خارج الخلية ، والعوامل القابلة للذوبان1،2. في النهاية ، تحدد هذه البيئة المكروية المعقدة للغاية وغير المتجانسة للورم (TME) القابلية للإصابة بعلاجات مثل العلاج المناعي3،4. على هذا النحو ، تم تطبيق تقنيات مثل التألق المناعي عالي الإرسال5،6 والنسخ المكانية7 لتوصيف تعقيد TME في أقسام طبقة الخلية السميكة (~ 4 ميكرومتر).
على عكس مناهج تشتت الخلايا مثل تسلسل الخلية المفردة وقياس التدفقالخلوي 8،9،10 ، تحافظ هذه التقنيات على العلاقات المكانية للمساهمة بمعلومات مهمة حول الحديث المتبادل الخلوي ويمكن استخدامها لتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة للتنبؤ باستجابة العلاج11،12،13. ومع ذلك ، فإن آفات الورم هي بطبيعتها هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) ، والأساليب ثنائية الأبعاد مثل تلك المذكورة أعلاه لا تلتقط بشكل كاف المشهد الخلوي المعقد. تم تقدير أهمية علم الأحياء ثلاثي الأبعاد في هذا المجال ، كما يتضح من الاستخدام الواسع للثقافات العضوية السرطانية المشتقة من المريض14. ومع ذلك ، لا تحتفظ العضيات بالتعقيد الخلوي للأصل في الجسم الحي TME ، مما يحد من قابلية التطبيق للاستخدام مع الأدوية المعدلة للمناعة أو لتوصيف مجموعات خلايا TME المتنوعة.
على الرغم من أنه قد يكون من الممكن إجراء تحليلات على أقسام 2D تسلسلية و "خياطة" الصور معا حسابيا لعرض ثلاثي الأبعاد ، إلا أن هذه التقنية باهظة التكلفة وصعبة لإنجازها بدقة عالية15. لتوصيف الأنسجة ثلاثية الأبعاد بشكل فعال من حيث التكلفة (على سبيل المثال ، الأورام) بطريقة قابلة للتكرار ، تم تطوير طريقة فريدة للتحضير وتلوين / تحليل التألق المناعي متعدد الإرسال وإثباتها باستخدام آفات الورم البريتوني من مريض مصاب بسرطان الصفاق الأولي.
استنادا إلى تكييف تقنية IBEX الراسخة (التبييض التكراري يمتد تعدد الإرسال)16،17 ، يوضح هذا البروتوكول تفاصيل الطباعة ثلاثية الأبعاد لحامل الأنسجة ومحول التصوير ، وشراء الأنسجة البريتونية ، والتركيب ، ودورات متعددة من التلوين بعلامات مختلفة من نوع الورم والخلية ، والتصوير ثلاثي الأبعاد متحد البؤر عالي الدقة.
أجريت الدراسة بموافقة مجلس مراجعة المؤسسات الصحية التابع للمعاهد الوطنية بموجب البروتوكول NCT01915225. تم الحصول على الأنسجة البشرية بموافقة خطية مستنيرة في وقت تنظير البطن التشخيصي. كانت جميع الأنسجة حاملة للورم ، على النحو الذي يحدده الفحص المرئي وتم تأكيده من خلال الفحص النسيجي المرضي النهائي. تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد. يتم توفير توضيح تخطيطي لسير العمل بأكمله في الشكل 1.
1. منصات الطباعة ، محول التصوير ، ولوحة الحضانة
2. تركيب الأنسجة على المنصات المطبوعة
3. إجراء التثبيت / التلوين / التبييض
ملاحظة: التغييرات من البروتوكول الأصلي المصممة خصيصا لتدفق الكثافة الأقصائية الوظيفية الرقيقة 4 ميكرومتر أو الأقسام المجمدة الثابتة موضحة في الشكل 3. يقدم الجدول 1 قائمة بالأجسام المضادة (مع التخفيفات) المستخدمة في جولات IBEX 1-6.
