عزل وتثبيت وتوصيف كريات البيض في الكلى ذات الرأس الذهبي للدنيس عن طريق قياس التدفق الخلوي

Summary

تصف هذه المخطوطة عزل وتثبيت الكريات البيض المستخرجة من رأس الدنيس المذهب وتقييم قابليتها للحياة عن طريق قياس التدفق الخلوي. يساهم هذا العمل في توحيد البروتوكولات ويستفيد من معالجة عدد أكبر من العينات دون المساس بجودة العينة ، مما يعزز التقدم في المعرفة بمناعة الأسماك.

Abstract

المناعة ضرورية للتنظيم الفسيولوجي للكائنات الحية ، حيث تعمل كدفاع أساسي ضد مسببات الأمراض والضغوطات البيئية. يوفر عزل الخلايا المناعية وتحليلها رؤى رئيسية حول الاستجابات المناعية للضغوط الخارجية. ومع ذلك ، فإن الافتقار إلى بروتوكولات منسقة للأنواع الأقل دراسة ، مثل الأسماك البحرية ، غالبا ما يؤدي إلى تحديات تقنية وتحليلية تعيق تفسير البيانات والفهم الشامل للاستجابات المناعية الخاصة بالأنواع. هدفت هذه الدراسة إلى إعداد إجراء تحليلي محسن قائم على قياس التدفق الخلوي لتوصيف وتحديد صلاحية الكريات البيض من كلية الرأس (العضو الرئيسي المكونة للدم في أسماك teleost) من الدنيس الصغير ذو الرأس المذهب (Sparus aurata). بدأ الإجراء بعزل الكريات البيض من خلال عملية التجانس باستخدام محلول الملح المتوازن من هانكس ، متبوعا بطريقة طرد مركزي محسنة لتدرج الكثافة Percoll لضمان معدلات استرداد عالية للكريات البيض مع الحد الأدنى من تلوث كريات الدم الحمراء المطلوبة لتحليل قياس التدفق الخلوي اللاحق الفعال. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام تقنية جديدة باستخدام صبغة تفاعلية للخلية (LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit) للتمييز بين الخلايا القابلة للحياة والخلايا الميتة بناء على أنماط تلطيخ الفلورسنت. تم تحقيق التثبيت بنسبة 3.7٪ من الفورمالديهايد ، مما يحافظ على مورفولوجيا الخلية ، وقابليتها للحياة ، وكفاءة التلوين. حدد تحليل قياس التدفق الخلوي بنجاح ثلاثة مجموعات بيضاء سائدة: الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والخلايا الحبيبية. لم تسمح هذه الطريقة باختبارات الجدوى فحسب ، بل سمحت أيضا بالتمايز الدقيق لأنواع الخلايا. يمثل التحسن في بروتوكولات قياس التدفق الخلوي خطوة إلى الأمام في مناعة الأسماك من خلال زيادة دقة وكفاءة تحليل الخلايا المناعية. علاوة على ذلك ، من خلال السماح بتثبيت الخلايا للتحليل اللاحق ، يقلل هذا البروتوكول بشكل كبير من الوقت والجهد اللازمين لتقييمات المناعة ، مما يجعله أداة قيمة لكل من التطبيقات البحثية والعملية في مختلف مجالات البحث.

Introduction

تلعب المناعة دورا مركزيا في التنظيم الفسيولوجي للكائنات الحية ، حيث تعمل كدفاع أساسي ضد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض والضغوط^{البيئية 1}. مثل الفقاريات الأخرى ، تمتلك الأسماك نظام مناعة معقد وديناميكي ومنسق ضروري لصحتها العامة^{ورفاهيتها 1}.

تمتلك أسماك Teleost كلا من أجهزة المناعة الفطرية والتكيفية ، والتي تعمل في وقت واحد لاكتشاف الغزاة الضارين والاستجابة لهم وتحييدهم². يعمل الجهاز المناعي الفطري كخط دفاع أول ، حيث يوفر استجابات فورية وغير محددة لمسببات الأمراض² ، بينما يتطور الجهاز المناعي التكيفي بمرور الوقت ، مما يوفر استجابة أكثر تخصصا تمكن الأسماك من التعرف على مسببات الأمراض المحددة وإنشاء ذاكرة مناعية³. يعتمد الجهاز المناعي للأسماك على الأعضاء اللمفاوية الأولية المتخصصة (مثل الغدة الصعترية وكلى الرأس) والأعضاء اللمفاوية الثانوية (مثل الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالطحال والغشاء المخاطي (MALT)) لدعم الدفاع المناعي والحفاظ على الصحة^{العامة 4}. كلية الرأس هي العضو الأساسي المكونة للدم في أسماك teleost وتلعب دورا مهما في نمو ونضج الخلايا المناعية ، بما في ذلك الكريات البيض⁵.

في السنوات الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في دراسة الاستجابات المناعية للعديد من أنواع الأسماك². كان أحد مجالات التركيز الرئيسية هو فهم مجموعات الكريات البيض ونشاطها. تصنف الكريات البيض ، والمعروفة أيضا باسم خلايا الدم البيضاء ، بشكل عام إلى خلايا وحيدة وخلايا ليمفاوية وخلايا حبيبية وتلعب دورا مهما في الدفاع المناعي للأسماك. لديهم خلايا البلعمة ، وهي المسؤولة عن ابتلاع وتدمير مسببات الأمراض وإطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية المضادة للجراثيم ، مما يساهم في القضاء على الكائنات الحية الدقيقة الغازية⁶. تشارك الكريات البيض أيضا في العملية الالتهابية ، مما يساعد على عزل الالتهابات والقضاء عليها مع تعزيز إصلاح الأنسجة⁶. تعد وفرة ونشاط مجموعات الكريات البيض مؤشرات مهمة للحالة المناعية في صحة^{ومرضه 7،8}.

أظهرت بعض الدراسات أن عوامل الإجهاد ، مثل الظروف البيئية المعاكسة ، يمكن أن تغير عدد وتشكل كريات الدم الحمراء وتكوين الكريات البيض المنتشرة^9،10. على سبيل المثال ، كما استعرض Franke et al. (2024) ، من الأهمية بمكان دراسة الجهاز المناعي للأسماك في سيناريوهات تغير المناخ ، حيث يمكن للضغوط البيئية أن تضر بمناعة الأسماك ، وتزيد من قابليتها للإصابة بالأمراض ، وتعزز عدوى بعض مسببات الأمراض ، مما يؤدي في النهاية إلى تسريع تطور المرض¹¹. علاوة على ذلك ، فإن فهم مناعة الأسماك ضروري ليس فقط للنهوض بالبحوث البيولوجية الأساسية ولكن أيضا لدعم قطاعات مختلفة من المجتمع ، مثل صناعة تربية الأحياء المائية. مع استمرار توسع تربية الأحياء المائية على مستوى العالم، أصبح ضمان صحة ورفاهية أنواع الأسماك المستزرعة أمرا مهما بشكل متزايد. ومع ذلك، لا تزال رعاية الأسماك مجالا جديدا نسبيا للبحث، ولا تزال الاستجابات المناعية للأسماك المستزرعة تتطلب تقييمات شاملة وموحدة. يعد إعطاء الأولوية لدراسات الاستجابة المناعية أمرا في غاية الأهمية ، حيث يمكن للمعلومات المكتسبة أن تعزز استدامة تربية الأحياء المائية وإنتاجيتها من خلال مناهج فعالة ومصممة خصيصا لتحسين رفاهية ومرونة المستزرعة.

عادة ما يتم إجراء القياس الكمي للكريات البيض وتحديدها باستخدام طرق أمراض الدم ، مثل العد اليدوي باستخدام مقاييس الدم Bürker أو Neubauer أو Thoma ، بالإضافة إلى مسحات الدم الملطخة^7،10. للمساعدة في تصور خلايا الدم وتمايزها ، غالبا ما يتم استخدام مجموعات التلوين ، مثل Wright و May-Grünwald-Giemsa و Hemacolor^{، 7،12}. ومع ذلك ، فإن تقنيات عد الخلايا اليدوية هذه مملة وتستغرق وقتا طويلا وعرضة للخطأ البشري^8،10. تشمل المصادر الشائعة للخطأ عدم كفاية الخلط أو التخفيف للدم ، ومشاكل التلوين ، والتحميل غير الصحيح لغرفة مقياس الدم ، وكلها يمكن أن تؤدي إلى عدد الخلايا غير الدقيق¹². علاوة على ذلك ، يتطلب تحليل الدم اليدوي مستوى عال من الخبرة والتجربة لضمان موثوقية النتائج وقابليتها للتكرار⁷. مع زيادة الطلب على أدوات التشخيص الدقيقة والفعالة ، يصبح تطوير طرق مبتكرة توفر فهما متعمقا للحالة المناعية لمجموعات الأسماك خطوة متزايدة الأهمية في النهوض بهذا المجال.