4. إجراء التصوير
الصفاق عبارة عن بنية غشائية يقل سمكها عن 1 مم تبطن سطح جدار البطن وهي متجاورة مع أسطح أعضاء البطن. يتكون من البصت المتوسط السطحي والنسيج الضام الأساسي الذي تتخلله الخلايا الدهنية والخلايا الليمفاوية والضامة والخلايا الليفية ، وكذلك الأوعية الدموية واللمفاوية. غالبا ما تنبع الأورام الخبيثة البريتونية من نقائل الورم البطني (على سبيل المثال، سرطان المبيض أو سرطان المعدة)18 أو، في كثير من الأحيان، يمكن أن تكون أورام أولية في الصفاق (على سبيل المثال، ورم الظهارة المتوسطة)19. غالبا ما تكون آفات الورم الصغيرة (<1 سم) معقدة للغاية ولكنها قابلة للتوصيف ثلاثي الأبعاد باستخدام التقنية الموضحة. يتم استخدام إسقاط أقصى لخمسة أقسام متحد البؤر لعرض العينة بأكملها المثبتة على منصة (الشكل 4 ، في الزاوية اليسرى العليا). تم استخدام ثلاثة أجسام مضادة مترافقة أولية (AF488-CD44 و AF594-CD45 و AF647-Podoplanin) جنبا إلى جنب مع الصبغة النووية Hoechst في الجولة الأولى من IBEX (IBEX1 ، الشكل 4). تظهر آفات الورم من خلال الهياكل الشبيهة بالوردة الإيجابية المزدوجة ل CD44 و Podoplanin وتظهر ترتيبا للنوى المميزة لورم الظهارة المتوسطة الحليمي.
تم تحديد الخلايا السرطانية باستخدام مورفولوجيا الخلايا واثنين من الأجسام المضادة لأن كلا من مضاد بودوبلانين ومضاد CD44 يتعرفان على الخلايا غير السرطانية ، كما يتضح من اكتشاف الأوعية اللمفاوية عن طريق مضاد بودوبلانين وارتباط الجسم المضاد CD44 بمجموعات فرعية من الخلايا المناعية. ثم يتم التقاط مناطق الاهتمام الأصغر (ROIs) باستخدام تنسيق مسح ضوئي للبلاط بدقة أعلى بأحجام Z-step محسنة لتقديم إسقاطات ثلاثية الأبعاد (الشكل 5 أ). تم أخذ المنصات من خلال إجراءات التلوين التكرارية ، وتم تصوير نفس عائد الاستثمار في دورات IBEX 1-6. يتم تجميع الصور التمثيلية للورم (الصندوق الأصفر) وواجهات الهيكل اللمفاوي الثلاثي للورم (TLS) (الصندوق الأزرق) في الشكل 5B-M.
يشير وجود TLS وكثافة الخلايا الإيجابية CD3 إلى تسلل كبير للخلايا المناعية20 وربما الاستجابة للأدوية المعدلةللمناعة 21. وتجدر الإشارة إلى أن TLS والجزء الأكبر من آفات الورم موجودان في أعماق Z مختلفة من الأنسجة ، كما هو موضح في مقارنة إسقاطات المكدس للأقسام البصرية المختلفة في الشكل 6 ، مما يسلط الضوء على فوائد التصوير ثلاثي الأبعاد والبيولوجيا المفقودة المحتملة عند تطبيق التصوير ثنائي الأبعاد على الهياكل ثلاثية الأبعاد. يصبح الطابع ثلاثي الأبعاد لهذه الآفات أكثر وضوحا في ملفات الفيلم (الفيلم 1-12) ، والتي تصور عروض الحجم للآفات الفردية في الشكل 5.
الشكل 1: سير العمل من الطباعة ثلاثية الأبعاد إلى التصوير ثلاثي الأبعاد للأورام الصفاقية. يتكون البروتوكول من سلسلة من خمس خطوات لإعداد صور ثلاثية الأبعاد متعددة الإرسال من الأنسجة البريتونية الحاملة للورم. (1) طباعة منصات استقبال الأنسجة وأجزاء محول التصوير ولوحة الحضانة. (2) شراء الأنسجة وإجراءات التركيب. (3) التثبيت مع بارافورمالدهايد. (4) دورات تلطيخ وتصوير IBEX. (5) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج التصوير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مكونات الأجهزة مع واجهة الأنسجة للتصوير ثلاثي الأبعاد. (أ) رسم تخطيطي لتجميع المنصة داخل محول التصوير. (ب) لوحة حضانة مكونة من 9 آبار. (ج) صور فوتوغرافية لمكونات محول الصور مع التجميع. (د) الصفاق الحامل لورم الظهارة المتوسطة كما لوحظ أثناء تنظير البطن التشخيصي. (ه) تركيب الأنسجة على المنصة. (إف ، ز) الصفاق الحامل للورم مثبت على المنصات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الرسم التخطيطي للجدول الزمني لدورات IBEX. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نظرة عامة على المنصة بعد الحضانة باستخدام لوحة IBEX1. الحد الأقصى للإسقاط للمنصة بأكملها بعد الحضانة باستخدام لوحة IBEX1 (Hoechst و AF488-CD44 و AF594-CD45 و AF647-Podoplanin). تسلط الدائرة المتقطعة الضوء على الورم. داخلي: صورة للبريتونيوم الحامل للورم مثبتة على منصة التصوير. شريط المقياس: 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: صور التألق المناعي عالية الدقة لمناطق منصة محددة. (أ) الحد الأقصى للإسقاط لصورة مكدس Z المدمجة المكونة من 56 بلاطة التي تم الحصول عليها بعد الحضانة باستخدام لوحة IBEX1 (Hoechst وAF488-CD44 وAF594-CD45 وAF647-Podoplanin). المستطيل الأصفر: آفة الورم الموضحة في اللوحات (B-G). المستطيل الأزرق: واجهة البنية اللمفاوية للورم الثلاثي الموضحة في (H-M). (ب - ز) آفة ورم فردية واحدة مع لوحة IBEX 1-6 في تجسيد الحجم. (ب) IBEX1 ، أخضر: CD44 ، أحمر: CD45 ، سماوي: بودوبلانين. (ج) IBEX2 ، أخضر: CD20 ، أحمر: F-actin ، سماوي: CD3. (د) IBEX3 ، أخضر: CD8 ، أحمر: CD4 ، سماوي: panCK. (ه) IBEX4 ، أخضر: CD31 ، سماوي: CD68. (F) IBEX5 ، أخضر: CD206 ، سماوي: Calretinin. (ز) IBEX6 ، أخضر: Vimentin ، أحمر: HLADR. (H-M) واجهة هيكل ليمفاوية فردية للورم مع لوحة IBEX 1-6 في عرض الحجم. (ح) IBEX1 ، أخضر: CD44 ، أحمر: CD45 ، سماوي: بودوبلانين. (I) IBEX2 ، أخضر: CD20 ، أحمر: F-actin ، سماوي: CD3. (ي) IBEX3 ، أخضر: CD4 ، أحمر: panCK ، سماوي: CD8. (K) IBEX4 ، أخضر: CD31 ، أحمر: SMA ، سماوي: CD68. (L) IBEX5 ، أخضر: CD206 ، سماوي: كالريتينين. (م) IBEX6 ، أخضر: HLADR ، سماوي: Vimentin. جميع اللوحات ، أزرق: Hoechst. قضبان المقياس: (أ ، 1 مم) ؛ (ب إم ، 250 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: محاكاة التصوير ثنائي الأبعاد. تؤكد مقارنة الإسقاطات المحدودة (10 أقسام بصرية) والمكدس الكامل (102 قسما بصريا) فقدان سياق الأنسجة في المحاكاة ثنائية الأبعاد. (أ) الإسقاط الأقصى للأقسام 30-40 (10 ميكرومتر). (ب) الإسقاط الأقصى للأقسام 85-95 (10 ميكرومتر). (ج) الإسقاط الأقصى للأقسام 1-102 (~ 100 ميكرومتر). جميع اللوحات ، IBEX2 (Hoechst ، AF488-CD20 ، AF647-CD3 ، AF790-phalloidin). شريط المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة لألواح IBEX الفردية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الفيلم 1: عرض حجم متحرك للآفة الفردية باستخدام لوحة IBEX 1 (أزرق: Hoechst ، أخضر: CD44 ، أحمر: CD45 ، سماوي: Podoplanin). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 2: عرض حجم متحرك للآفة الفردية باستخدام لوحة IBEX 2 (أزرق: Hoechst، أخضر: CD20، أحمر: F-actin، سماوي: CD3). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 3: عرض حجم متحرك للآفة الفردية باستخدام لوحة IBEX 3 (الأزرق: Hoechst ، الأخضر: CD8 ، الأحمر: CD4 ، السماوي: panCK). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 4: عرض حجم متحرك للآفة الفردية باستخدام لوحة IBEX 4 (أزرق: Hoechst ، أخضر: CD31 ، سماوي: CD68). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 5: عرض حجم متحرك للآفة الفردية باستخدام لوحة IBEX 5 (أزرق: Hoechst، أخضر: CD206، سماوي: Calretinin). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 6: عرض حجم متحرك للآفة الفردية باستخدام لوحة IBEX 6 (الأزرق: Hoechst، الأخضر: Vimentin، الأحمر: HLADR). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 7: عرض حجم متحرك لواجهة الآفة اللمفاوية الثلاثية مع لوحة IBEX 1 (الأزرق: Hoechst ، الأخضر: CD44 ، الأحمر: CD45 ، السماوي: Podoplanin). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 8: عرض حجم متحرك لواجهة الآفة اللمفاوية الثلاثية مع لوحة IBEX 2 (الأزرق: Hoechst ، الأخضر: CD20 ، الأحمر: F-actin ، السماوي: CD3). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 9: عرض حجم متحرك لواجهة الهيكل اللمفاوي الثلاثي والآفة مع لوحة IBEX 3 (الأزرق: Hoechst ، الأخضر: CD8 ، الأحمر: CD4 ، السماوي: panCK). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 10: عرض حجم متحرك لواجهة الآفة اللمفاوية الثلاثية مع لوحة IBEX 4 (الأزرق: Hoechst ، الأخضر: CD31 ، الأحمر: SMA ، سماوي: CD68). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 11: عرض حجم متحرك لواجهة الآفة اللمفاوية الثلاثية مع لوحة IBEX 5 (الأزرق: Hoechst ، الأخضر: CD206 ، السماوي: Calretinin). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 12: عرض حجم متحرك لواجهة البنية اللمفاوية الثلاثية والآفة مع لوحة IBEX 6 (الأزرق: Hoechst ، الأخضر: Vimentin ، الأحمر: HLADR). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
ملف تكميلي 1: طباعة ملف للوحة الحضانة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: طباعة ملف للمنصات الفردية البالغ عددها 36. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: طباعة ملف لحلقة ضبط الارتفاع. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 4: طباعة ملف للغطاء الخارجي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 5: ملف القطع بالليزر لشريط التمرير. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
تقتصر تقنيات تعدد الإرسال الحالية للتصوير الفلوري على الأقسام الرقيقة ولا توفر سياقا ثلاثي الأبعاد. تصف الدراسة الحالية بروتوكولا لتطبيق طريقة التصوير IBEX16،17 على الأورام السليمة المثبتة على منصات مصممة خصيصا. تم اختيار آفات الورم البريتوني لتسليط الضوء على هذه التقنية حيث أن المرضى عادة ما يعانون من رواسب ورمية متعددة ذات حجم مثالي يتم أخذها جنبا إلى جنب مع الصفاق الطبيعي المحيط كجزء من جراحة الاختزال الخلوي القياسية التي يتم إجراؤها في معظم مراكز الإحالة من الدرجة الثالثة في جميع أنحاء العالم22،23. ومع ذلك ، فإن البروتوكول قابل للتطبيق على النقائل المتني وأورام نموذج الفئران على حد سواء باستخدام شرائح الورم كما تم وصفه سابقا24،25. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل قطر حلقة التثبيت على المنصات وفقا للاحتياجات التجريبية / الأنسجة ، على الرغم من أن المساحات الأكبر عرضة لترهل الأنسجة وأوقات التصوير الممتدة. بغض النظر عن مصدر الأنسجة وحجمها ، يجب الحفاظ على الحد الأدنى من الوقت بين الشراء والحفظ لضمان الجودة المثلى26. يضمن إعداد طاولة الإعداد في غرفة العمليات المعالجة الفورية عند مشاركة المرضى. يجب ملاحظة الوقت من شراء الأنسجة إلى تثبيت الأنسجة لضمان إمكانية المقارنة بين التجارب.