ظهر قياس التدفق الخلوي كأداة قوية في هذا السياق ، حيث يقدم نهجا كميا عالي الإنتاجية لتحليل مجموعات الكريات البيض وقابلية الخلايا للحياة⁸. تسمح تقنية التشخيص الحديثة هذه بالكشف السريع عن الخلايا الفردية في مجموعات مختلطة وعدها وتوصيفها بدقة^{ملحوظة 13}. علاوة على ذلك ، يسمح قياس التدفق الخلوي بقياسات متزامنة متعددة العوامل لكل من التوصيف الظاهري والوظيفي. على الرغم من استخدامه على نطاق واسع في البيئات السريرية البشرية والطب البيطري ، إلا أن تطبيقه في دراسة كريات البيض في الأسماك لا يزال محدودا^{للغاية 8}. بينما تم إجراء بعض الأبحاث على أنواع مختلفة من الأسماك^{1،6،8،13،14،15،16،17} ، لا تزال هناك العديد من التحديات الحرجة التي لا تزال بحاجة إلى معالجة. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في هذه التحليلات في ضرورة الحصول على معلقات الكريات البيض الحية المستخرجة من الدم المحيطي أو الأنسجة اللمفاوية ، مثل كلية الرأس¹. غالبا ما يكون عزل الكريات البيض صعبا بسبب خاصية فريدة من نوعها لأسماك teleost: وجود كريات الدم الحمراء ذات النواة. يمكن أن يتداخل التلوث غير المقصود بكريات الدم الحمراء مع تحليل الكريات البيض بسبب حجمها وشكلها البيضاوي ووجود نواة¹. لذلك ، من الضروري القضاء على كريات الدم الحمراء من معلقات الكريات البيض لتحقيق نقاء عال للكريات البيض ودراسة الخصائص المظهرية والوظيفية للكريات البيض عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. في الثدييات ، عادة ما يتضمن عزل الكريات البيض التحلل التناضحي لكريات الدم الحمراء أو فصل تدرج الكثافة مع Ficoll أو Percoll¹. ومع ذلك ، فإن التحلل التناضحي غير فعال لكل من أسماك المياه البحرية والمياه العذبة بسبب كريات الدم الحمراء ذات النواة ، والتي لا يمكن تحللها بشكل صحيح¹. بدلا من ذلك ، يفضل فصل تدرج الكثافة للأسماك لأنه يحافظ بشكل فعال على استقرار الخلية بمرور الوقت¹. على الرغم من أن بعض الدراسات نجحت في عزل الكريات البيض من الأسماك الصغيرة ، إلا أن الكثير من الأبحاث لا تزال تركز بشكل أساسي على السكان البالغين¹⁷. ومع ذلك، فإن مراحل الحياة المبكرة ليست أكثر عرضة لتفشي الأمراض فحسب، بل إنها أصغر حجما أيضا، مما يجعل عملية أخذ العينات أكثر تعقيدا وصعوبة. قيد آخر هو أن الطرق الحالية غالبا ما تقتصر على عدد محدود من العينات أو التكرارات في وقت واحد ، حيث يتطلب تقييم صلاحية الكريات البيض معالجة فورية. يمكن أن يؤثر التأخير في معالجة العينات سلبا على الجدوى الخلوية ، وبالتالي إدخال المزيد من التعقيدات في عملية أخذ العينات ويحتمل أن يعرض العمل بأكمله للخطر.

على حد علمنا ، لم تنجح أي من الطرق المنشورة في إصلاح خلايا الكريات البيض لتحليل الجدوى اللاحق عن طريق قياس التدفق الخلوي. تعتبر الدراسة الحالية رائدة ، حيث أنها تؤسس طريقة فعالة لعزل الكريات البيض عن كلية رأس الدنيس الصغير (Sparus aurata) ، وهي الأنواع السمكية الرئيسية المستزرعة في دول جنوب أوروبا ، باستخدام منهجية فصل تدرج الكثافة Percoll. نقدم أيضا تقنية محسنة قائمة على التلوين تميز بين الخلايا الميتة والخلايا الميتة أثناء تحديد مجموعات الكريات البيض الرئيسية (الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والخلايا الحبيبية) من خلال قياس التدفق الخلوي. يستلزم البروتوكول المحسن تثبيت الخلايا ، والذي يتيح تحليل الخلايا القابل للتطبيق لمدة تصل إلى شهر واحد بعد العملية. إن تطبيق بروتوكول قياس التدفق الخلوي هذا لديه القدرة على تقليل الوقت والجهد المطلوبين عادة لتقييم المناعة بشكل كبير ، مما يجعله تقنية قيمة لكل من الأبحاث والتطبيقات العملية في قطاع الاستزراع المائي. يوفر تطبيق هذه المنهجية مزايا لتحليل عدد كبير من العينات ، والحفاظ على الخلايا ، والسماح بالتحليل المتأخر عن طريق قياس التدفق الخلوي. لذلك ، قد يكون من المفيد جدا إنتاج رؤى قيمة حول آليات المناعة للأسماك وكيف تتأثر صلاحية الخلية بالظروف البيئية أو التجريبية المختلفة. علاوة على ذلك ، يمكن دمج مقايسة الجدوى هذه مع التوصيف الظاهري والوظيفي متعدد العوامل لمجموعات معينة من الخلايا المناعية. يتيح هذا النهج تحليلا أكثر شمولا للعديد من المعلمات المناعية ، وربطها مباشرة بأنواع الخلايا المقابلة ويوفر فهما أوضح للاستجابات المناعية. ويمكن أن تساهم هذه النتائج في وضع استراتيجيات أكثر فعالية، بما في ذلك تحسين النهج لإدارة الأمراض في تربية الأحياء المائية.

Protocol

يجب تنفيذ هذا البروتوكول من قبل باحثين معتمدين في التجارب على (وظائف الاتحاد الأوروبي A و B). يجب أن تتوافق جميع الإجراءات المتعلقة بالتعامل مع وجمع العينات مع إرشادات ARRIVE (أبحاث: الإبلاغ عن التجارب في الجسم الحي ) والالتزام بالمعايير الأخلاقية لرعاية واستخدامها وفقا لتوصيات الاتحاد الأوروبي لجمعيات علوم المختبرات (FELASA). اتبعت هذه الدراسة كل هذه المعايير بالإضافة إلى التشريعات البرتغالية لعلوم المختبر (توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63; المرسوم بقانون رقم 113/2013). تمت الموافقة على البحث من قبل هيئة رعاية وأخلاقياته (ORBEA ، LABVIVOS-002-AquaClimAdapt) ، تحت إشراف الهيئة الوطنية لاستخدام الحية ، والمعروفة باسم المديرية العامة للأغذية والبيطرية (DGAV) ، بموجب رقم التصريح الأخلاقي 20596 / 25-S.

1. دراسة النموذج وصيانة الكائنات الحية

ملاحظة: صممت هذه الدراسة خصيصا لصالح الدنيس الذهبي اليافع (Sparus aurata) ، بمتوسط وزن 30.0 ± 5.0 جم وطول إجمالي 12.0 ± 2.0 سم. قد لا تنطبق هذه الطريقة بشكل مباشر على أنواع الأسماك الأخرى ، حيث أن الأنواع المختلفة لها خصائص فسيولوجية ومناعية فريدة قد تؤثر على عزل الكريات البيض وتثبيت الخلايا وتقييم البقاء. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على البروتوكول لأنواع أخرى ، ويوصى بإجراء دراسات أولية لتحسين الظروف لكل نوع مستهدف.

1. التأقلم مع الأسماك (فترة الحجر الصحي)
   1. وزع الأسماك بالتساوي في أحواض ذات سعة كبيرة (على سبيل المثال، خزانان بسعة إجمالية قدرها 660 لترا لكل منهما - انظر الشكل التكميلي 1).
      ملاحظة: قد تكون الخزانات التي سيتم استخدامها جزءا من نظام إعادة تدوير الاستزراع المائي (RAS) ، والذي يسمح باستخدام المياه بكفاءة وتحسين التحكم في جودة المياه. في RAS ، يتم إعادة تدوير المياه ومعالجتها بشكل مستمر داخل النظام ، مما يوفر بيئة مستقرة وخاضعة للرقابة للأسماك. يساعد هذا الإعداد في الحفاظ على الظروف المثلى لصحة الأسماك ونموها ، مما يضمن توزيعا موحدا وتقليل التوتر أثناء الدراسة.
   2. الحفاظ على الظروف اللاأحيائية المثلى.
      1. احتفظ بالأسماك في الحجر الصحي لمدة 3 أسابيع في ظل ظروف تحاكي بيئتها الطبيعية:
         درجة الحرارة: 20.0 ± 0.5 درجة مئوية ؛
         الأكسجين المذاب: 7.2 ± 0.2 مجم / لتر ؛
         الملوحة: 35.0 ± 0.5 ‰ ؛
         الرقم الهيدروجيني: 8.0 ± 0.1 وحدة ؛
         فترة التصوير: 14 ساعة ضوء / 10 ساعات مظلمة.
         ملاحظة: قد تختلف ظروف الصيانة المثالية بين أنواع الأسماك المختلفة. قد يكون للأنواع الأخرى متطلبات مختلفة ، لذلك من المهم تكييف هذه الظروف مع الاحتياجات المحددة للأنواع المستهدفة لضمان صحة ورفاهية الكائنات الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتغير درجة حرارة مياه البحر والفترة الضوئية مع الفصول ، لذلك يجب مراعاة الاختلافات الموسمية عند تكرار الظروف الطبيعية في المختبر.
2. بدء الدراسة التجريبية.
   1. تحديد عدد الخزانات والأسماك المطلوبة بناء على تصميم الإعداد التجريبي لكل دراسة حالة.
   2. بعد فترة الحجر الصحي ، انقل الأسماك إلى RAS مستقل (انظر الشكل التكميلي 2).
      1. تجهيز كل نظام بكاشطات البروتين لإزالة المركبات العضوية الزائدة من الماء ؛ الترشيح الفيزيائي (كيس الفلتر [400 ميكرومتر] ، إسفنجة المرشح ، والصوف الزجاجي) ؛ الترشيح البيولوجي (الكرات الحيوية [1.5 بوصة] ، معقم الماء بالأشعة فوق البنفسجية ، وأحجار الهواء المغمورة) ؛ أنظمة تبريد مياه البحر الأوتوماتيكية والسخانات الرقمية المغمورة ، وكلاهما متصل بنظام تحكم محوسب (ProfiLux) مع مستشعرات درجة الحرارة لضبط درجة الحرارة في كل خزان ؛ أحجار الهواء المغمورة في كل خزان للتحكم في الأكسجين المذاب.
   3. تأقلم الأسماك لمدة أسبوعين في الأنظمة الجديدة قبل الشروع في التجربة.
   4. إجراء الصيانة اليومية
      1. قم بإزالة براز الأسماك من كل حوض حضانة وقم بتجديد مياه البحر بنسبة 25٪.
      2. قم بقياس درجة الحرارة باستخدام مقياس حرارة دقيق محمول.
      3. راقب المعلمات اللاأحيائية الأخرى لمياه البحر (الملوحة والأكسجين المذاب ودرجة الحموضة) باستخدام أداة قياس متعددة المعلمات.
      4. اضبط المعلمات اللاأحيائية لمياه البحر حسب الضرورة لضمان الاستقرار طوال التجربة.
         ملاحظة: يمكن أن تختلف الظروف اللاأحيائية في الأنظمة التجريبية اعتمادا على المتطلبات المحددة لكل دراسة حالة. على سبيل المثال ، إذا كانت الدراسة تهدف إلى محاكاة التغيرات الموسمية أو موجات الحر البحرية ، فيجب تعديل درجة الحرارة والفترة الضوئية وفقا لذلك لتقليد التغيرات الموسمية الطبيعية. وبالمثل ، إذا ركزت الدراسة على محاكاة ظروف نقص الأكسجين أو تحمض المحيطات ، فيجب إجراء تعديلات على مستويات الأكسجين ودرجة الحموضة في مياه البحر. هذا يضمن أن تكون الظروف التجريبية واقعية وذات صلة قدر الإمكان ، مما يعزز صحة نتائج الدراسة وقابليتها للتطبيق.
      5. تقييم صحة الأسماك ورفاهيتها ، وتحديد وإدارة علامات الإجهاد أو المرض كما هو موضح في الخطوات 1.2.4.6-1.2.4.8.
      6. ابحث عن سلوكيات غير طبيعية مثل السباحة غير المنتظمة أو فقدان الشهية أو الخمول أو العدوان أو العزلة.
      7. تحقق من علامات المرض ، بما في ذلك الآفات أو القرحة أو تغير اللون أو الزعانف المثبتة أو المخاط المفرط أو حركة الخياشيم السريعة.
      8. سجل جميع الملاحظات مع ملاحظة التاريخ والإجراءات المتخذة.
   5. إجراء اختبارات جودة المياه الأسبوعية.
      1. قم بقياس مستويات الأمونيا (NH₃ / NH₄) والنتريت (NO₂^-) والنترات (NO₃^-) باستخدام اختبارات قياس الألوان.
         ملاحظة: تأكد من أن جميع هذه المعلمات أقل من المستويات التي يمكن اكتشافها. إذا تجاوزت المستويات الحدود ، فقم بإجراء تغيير إضافي للمياه أو زيادة التهوية أو ضبط الترشيح.
   6. إطعام ومراقبة تغذية الأسماك.
      1. توفير نظام غذائي عالي الجودة يلبي المتطلبات الغذائية المحددة للأسماك الصغيرة (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على مثال على التركيب التفصيلي للنظام الغذائي).
         ملاحظة: تأكد من أن حجم كريات العلف المائي (2-3 مم) مناسب للأحداث ، مما يسهل الابتلاع والهضم.
      2. اضبط كمية العلف لتتوافق مع 2٪ من متوسط وزن جسم السمكة يوميا.
      3. قم بإطعام الأسماك يدويا مرتين يوميا - مرة في الصباح ومرة في فترة ما بعد الظهر (حدد وقتا محددا للحفاظ على روتين تغذية مستقر).

2. أخذ عينات الأسماك ، والقتل الرحيم ، والتشريح ، وجمع كلى الرأس

1. تذوق الأسماك من الخزانات.
   1. اختر الأسماك بشكل عشوائي من الخزانات لتجنب تحيز أخذ العينات.
   2. استخدم شبكة لنقل الأسماك برفق إلى وعاء تخزين مؤقت مملوء بمياه الخزان.
      ملاحظة: قلل من وقت المناولة لتقليل التوتر.
2. تحضير محلول القتل الرحيم.
   1. استخدم حاوية مناسبة (على سبيل المثال ، دلو سعة 3 لتر) مناسبة لحمل الأسماك.
   2. قم بإذابة الكمية المناسبة من التريكايين (MS-222) في مياه البحر لتحقيق تركيز نهائي يتراوح بين 200 و300 ملغم/لتر¹⁸ (تنبيه انظر الجدول التكميلي 2 والملف التكميلي 1).
   3. قم بتخزين المحلول ببيكربونات الصوديوم إلى درجة حموضة 7.2-7.5.
3. إدارة حل القتل الرحيم.
   1. ضع السمكة في محلول القتل الرحيم لمدة 10 دقائق على الأقل أو حتى يتم ملاحظة توقف الحركة الجراحية وفقدان ردود الفعل (تأكد من القتل الرحيم عن طريق التحقق من عدم الاستجابة للمنبهات الخارجية).
   2. سجل وزن جسم السمكة (جم) والطول الكلي (سم).
4. إجراء تشريح الأسماك.
   ملاحظة: لضمان جودة العينة المثلى وقابلية الخلية للحياة ، يجب إكمال عملية التشريح في أسرع وقت ممكن ، ويفضل في غضون 5 دقائق بعد القتل الرحيم.
   1. تأكد من الحفاظ على درجة حرارة المختبر عند 19 درجة مئوية باستخدام تكييف الهواء لتقليل التقلبات أثناء أخذ العينات والمعالجة.
   2. قم بتعقيم أدوات التشريح (يفضل أدوات الأوتوكلاف المعدنية كلما أمكن ذلك) وقم بإعداد مساحة عمل نظيفة تحتوي على 70٪ من الإيثانول (تنبيه ، انظر الجدول التكميلي 2).
   3. ضع السمكة القتل الرحيم على جانبها على صينية تشريح معقمة مع توجيه الرأس نحو اليد غير المهيمنة.
   4. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق دقيق على طول خط الوسط البطني للأسماك من فتحة التهوية (فتحة الشرج) باتجاه الخياشيم.
      ملاحظة: كن حذرا من عدم القطع بعمق شديد لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية.
   5. استخدم مقص التشريح بعناية لتمديد الشق وفضح الأعضاء الداخلية. ارفع اللوحات الجانبية لجدار الجسم برفق لتوفير رؤية واضحة للتشريح الداخلي.
   6. تحديد موقع كلية الرأس: يتم وضع كلية الرأس خلف الخياشيم مباشرة ، بالقرب من المنطقة الظهرية الأمامية من تجويف الجسم ، وتمتد على طول الجانب العلوي من تجويف الجسم ، أسفل العمود الفقري.
      ملاحظة: عادة ما تكون كلية الرأس أغمق في اللون مقارنة بالأنسجة المحيطة (الشكل 1).
   7. قم بإزالة أي أنسجة محيطة بعناية ، مثل الدهون والأنسجة الضامة ، لتصور كلية الرأس بشكل أفضل.
      ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة معالجة دقيقة لتجنب إتلاف كلية الرأس.
   8. باستخدام ملقط ومقص رفيع الرؤوس ، ارفع كلية الرأس بعناية وقم بعمل جروح دقيقة حولها لتحريرها من الأنسجة المحيطة.
      ملاحظة: تعامل مع الأنسجة برفق لمنع التلف. في سمكة تزن حوالي 30 جراما ، من المتوقع أن تزن كلية الرأس حوالي 20-30 مجم.
   9. ضع العضو المستأصل على الفور في مصفاة خلية (شبكة نايلون 100 ميكرومتر) داخل طبق بتري معقم لضمان العقم ولتسهيل خطوات المعالجة اللاحقة.
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، يجب تنفيذ جميع الخطوات في أسرع وقت ممكن (في غضون 5 دقائق) للحفاظ على بقاء الخلية. للحفاظ على برودة العينة ، قم بتنفيذ الخطوات التالية مع وضع طبق بتري على وعاء مملوء بالثلج ومغطى بورق الألمنيوم.

الشكل 1: موضع كلية الرأس: (أ) رسم توضيحي يصور الموقع النموذجي لكلية الرأس خلف الخياشيم وعلى طول المنطقة الظهرية الأمامية لتجويف الجسم ؛ (ب) صورة تمثيلية لكلية الرأس في الدنيس ، مع التأكيد على لونها الأغمق مقارنة بالأنسجة المحيطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. عزل كريات البيض في الكلى في الرأس (الشكل 2)

الشكل 2: وصف توضيحي لعزل الكريات البيض من كلية الرأس. يتضمن البروتوكول عدة خطوات: بدءا من تجانس الأنسجة ، متبوعا بالطرد المركزي المتدرج للكثافة ، وجمع حلقة الكريات البيض ، وغسل حلقة الكريات البيض ، والانتهاء بإعادة تعليق وتعديل تركيز الخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

1. تجانس الأنسجة.
   1. ضع 2 مل من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) في طبق بتري معقم.
   2. تأكد من أن شبكة مصفاة الخلية (شبكة نايلون 100 ميكرومتر) على اتصال مع HBSS ولكنها غير مغمورة بالكامل.
   3. نقع كلية الرأس على مصفاة الخلية باستخدام مكبس المحقنة. استخدم ضغطا برفق لإجبار شظايا العضو على المرور عبر شبكة النايلون ، مما يؤدي إلى تعليق الخلية.
      ملاحظة: في حالة معالجة عينات متعددة ، يمكن تخزين طبق بتري الذي يحتوي على تعليق الخلية في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لبضع دقائق حتى الخطوة التالية. سيتم استخدام تعليق الخلية هذا لعزل الكريات البيض.
2. إجراء الطرد المركزي المتدرج الكثافة.
   1. قم بإعداد محلول متوسط تدرج الكثافة بكثافة 1.077 جم / مل ، والأسمولية 353 mOsm / kg ، ودرجة الحموضة 7.4 (انظر الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: قد تختلف الأسمولية بين أنواع الأسماك المختلفة ، لذلك من الضروري ضبط الأسمولية لمحلول متوسط تدرج الكثافة لتلبية المتطلبات المحددة لكل نوع.
   2. في أنابيب البوليسترين المستديرة القاع سعة 5 مل ، أضف بعناية 600 ميكرولتر من محلول متوسط تدرج الكثافة.
   3. خذ معلق الخلية (2 مل) وأضفه ببطء إلى الأنبوب الذي يحتوي على وسط تدرج الكثافة. القطرة الأولى حاسمة - أضفها برفق شديد لتجنب زعزعة استقرار الطور المتوسط لتدرج الكثافة.
      ملاحظة: يجب أن يتم ذلك بنسبة 3:10 (وسط تدرج الكثافة: تعليق الخلية). استخدم ماصة باستور معقمة سعة 1 مل لإضافة دقيقة ولطيفة. تأكد من أن طرف الماصة يلامس جانب الأنبوب لمنع إزعاج الطبقة المتوسطة المتدرجة للكثافة. تجنب خلط العينة مع وسط تدرج الكثافة.
   4. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 400 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع إيقاف تشغيل الفرامل. هذا يضمن بقاء الطبقات سليمة أثناء العملية.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، يجب أن تكون الطبقات المميزة مرئية. ستشكل الكريات البيض حلقة عند الواجهة بين وسط تدرج الكثافة وحبيبات الحطام الخلوي (الشكل 3).

الشكل 3: حلقة الكريات البيض عند الواجهة بين وسط تدرج الكثافة وحبيبات الحطام الخلوي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

3. اجمع حلقة الكريات البيض.
   1. باستخدام ماصة باستور معقمة، قم بشفط حلقة الكريات البيض برفق (~ 100 ميكرولتر) ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
      ملاحظة: احرص على عدم إزعاج الطبقات بشكل كبير لتجنب التلوث. إذا بدا أن حلقة الكريات البيض تحتوي على حطام أو معلقات داكنة ، فمن المستحسن تمرير معلق الكريات البيض الذي تم جمعه عبر مصفاة خلية صغيرة جديدة (100 ميكرومتر) لضمان النقاء. ضع مصفاة الخلية الصغيرة فوق أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل وانقل تعليق الكريات البيض برفق عبر المصفاة.
4. اغسل حلقة الكريات البيض.
   1. أضف HBSS إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على حلقة الكريات البيض حتى يصل الحجم إلى 2 مل وأعد تعليق الخلايا برفق.
      ملاحظة: احتفظ بالأنابيب في وعاء مملوء بالثلج ومغطى بورق الألمنيوم للحفاظ على العينة عند درجة حرارة منخفضة. تأكد من أن الأنابيب لا تتلامس بشكل مباشر مع الجليد. حافظ على إعداد التبريد هذا طوال عملية الغسيل.
   2. الطرد المركزي للعينات عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية (يمكن تشغيل الفرامل).
   3. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية بعناية ، واترك الحبيبات في الأسفل (والتي قد تكون غير مرئية تقريبا).
   4. كرر خطوات الغسيل (إضافة HBSS ، وإعادة التعليق ، والطرد المركزي ، والتخلص من المادة الطافية) حتى تصبح الحبيبات خالية من الشوائب.
5. إعادة تعليق وضبط تركيز الخلية.
   1. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من HBSS داخل نفس أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل المستخدمة في الغسيل.
   2. حقق تركيزا للخلية بين 1 × 10⁴ و 1 × 10⁶ خلايا لكل مل. إذا كانت الحبيبات الأولية كبيرة ، فقد تكون هناك حاجة إلى HBSS إضافي لتخفيف تركيز الخلية إلى النطاق المطلوب. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وأضف المزيد من HBSS حسب الحاجة بناء على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها.
      ملاحظة: يوصى باستخدام عداد خلوي آلي لتسهيل العملية.

4. تلطيخ وتثبيت الكريات البيض (الشكل 4)

ملاحظة: توفر مجموعات بقع الخلايا الميتة القابلة للإصلاح LIVE / DEAD طريقة محسنة لتقييم صلاحية الخلية في الخلايا الثابتة باستخدام قياس التدفق الخلوي. تستخدم هذه المقايسات صبغة تفاعلية فلورية تتفاعل مع الأمينات الخلوية. إذا تعرضت أغشية الخلايا للخطر ، يمكن للصبغة أن تخترق الخلايا ، وتتفاعل مع الأمينات الحرة داخل الخلية وعلى سطح الخلية ، مما يؤدي إلى تلطيخ الفلورسنت الشديد. على العكس من ذلك ، في الخلايا القابلة للحياة ، تتوفر فقط الأمينات على سطح الخلية للتفاعل مع الصبغة ، مما يؤدي إلى تلطيخ خافت نسبيا. يتم الحفاظ على شدة التلوين بعد التثبيت بالفورمالديهايد ، والذي يحافظ أيضا على العينة عن طريق منع نمو الكائنات الحية الدقيقة. مجموعات بقع الخلايا الميتة القابلة للإصلاح LIVE / DEAD متطابقة باستثناء صبغة الفلورسنت - متوفرة باللون الأزرق أو البنفسجي أو المائي أو الأصفر أو الأخضر أو الأحمر أو الأحمر البعيد أو الأشعة تحت الحمراء القريبة (الأشعة تحت الحمراء). في هذه الدراسة ، استخدمنا صبغة الفلورسنت التفاعلية Near-IR. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا الاختبار أحادي اللون باختبار المعلمات الأخرى بالتوازي في تجربة متعددة الألوان.

1. تحضير الصبغة.
   1. أحضر الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة (RT): اسمح لقارورة واحدة من الصبغة التفاعلية الفلورية وقارورة ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائية (DMSO) للوصول إلى RT قبل إزالة الأغطية.
   2. أعد تكوين الصبغة: أضف 50 ميكرولتر من DMSO إلى القارورة التي تحتوي على الصبغة التفاعلية. تخلط جيدا وتأكدي من ذوبان الصبغة تماما.
   3. استخدم محلول الصبغة المعاد تكوينه في أسرع وقت ممكن ، ويفضل أن يكون ذلك في غضون ساعات قليلة.
      ملاحظة: تشتمل كل مجموعة على خمس قوارير فردية من الصبغة التفاعلية ، مما يوفر مادة كافية لتلطيخ ما لا يقل عن 40 عينة من الخلية. ومع ذلك ، بعد إعادة التكوين ، يكون محلول DMSO للصبغة غير مستقر نسبيا ، خاصة عند تعرضه للرطوبة. يمكن تخزين أي أجزاء غير مستخدمة لمدة تصل إلى أسبوعين عند ≤-20 درجة مئوية ، محمية من الضوء والرطوبة.
2. وصمة عار وإصلاح الخلايا.
   ملاحظة: تشمل المخازن المؤقتة المناسبة لتلوين الخلايا محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، و D-PBS (D-PBS) من Dulbecco ، طالما أنها لا تحتوي على بروتينات غريبة مثل ألبومين مصل الأبقار أو المصل. عند استخدام صبغة متفاعلة أمينية، تجنب مخازن ومحاليل تريس التي تحتوي على أزيد الصوديوم أو البروتين الدخيل لإعادة تعليق الخلايا وغسلها. في هذه الدراسة ، استخدمنا HBSS نظرا لتركيبته الأيونية المتوازنة ، مما يساعد على الحفاظ على التوازن التناضحي ويوفر الأيونات الأساسية والجلوكوز لدعم عملية التمثيل الغذائي للخلايا وقابليتها للحياة أثناء عملية التلوين. HBSS أيضا خالي من البروتينات الدخيلة ، مما يمنع التداخل مع الصبغة التفاعلية ويضمن تقييما دقيقا للبقاء.
   1. بعد عد الخلايا وضبط الكثافة إلى 1 × 10⁶ خلايا لكل مل باستخدام HBSS ، قم بنقل 1 مل من تعليق الخلية هذا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل.
      1. لكل يوم ، قم بتحفيز موت الخلايا في عينة واحدة على الأقل لاستخدامها كعنصر تحكم لتحديد عتبة شدة التألق بين الخلايا الحية والميتة. تحضير العينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على النحو التالي:
         الأنبوب 1: الخلايا الحية - غير ملوثة
         الأنبوب 2: الخلايا الحية - ملطخة
         الأنبوب 3: الخلايا الميتة - غير ملوثة
         الأنبوب 4: الخلايا الميتة - ملطخة
         ملاحظة: تحتاج هذه الأنابيب الأربعة فقط إلى التحضير لعينة واحدة في كل تجربة كعناصر تحكم. بالنسبة للعينات المتبقية ، هناك أنبوبان فقط ضروريان (الأنبوب 1: عينة - غير ملوثة والأنبوب 2: عينة - ملطخة) ، حيث سيوفر معلومات حول الخلايا التي كانت حية وتلك التي كانت ميتة.
   2. التحكم الإيجابي في موت الخلايا: ضع الأنبوب المسمى ميت غير ملطخ (الأنبوب 3) والملطخ الميت (الأنبوب 4) في حمام مائي عند 50 درجة مئوية لمدة 7 دقائق للحث على موت الخلايا عن طريق المعالجة الحرارية.
   3. تلطيخ الخلايا: أضف 1 ميكرولتر من الصبغة التفاعلية الفلورية المعاد تكوينها (من الخطوة 4.1.2) إلى 1 مل من تعليق الخلية في الأنبوبين 2 و 4 (الأنابيب التي سيتم تلطيخها) واخلطها جيدا.
   4. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة ، محمية من الضوء.
      ملاحظة: إذا لم يكن التثبيت مطلوبا، فيمكنك تخطي الخطوات 4.2.5-4.2.7 أدناه. بدلا من ذلك ، اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من HBSS مع 1٪ ألبومين مصل بقري (انظر الملف التكميلي 1) وأعد تعليقه في 1 مل من HBSS مع 1٪ زلال مصل البقري. إجراء التحليل على مقياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن ؛ خلاف ذلك ، قد تتعرض صلاحية الخلية للخطر لأن الخلايا غير ثابتة.
   5. اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من HBSS وأعد تعليق الخلايا في 900 ميكرولتر من HBSS.
   6. أضف 100 ميكرولتر من 37٪ فورمالديهايد (تنبيه ، انظر الجدول التكميلي 2).
   7. احتضن لمدة 15 دقيقة في RT.
   8. يغسل مرتين ب 1 مل من HBSS مع 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) ، ثم يعلق الخلايا في 1 مل من HBSS مع 1٪ BSA.
   9. قم بتخزين العينات في الثلاجة عند 4 درجات مئوية. تحليل الخلايا في غضون 1 شهر بعد التثبيت.
   10. قم بتحليل تعليق الخلية الثابتة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام قناة الإثارة والكشف المناسبة.
       ملاحظة: قد تختلف قنوات الإثارة والكشف الصحيحة بناء على الأداة المستخدمة (انظر الجدول التكميلي 3).

الشكل 4: وصف توضيحي لتلوين وتثبيت الكريات البيض. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

5. قياس التدفق الخلوي

1. الحصول على البيانات.
   ملاحظة: قد تختلف الإجراءات التي يجب اتباعها على مقياس التدفق الخلوي اعتمادا على مقياس الخلوي المحدد المستخدم. في هذه الدراسة ، تم الحصول على البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي Attune NTx.
   1. تشغيل العينات.
   2. ضع أنبوب العينة في منفذ العينة.
   3. ابدأ الاستحواذ بالضغط على ابدأ ثم انقر فوق تسجيل بمجرد استقرار معدل الحدث (الأحداث / الثانية).
   4. سجل ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة في بوابة المفردات لتحليل موثوق.
   5. احفظ جميع البيانات لكل عينة وقم بنسخها احتياطيا على محركات أقراص خارجية أو تخزين سحابي.
2. تحليل البيانات.
   ملاحظة: لتحليل قياس التدفق الخلوي ، تتوفر العديد من خيارات البرامج. في هذه الدراسة ، تم إجراء تحليل البيانات باستخدام FlowJo v10.8.1¹⁹.
   1. تحميل ملفات البيانات: قم بتشغيل برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي وقم بتحميل ملفات .fcs المكتسبة من التجربة.
   2. تصور البيانات (الشكل 5 أ): رسم التشتت الأمامي (FSC-A) (XX) مقابل الانتثار الجانبي (SSC-A) (YY) لتقييم حجم الخلية وحدبتها.
      ملاحظة: تستخدم هذه المؤامرة بشكل شائع لتحديد مجموعات الخلايا واستبعاد الحطام بناء على خصائص التشتت.
   3. استبعاد بوابات الخلية المفردة والمضاعفات (الشكل 5 ب): استخدم مخطط منطقة التشتت الأمامي (FSC-A) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) لاستبعاد المضاعفات. ارسم بوابة لتضمين جميع الأحداث المحاذاة في الرسم البياني (الخلايا المفردة) واستبعاد الأحداث غير المحاذاة (المتعددات). إذا كانت العينة تحتوي على أحداث ذات FSC منخفض جدا ، فاستبعدها بعدم تضمينها في بوابة الخلية الفردية ، مع الإبقاء على الخلايا المفردة فقط.
   4. تحديد مجموعات الكريات البيض (الشكل 5 ج): قم بتمييز 3 مجموعات من الكريات البيض بناء على ملف تعريف FSC-A / SSC-A: FSC-A^HIGH / SSC-A^هي الخلايا الحبيبية ،^ومتوسط FSC-A / SSC-A هو الخلايا الوحيدة و FSC-A^منخفضة / SSC-A^منخفضة هي الخلايا الليمفاوية.
   5. بوابة الجدوى (الشكل 5 د): قم بإعداد عتبة تلطيخ صبغة الجدوى على قناة التألق المقابلة (NIR ، RL3-A). يتم تعريف الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة بناء على شدة التلوين باستخدام صبغة الخلايا الميتة القابلة للإصلاح الحية / الميتة: يتم تعريف الخلايا الملطخة الخافتة على أنها الخلايا الحية ، ويتم تعريف الخلايا الملطخة بشدة على أنها خلايا ميتة.
   6. الإحصاءات السكانية: انظر إلى الإحصائيات التي يوفرها البرنامج ، بما في ذلك إجمالي الأحداث (الخلايا) في كل بوابة والنسب المئوية للخلايا الإجمالية والمسورة.
   7. تصدير البيانات: قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات واستخدم البرامج الإحصائية المناسبة (GraphPad Prism أو R) لمزيد من التحليل الإحصائي.
      ملاحظة: يعتمد اختيار طرق التحليل على أهداف البحث.

الشكل 5: استراتيجية بوابات قياس التدفق الخلوي لتقييم الجدوى في خلايا الكلى الرئيسية: (أ) يمثل ملف تعريف FSC-A / SSC-A لجميع الأحداث التي تم جمعها. (ب) يمثل استبعاد المضاعفات بناء على تعريف منطقة المفردات على أساس الخطية على الرسم البياني للتبعثر الأمامي (FSC-A)/الانتثار الأمامي (FSC-H). (ج) يمثل المجموعات السكانية الرئيسية الثلاثة التي تم تعريفها على أساس FSC-A/SSC-A، بعد استبعاد المضاعفات. (د) يمثل رسما بيانيا يوضح تلطيخ صبغة البقاء الحية / الميتة. لإعداد العتبة التي تسمح بالتمييز بين الخلايا الحية والميتة ، تم إخضاع الكريات البيض لصدمة حرارية خفيفة (50 درجة مئوية ، 7 دقائق) ثم تلطيخها بصبغة البقاء. الخلايا عالية الشدة الموجبة (++) هي الخلايا الميتة ، والخلايا الموجبة منخفضة التلوين (+-) هي الخلايا الحية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

يقدم الشكل 6 بيانات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي توضح مجموعات الكريات البيض المعزولة من كلية الرأس من الدنيس الصغير (Sparus aurata) وقابليتها للحياة الخلوية باستخدام البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة. يقارن الشكل عينتين: واحدة ذات قابلية خلوية عالية ، حيث تعرضت الأسماك للظروف المثلى (الشكل 6 أ) ، والأخرى ذات قابلية خلوية منخفضة ، حيث تعرضت الخلايا للإجهاد الحراري (الشكل 6 ب).

في كلتا العينتين ، حددت الطريقة الحالية بشكل فعال ثلاثة مجموعات رئيسية من الكريات البيض: الخلايا الليمفاوية (LY) ، والخلايا الوحيدة (MO) ، والخلايا المحببة (GR). تم تمييز هذه المجموعات بناء على الاختلافات في حجم الخلية وتعقيدها ، كما يتضح من مخططات التشتت الأمامي (FSC-A) والمبعثر الجانبي (SSC-A). يشير التشتت الأمامي (FSC-A) إلى الحجم النسبي للخلية ، بينما يعكس التشتت الجانبي (SSC-A) التعقيد الداخلي أو الدقة للخلايا ، مما يسمح بفصل واضح للمجموعات. في ظل الظروف المثلى (الشكل 6 أ) ، تم توزيع مجموعات الكريات البيض على النحو التالي: LY بنسبة 31.0٪ ، MO بنسبة 38.0٪ ، والموارد الوراثية بنسبة 31.0٪. ومع ذلك، لوحظ تحول في العينة المعرضة للإجهاد الحراري (الشكل 6 ب)، مع انخفاض نسبة الكثافة السكانية إلى 21.3٪، وزيادة معدل الكثافة الوراثية إلى 45.6٪، وظل الموارد الوراثية مستقرة نسبيا عند 33.1٪.

يكشف التحليل الإضافي لصلاحية الخلية ، المفصل في الشكل 6 أ1-A3 والشكل 6 ب1-ب 3 ، عن تباين كبير بين العينتين. كما يمكن ملاحظته ، أظهرت العينة المعرضة للظروف المثلى (الشكل 6 أ) قابلية أعلى للحياة ، مع غلبة الخلايا الحية (الممثلة باللون الأزرق) عبر جميع مجموعات الكريات البيض. في المقابل ، أظهرت العينة المجهدة حراريا (الشكل 6 ب) زيادة كبيرة في موت الخلايا (تلطيخ أكثر كثافة موضح باللون الأحمر) ، حيث أظهر LY 50.7٪ موت الخلايا ، MO 83.7٪ ، و GR 84.5٪.

بشكل عام ، توضح النتائج بوضوح فعالية البروتوكول في كل من عزل وتحليل مجموعات الكريات البيض وتقييم صلاحية الخلية. علاوة على ذلك ، توفر البيانات رؤى قيمة حول كيفية تأثير الظروف المجهدة ، مثل التعرض الحراري ، على ديناميكيات أعداد الكريات البيض وقابلية الخلايا للبقاء. تشير التحولات الملحوظة في توزيع الخلايا وقابليتها للحياة تحت الضغط إلى أن التعرض الحراري لا يعطل توازن مجموعات الكريات البيض فحسب ، بل يضر أيضا بصحة الخلايا. قد تشير هذه التغييرات إلى استجابة مناعية للإجهاد ، مما يشير إلى آلية دفاع نشطة ناتجة عن الضغوطات البيئية.

الشكل 6: مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي توضح تحديد وصلاحية مجموعات مختلفة من الكريات البيض من كلية رأس الدنيس المذهب (Sparus aurata): (أ) عينة ذات قابلية عالية للخلايا ، معرضة للظروف المثلى: تظهر اللوحة اليسرى بوابة مجموعات الكريات البيض بناء على FSC-A / SSC-A ، وتحديد الخلايا الليمفاوية (LY) ، والخلايا الوحيدة (MO) ، والخلايا الحبيبية (GR) ؛ جدوى LY (A.1) و MO (A.2) و GR (A.3). (ب) عينة ذات قابلية منخفضة للخلايا ، معرضة للإجهاد الحراري: تظهر اللوحة اليسرى بوابات مجموعات الكريات البيض بناء على FSC-A / SSC-A ، وتحديد الخلايا الليمفاوية (LY) ، والخلايا الوحيدة (MO) ، والخلايا الحبيبية (GR) ؛ جدوى LY (B.1) و MO (B.2) و GR (B.3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

الشكل التكميلي 1: صورة تمثيلية لخزان الحجر الصحي بسعة إجمالية تبلغ 660 لترا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: صورة لإعداد نظام RAS. (1) بروفيلوكس. (2) المصابيح. (3) أحواض السمك / الدبابات. (4) ثلاجة. (5) صنابير مدخل المياه في أحواض السمك. (6) سيفون أزرق لمنافذ مياه حوض السمك. (7) الغطاء. (8) مقشدة البروتين. (9) مرشح ميكانيكي (كيس فلتر) ؛ (10) مرشح ميكانيكي (إسفنجة زرقاء + صوف زجاجي) ؛ (11) مرشح بيولوجي (الكرات الحيوية) ؛ (12) ترموستات. (13) المضخة الرئيسية (14) معقم للأشعة فوق البنفسجية. (15) مستشعر درجة الحرارة (أ) مرشح ميكانيكي (إسفنجة زرقاء) ؛ (ب) مرشح ميكانيكي (صوف زجاجي). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: تكوين المكونات (٪) والتحليل القريب (٪ DM) للنظام الغذائي التجريبي المستخدم في الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: الكواشف المستخدمة في البروتوكول: المخاطر الصحية ، وبيانات المخاطر ، والبيانات التحذيرية ، وتدابير الإسعافات الأولية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 3: قنوات الإثارة والكشف المناسبة لاستخدامها مع بقع الخلايا الميتة LIVE / DEAD القابلة للإصلاح التفاعلية مع الأمين. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: حسابات إعداد الحلول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تمثل الطريقة التي تم تطويرها في هذه الدراسة تقدما كبيرا في أبحاث مناعة الأسماك وتعد بتحسين فهم الاستجابات المناعية للأسماك واستدامة الموارد البحرية. S. aurata هو نوع قيم من الأسماك البحرية من عائلة Sparidae يعمل ككائن حي نموذجي مثالي لعدة أسباب ، بما في ذلك أهميته البيئية والاقتصادية ، فضلا عن تعدد استخداماته في الأبحاث المختبرية عبر العديد من مجالات الدراسة مثل علم وظائف الأعضاء والمناعة وعلم السموم وتربية الأحياء^{المائية 20}. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل S. aurata في سهولة التعامل معها وتربيتها في المختبر ، مع بروتوكولات تربية راسخة تضمن ظروفا تجريبية متسقة وقابلة للتكرار²¹. علاوة على ذلك ، فإن قدرتها على التكيف البيئي (أي تحمل كبير لمجموعة واسعة من الظروف البيئية ، مثل تقلبات درجات الحرارة والملوحة) تجعلها مرشحا مثاليا للدراسات التي تهدف إلى تحسين تقنيات الزراعة وتقييم الآثار البيئية على الكائنات البحرية²². S. aurata ، بنظامها المناعي المميز جيدا وتوافر البيانات الجينومية ، تسمح بإطلاق العنان للاستجابات المناعية للأسماك ، ومقاومة مسببات الأمراض ، وفعالية اللقاح ، والصحة العامة²⁰. نظرا لأهميته في تربية الأحياء المائية ، وكذلك في العادات الغذائية لسكان جنوب أوروبا ، يمكن للبحث عن هذا النوع أن يؤثر بشكل مباشر على الممارسات الزراعية ، وتعزيز إنتاجه واستدامته مع معالجة التحديات البيئية داخل الصناعة²⁰.

بهذا المعنى ، يقدم هذا البروتوكول العديد من المزايا والتطبيقات المحتملة في مجالات البحث المختلفة ، مثل: (ط) علم مناعة الأسماك: يوفر تحليلا دقيقا ومفصلا للخلايا المناعية من كلية رأس المكورات العنقودية الذهبية ، مما يسمح بتحديد وتوصيف مجموعات الكريات البيض المختلفة ، بالإضافة إلى تقييمات قوية لصلاحية الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. (2) بحوث الاستزراع المائي: ضرورية لدراسة تقنيات الاستزراع والتغذية وإدارة الأمراض، ودعم البحوث المستقبلية الرامية إلى تقليل الاعتماد على المضادات الحيوية والمعالجات الكيميائية، وبالتالي تعزيز ممارسات الاستزراع المائي الأكثر استدامة؛ (ثالثا) علم السموم الإيكولوجية: ذو قيمة في تقييم الآثار الناجمة عن الملوثات وغيرها من الضغوطات البيئية على صحة المناعة للأسماك، وتوفير البيانات لتقييم المخاطر البيئية وصياغة اللوائح الوقائية للنظم الإيكولوجية المائية؛ (رابعا) علم وظائف الأعضاء المقارن: يسمح للباحثين بمتابعة التكيفات التطورية لأجهزة المناعة مع التحديات البيئية المختلفة ، مما يوفر فهما أعمق للأساس الجيني والفسيولوجي لوظيفة المناعة ؛ (ت) البيولوجيا والبيئة البحرية: تحسين فهم الأدوار والتفاعلات الإيكولوجية للبكتيريا العنقودية الهاوية، وتوفير رؤى حول توزيع الأنواع، وتفضيلات الموائل، وتأثير التغيرات البيئية على التنوع البيولوجي البحري؛ (سادسا) البحوث الطبية الحيوية: غالبا ما تستخدم الأسماك بشكل متزايد ككائنات نموذجية في البحوث الطبية الحيوية. يمكن أن يساعد عزل الخلايا المناعية وتحليلها في فهم الجوانب الخلوية والجزيئية الحاسمة لاكتشاف الأدوية وحتى الطب.

لسنوات عديدة ، اعتمد القياس الكمي للكريات البيض وتحديدها في الأسماك على تقنيات أمراض الدم التقليدية ، مثل العد اليدوي باستخدام مقاييس الدم Bürker أو Neubauer أو Thoma ، بالإضافة إلى مسحات الدم الملطخة^10،12. تم تقييم صلاحية الخلية أيضا باستخدام اختبار استبعاد التريبان الأزرق ، متبوعا بالفحص المجهري^{15،22،23،24،25،26،27،28}. في حين أن هذه الأساليب ساهمت في فهمنا لمناعة الأسماك ، إلا أن لها العديد من القيود. كان عد الكريات البيض اليدوي يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة ، وغالبا ما تتأثر دقة هذه التقنيات بسبب تباين المشغل والخطأ البشري ، مما أثر بشكل كبير على اتساق النتائج¹⁰.

في عام 1994 ، Esteban et al. أحدث ثورة في تحليل كريات البيض للأسماك من خلال إدخال تقنية لتقييم آلية الدفاع البلعمية في سمك القاروص (Dicentrarchus labrax)²³. في دراستهم ، تم عزل الكريات البيض من الدم المحيطي والرأس والكلى والإفرازات البريتونية باستخدام الطرد المركزي المتدرج بكثافة بيركول²³. يمثل هذا التقدم المنهجي قفزة كبيرة إلى الأمام ، مما عزز دقة وموثوقية تحليل الكريات البيض. بعد العمل الرائد ل Esteban et al. ، هدفت الدراسات اللاحقة إلى تحسين وتحسين تقنيات قياس التدفق الخلوي لتحليل الكريات البيض ، مع التركيز على جوانب مختلفة مثل توصيف مجموعة الخلايا^{6،15،16،28،29} ، وقابلية الخلية^{للحياة 3،6،27،28} ، ونشاط البلعمة^{6،23 ،24،27،28}. أدى التقدم في إجراءات العزل ، بما في ذلك استخدام وسائط التدرج المختلفة (على سبيل المثال ، Ficoll مقابل Percoll) وبروتوكولات الطرد المركزي المحسنة ، إلى تحسين نقاء وإنتاجية الكريات البيض المعزولة^1،8،14،26. أدى تطوير تقنيات التلوين المتقدمة واستخدام الأصباغ الفلورية ، مثل يوديد البروبيديوم (PI) و 3،3'-Dihexyloxacarbocyanine يوديد (DiOC₆ (3)) إلى تمكين تمييز أكثر دقة بين الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، بالإضافة إلى التوصيف التفصيلي لمجموعات الكريات البيض ، على التوالي^16،30. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على التمييز في وقت واحد بين مجموعات الكريات البيض المختلفة (الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والخلايا الحبيبية) وتقييم صلاحية الخلايا لكل مجموعة. يسمح ذلك للباحثين بتحديد المجموعات السكانية الأكثر تضررا في ظل ظروف معينة ، مما يوفر رؤى أعمق للاستجابة المناعية والكشف عن المجموعات الفرعية الأكثر ضعفا من الكريات البيض ومع ذلك ، على الرغم من هذه التحسينات ، لا تزال الأساليب الحالية تواجه قيودا. ركزت معظم الأبحاث على الأسماك البالغة ، مما ترك فجوة في دراسة مراحل الأحداث. تمثل الأسماك الصغيرة تحديات فريدة لاستخراج الكريات البيض نظرا لصغر حجمها وصعوبة الحصول على عينات عالية الجودة من أعضائها المناعية الأصغر نسبيا¹⁷. تتناول الدراسة الموضحة هنا هذه المشكلات على وجه التحديد من خلال تحسين بروتوكول الأسماك الصغيرة ، وتعديل نسبة تعليق الخلية ، وحل Percoll لتحسين جودة استخراج الكريات البيض بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون الطرق الحالية محدودة بعدد العينات أو التكرارات التي يمكن معالجتها في وقت واحد بسبب الحاجة الفورية لتقييم صلاحية الكريات البيض. يمكن أن يؤثر أي تأخير في معالجة العينات سلبا على بقاء الخلية ، مما يعقد عملية أخذ العينات ويحتمل أن يضر بالنتائج. للتغلب على هذا القيد ، تقدم هذه الدراسة استخدام تقنية تلطيخ جديدة تسمح بتثبيت الخلايا وتحليلها حتى شهر واحد بعد التثبيت. يوفر هذا الابتكار مرونة أكبر في جداول أخذ العينات ، مما يسمح للباحثين بمعالجة العينات وتحليلها في الوقت الذي يناسبهم ، مما يحسن بشكل كبير من سير العمل وموثوقية تقييمات قياس التدفق الخلوي.

يعتمد نجاح هذا البروتوكول على عدة خطوات حاسمة ، كل منها يتطلب تنفيذا دقيقا لضمان سلامة وصلاحية الكريات البيض ، والتي يتم تحليلها لاحقا عن طريق قياس التدفق الخلوي. يعد التحضير الصحيح لمحلول القتل الرحيم وتعديل درجة الحموضة أمرا بالغ الأهمية للقتل الرحيم الفعال. قد تؤدي المحاليل المعدة بشكل غير صحيح إلى القتل الرحيم غير الكامل أو الضغط الإضافي على الأسماك¹⁸. يعد التشريح الدقيق والدقيق لكلية الرأس أمرا حيويا لتجنب التلوث. يعد الحفاظ على العقم وسلامة الأنسجة أمرا بالغ الأهمية للحصول على عينات بيضاء عالية الجودة. يجب ضبط الكثافة والأسمولية ودرجة الحموضة لمحلول Percoll بشكل صحيح لفصل الكريات البيض بكفاءة. يعد شفط حلقة الكريات البيض برفق باستخدام ماصة معقمة أمرا بالغ الأهمية لتجنب تلوث واضطراب طبقات التدرج. يعد الغسيل الفعال للخلايا بعد التجميع أمرا ضروريا لإزالة بقايا بيركول والشوائب الأخرى. يضمن تكرار عملية الغسيل وجود حبيبات خلية نظيفة جاهزة للتثبيت. يجب تحضير الصبغة التفاعلية مباشرة قبل الاستخدام لضمان فعاليتها ، لأن التعامل غير السليم يمكن أن يضر بثباتها. تعد إضافة الصبغة المناسبة ووقت الحضانة أمرا بالغ الأهمية للتمييز بدقة بين الخلايا الحية والميتة. يعد تثبيت الخلايا بنسبة 3.7٪ فورمالديهايد خطوة حاسمة للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا وضمان التحديد الدقيق للخلايا الميتة. يجب أن يكون تركيز الفورمالديهايد دقيقا ، ويجب اتباع أوقات الحضانة بدقة لتجنب النتائج غير الدقيقة. يعد غسل الخلايا بعد التثبيت أمرا مهما لإزالة أي صبغة زائدة وفورمالديهايد ، مما قد يتداخل مع التحليل اللاحق. يعد التخزين السليم للعينات الثابتة وتحليلها في الوقت المناسب ضروريين للحفاظ على دقة البيانات. يعد ضبط قنوات الإثارة والكشف لتتناسب مع الصبغة المحددة المستخدمة أمرا ضروريا للحصول على نتائج دقيقة لقياس التدفق الخلوي.

على الرغم من مزاياها العديدة ، إلا أن هذه الطريقة لها بعض القيود التي يجب مراعاتها. أحد القيود الرئيسية هو طبيعته الخاصة بالأنواع ، حيث تم تحسين البروتوكول لسمك الدنيس الصغير (S. aurata) ، وهي سمكة بحرية. هذا يعني أن فعاليته قد تختلف عند تطبيقه على أنواع الأسماك الأخرى ، وخاصة أسماك المياه العذبة. قد تتطلب الاختلافات في التوازن التناضحي بين أنواع المياه البحرية والمياه العذبة تعديلات على المحاليل المستعملة في البروتوكول ، حيث أن المحاليل المناسبة للظروف المالحة قد لا تكون مناسبة لأنواع المياه العذبة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتطلب الاختلافات في بنية الأنسجة وكثافة الخلايا والاستجابات الفسيولوجية تعديلات على البروتوكول ، مما قد يؤثر على قابلية التكاثر والاتساق عبر الأنواع المختلفة.

عامل مهم آخر هو صيانة الأسماك قبل جمع العينات. لكل نوع ظروف مائية مثالية محددة ضرورية للحفاظ على صحة الأسماك وضمان جودة النتائج^{التجريبية 20}. يمكن أن تؤثر الاختلافات في المعلمات مثل درجة الحرارة والملوحة ودرجة الحموضة على بقاء الخلية وجودة البيانات ، حيث قد تؤدي الظروف دون المستوى الأمثل إلى إجهاد فسيولوجي يضر بسلامة الخلية. لضمان نتائج تجريبية متسقة ، من المهم الحفاظ على جميع التكرارات في ظل نفس الظروف الخاضعة للرقابة ، سواء كانت مثالية أو دون المستوى الأمثل عن قصد (اعتمادا على أهداف الدراسة).

يمكن أن يؤثر التباين في تقنيات المناولة والتشريح أيضا على جودة وكمية كريات البيض في كلى الرأس ، مما يجعل مهارة وخبرة المشغل عاملا حاسما لنجاح البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يمثل الحفاظ على صلاحية الخلية طوال عملية العزل تحديا ، حيث يمكن أن يؤدي أي تأخير بين القتل الرحيم وتثبيت الخلايا إلى انخفاض قابلية البقاء والنتائج المتحيزة. تعد المعالجة الفورية للأنسجة والخلايا ضرورية للحفاظ على قابلية عالية للخلايا ، ولكن قد يكون من الصعب تحقيق هذا المطلب باستمرار ، خاصة عند العمل مع عدد كبير من العينات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air Stones	N/A	N/A
Aquafeed	SPAROS, Lda., Portugal	N/A	High-quality diet
Automatic Cell Counting Equipment	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE automatic cell counter (NanoEnteK)
Automatic Water Refrigeration Systems	Foshan Weinuo Refrigeration Equipment Co., Ltd, China	N/A
Bio balls 1.5" Aquarium Pond Filter	TMC Iberia, Portugal	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Germany	A7906
Bucket (3 L)	N/A	N/A	To prepare and carry out euthanasia
Buckets (5 L)	N/A	N/A	To transport the animals
Cell Strainers	Jetbiofil, China	CSS-013-100	Cell Strainer, 100 μm nylon mesh, Sterile, Yellow
Centrifugue	Fisher Scientific, Germany	N/A	accuSpin Micro 17 R
Colorimetric Test Kit for Ammonia (NH4+/NH3)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrate (NO3-)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrite (NO2-)	Tropic Marin, USA	N/A
Computer	N/A	N/A	To acquire and analyse the data obtained from the flow cytometer
Computerized Control System (Profilux)	GHL, Germany	N/A	ProfiLux 3 Outdoor
Deionized water	N/A	N/A	To clean the Flow Cytometer
Density Gradient Medium: Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany	17-0891-01
Digital scale	KERN & Sohn GmbH, Germany	N/A	KERN EMS 300-3
Ethanol 70%	Millipore, Supelco, Portugal	EX0281	To keep the workspace clean
EVE Cell Counting Slides	NanoEnteK, Korea	N/A
Falcon Tubes (15 mL)	pluriSelect Life Science, Germany	05-00002-01	Sterile
Filter bag	TMC Iberia, Portugal	N/A	400 micron
Filter Sponge	N/A	N/A
Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune flow cytometer
FlowJo v10.8.1 Software	BD Life Sciences	N/A
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich, Germany	8.18708
Glass Wool	N/A	N/A
Hanks' Balanced Salt Solution	Merck Life Science S.L, Portugal	H6648	Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits	Life Technologies Europe, Netherlands	L10119	Near-IR fluorescent reactive dye + DMSO
Main Water Pumps	EHEIM, Germany		Universal 1200
Microcentrifuge Tubes (2 mL)	BRAND, Merck, Germany	Z628034	Sterile
Micropipette Tips	Sartorius, Germany	790010, 790200, 791000	Compatible with Sartorius, 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Micropipettes	Sartorius, Germany	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Mini Cell Strainers	pluriSelect Life Science Global Headoffice, Germany	43-10100-50	PluriStrainer 100 µm nylon mesh, Sterile
Multi-Parameter Measuring Instrument	WTW, Germany		Multi 3420 SET G + IDS digital conductivity cell (TetraCon 925) + Optical IDS DO sensor (FDO 925) + IDS pH-electrode (SenTix 940)
Pasteur Pipettes (1 mL, 5 mL)	Humeau Expert du laboratoire, France	248295	Sterile
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1194.500	60 x 15 mm, Polystyrene, Sterile
pH Meter	Hanna Instruments Inc., Romania		HANNA HI2211
Polystyrene round-bottom Falcon tubes (5 mL)	Fisher Scientific, Germany	14-959-2A	Sterile
Portable Precision Thermometer	Ebro Electronic, Germany	N/A	TFX 430
Protein Skimmers	Mantis	N/A	Tornado 120
Quality control beads/Performance test beads	Thermofisher Scientific, USA	N/A
Quarantine Tanks	N/A	N/A	Tanks with 660 L total volume
Rectangular Glass Tanks/Aquariums	N/A	N/A	Tanks with 200 L total volume
Refrigerator	N/A	N/A	To store the samples at 4 °C
Ruler 30 cm	N/A	N/A	To measure the fish's length
Sodium bicarbonate	Honeywell Fluka, Germany	31437	Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sterile Dissection Tools	N/A	N/A	(e.g. scalpel, scissors, fine-tipped forceps, dissecting tray/board)
Submerged Digital Heaters	TMC Iberia, Portugal		300 W, V2Therm Digital Heaters
Syringes 1 mL	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	Sterile, HSW Soft-Ject Syringes to macerate head-kidney
Temperature Sensors	GHL, Germany		PT 1000
Tricaine (MS-222)	ThermoFisher Scientific, Germany	118000500	Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt, 98% (C10H15NO5S)
Ultraviolet Water Sterilizer	EHEIM, Germany	5305010	ClearUVC-36
Water Bath	Fisher Scientific, Germany	N/A