يتم أخذ عينات الأنسجة من خلال بروتوكول IBEX حيث يتم إجراء حوامل كاملة ، أي التثبيت والتصوير بالإضافة إلى خطوات التبييض ، باستخدام الأنسجة السليمة الملصقة على المنصة. يضمن هذا الحفاظ على العينة من خلال دورات التلوين / التصوير / التبييض التكرارية ، نظرا لعدم وجود واجهة شبه دائمة للقسم الزجاجي ولا حاجة لوضع / إزالة زجاج الغطاء بشكل متكرر من الأنسجة ، وكلاهما يمكن أن يؤدي إلى فقدان الأنسجة. لتوفير الكواشف ، تضمن اللوحة ذات 9 الآبار المصممة خصيصا ملاءمة مثالية للمنصة بأقل قدر من "الحجم الميت". جميع الأجسام المضادة المستخدمة في التلوين هي أجسام مضادة مترافقة أولية ، وجميع مترافقات الفلوروفور المستخدمة (باستثناء صبغة Hoechst) هي أصباغ Alexa Fluor ، والتي تم اختيارها لسمعها الممتاز27. تم تصميم لوحات الأجسام المضادة الأخرى للفلوروفورات وفقا للبيانات المودعة من مجتمع التصوير IBEX ، وهو مستودع عالمي مفتوح يجمع مجموعات البيانات والبروتوكولات والتعليقات من مجموعة دولية من العلماء باستخدام IBEX (https://ibeximagingcommunity.github.io/ibex_imaging_knowledge_base/). تم اختيار تسلسل لوحات الأجسام المضادة بعناية. بشكل عام ، تم وضع أهداف منخفضة الوفرة في دورات سابقة. دورة IBEX 1 (CD45 و CD44 و Podoplanin) هي استثناء حيث تم استخدام هذه العلامات الثلاث لتحديد آفات الورم في جولة التلوين الأولية.
لوحات الأجسام المضادة صغيرة نسبيا لتقليل الحديث المتبادل للقناة في إعدادات كثافة الليزر العالية ، وهو أمر ضروري لتصوير الأنسجة بشكل أعمق باستخدام مجهر متحد البؤر. تم تضمين مترافقات AF750 حيثما أمكن ذلك لتوسيع اللوحة من 2 إلى 3 أجسام مضادة. وتجدر الإشارة إلى أنه لا يوجد العديد من المترافقات AF750 المتاحة تجاريا ، وحقيقة أن هدف هذه القناة يجب أن يكون وفيرا للغاية يحد من استخدام هذا الفلوروفور. مثال على ذلك هو الجسم المضاد المضاد لضمور العضلات الشوكي المترافق AF750 الذي تم استخدامه في هذا البروتوكول. على الرغم من أن هذا استنساخ يعمل بشكل موثوق مع AF488 أو AF594 ، إلا أن شدة الإشارة لهذا الجسم المضاد المقترن ب AF750 أقل بكثير ، مما يجعل من الصعب إنشاء مكدسات Z عالية الجودة.
تعتبر حضانات الأجسام المضادة لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة قصيرة مقارنة بالبروتوكول الأصلي وتعكس على الأرجح انخفاض كثافة الخلايا في عينات الأنسجة الصفاقية. في المقابل ، كانت خطوة التبييض مع 1.5 مجم / مل بوروهيدريد الليثيوم لمدة 60 دقيقة أكثر صرامة. تم تحديد هذه المعلمات تجريبيا ويمكن أن تختلف باختلاف الأنسجة والأجسام المضادة المستخدمة. وتجدر الإشارة إلى أنه بسبب الحضانة في محلول التبييض التفاعلي ، يمكن أن تكون فقاعات الهواء الصغيرة محاصرة في الأنسجة. كلما أصبح هذا واضحا أثناء خطوة التصوير من الإجراء ، تم تفريغ العينات عن طريق تعريض المنصة في لوحة الحضانة المكونة من 9 آبار للتفريغ باستخدام علبة شفط. لا يمكن إجراء تسجيلات عينات ITK البسيطة ، التي غالبا ما يتم تطبيقها في دراسات IBEX ، بسبب إدخال البيانات الهائلة إلى برنامج تحليل الصور. ومع ذلك ، يمكن التعرف بسهولة على مجموعات الخلايا المتطابقة من خلال مقارنة مجموعات البيانات الفردية. بشكل عام ، تم توقيت الدورات التكرارية بحيث يمكن إكمال دورة واحدة في يوم واحد ، حيث يستغرق التصوير معظم الدورة بأكملها (~ 8 ساعات).
هذه التقنية لها قيود تستحق الذكر. والوقت المطلوب للبروتوكول يجعل من غير المرجح أن تعتمد هذه الطريقة على نطاق واسع بل في ظروف مختارة. نتصور أن هذا البروتوكول يستخدم بشكل أفضل لتوصيف التغيرات في البيئة المكروية المناعية للورم قبل العلاج وبعده (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة ثنائية النوع للعلاج المناعي للسرطان) أو للتنبؤ بنتائج العلاج العامة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يقدم توصيفا ثلاثي الأبعاد ، إلا أنه من غير المعروف مقدار المنطقة التي يجب استجوابها لوصف الورم بشكل فعال ، بما في ذلك مجموعات الخلايا المعقدة28. قد يكون الوصول إلى الأنسجة البشرية الطازجة أمرا صعبا أيضا في بعض المراكز ، لكننا نتصور أن هذا البروتوكول ينطبق على النماذج الحيوانية أيضا29.
تتنوع تطبيقات هذا البروتوكول ، من الأبحاث الأساسية التي تحلل تركيبة TME عبر أورام صلبة متعددة إلى خزعات ما قبل / بعد الأنسجة للمرضى المسجلين في التجارب السريرية. على الرغم من أن البيانات التي يمكن الحصول عليها من قسم الأنسجة السميكة لطبقة خلية واحدة هائلة ، إلا أنه يمكن التغاضي عن البيولوجيا ثلاثية الأبعاد بسهولة. نرى التصوير ثلاثي الأبعاد كعامل مساعد لتقنيات البيولوجيا المكانية الأخرى ، ومن المحتمل أن يساعد في اختيار أقسام ثنائية الأبعاد للتحليلات اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك بروتوكول لدمج مكون التصوير المباشر على مدار عدة ساعات باستخدام تركيب الأنسجة الموصوفة وإعداد التصوير مستمر بنشاط.
اي.
تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للسرطان (NCI). تم دعم هذا البحث أيضا جزئيا من قبل CAT-I ، وهو تعاون بحثي بين NIAID و NCI ، بقيادة رونالد جيرمان. نود أن نعرب عن امتناننا لأندريا رادتكي على جهودها الحماسية والتعاونية. استفادت خبرتها بشكل كبير من هذه الدراسة.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alexa Fluor Plus 750 Phalloidin | Invitrogen | A30105 | F-actin dye |
Alexa Fluor 488 anti-human CD206 (MMR) Antibody | BioLegend | 321114 | antibody |
Alexa Fluor 488 anti-human CD31 Antibody | BioLegend | 303110 | antibody |
Alexa Fluor 488 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300519 | antibody |
Alexa Fluor 488 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307656 | antibody |
Alexa Fluor 488 anti-mouse/human CD44 Antibody | BioLegend | 103016 | antibody |
Alexa Fluor 594 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304060 | antibody |
Alexa Fluor 647 Anti-Calretinin antibody [EP1798] | Abcam | ab214244 | antibody |
Alexa Fluor 647 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 300416 | antibody |
Alexa Fluor 647 anti-human CD8 Antibody | BioLegend | 344726 | antibody |
Alexa Fluor 647 anti-human Podoplanin Antibody | BioLegend | 337007 | antibody |
Alexa Fluor 647 anti-Vimentin Antibody | BioLegend | 677807 | antibody |
Alexa Fluor 647 CD68 Antibody (KP1) | Santa Cruz | sc-20060AF647 | antibody |
Alexa Fluor 750 Cytokeratin, pan Antibody (AE-1/AE-3) | Novus | NBP2-33200AF750 | antibody |
Alexa Fluor 750 Human alpha-Smooth Muscle Actin Antibody | R&D | IC1420S | antibody |
Alexa Fluor 488 CD20 Monoclonal Antibody (L26) eBioscience | Thermo Fisher | 53-0202-82 | antibody |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | supplement harvest medium |
BioMed Clear Resin (Form 3) | FormLabs | RS-F2-BMCL-01 | resin used for platform + incubation plate |
BSA | Sigma | A7906-500g | blocking solution component |
Cast acrylic 1/32" thick | material used for cutting slider | ||
CleanStation DT3 | Stratasys | DT3 | post processing for height adjuster & outer lid |
Container, Specimen | McKesson | 870203 | transfer of tissue from perating table to prep table |
CorelDraw | CorelDRAW | Software to prepare the vector-based design file for laser cutting | |
Cytofix | BD Bioscience | 554655 | fixative |
Dish 15 cm | Falcon | 353025 | dish used during mounting |
Dish 35 mm No. 1.5 Coverslip 14 mm Glass Diameter Uncoated | Matek | P35G-1.5-14-C | imaging dish |
DMEM (no glucose) | Gibco | 11966025 | harvest medium |
Fc Block | BD Bioscience | 564220 | blocking solution component |
Form 3B+ | Formlabs | Form 3B+ | printer used for platform + incubation plate |
Form Cure | Formlabs | FH-CU-01 | post processing for platform + incubation plate |
Form Wash | Formlabs | FH-WA-01 | post processing for platform + incubation plate |
GrabCAD Print | GrabCAD | GrabCAD Print | Software to prepare models for Stratasys printers |
Hoechst 33342 10 mg/mL | Biotium | 40046 | nuclear dye |
J826 Prime 3D Printer | Stratasys | J826 | printer used for height adjuster & outer lid |
LAS X | Leica | LAS X | Confocal software |
Laser cutting system | Universal Laser Systems | ULS PLS6.150D | CO2 Laser cutting used for slider |
Lithium Borohydride | STREM Chemicals | 93-0397 | bleaching chemical |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | base Buffer for washing, blocking, staining |
PreForm | FormLabs | PreForm | Software to prepare models for Formlab printers |
Silk sutures 2-0 | Ethicon | A305.O35 | affix tissue to platform |
Stellaris 8 WLL confocal microscope | Leica | STELLARIS 8 | Confocal Imaging |
Syringe filter | filter ab solution | ||
Triton X-100 | American Bio | AB02025-00100 | permeabelizing reagent, blocking solution component |
Vero ContactClear | Stratasys | CTT610, 4 KG | resin used for height adjuster & outer lid |
Warming Tray | Spring USA | ST-1220 | keep media and tissue warm |
Water, distilled | Gibco | 15230-170 | diluent for LiBH4 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved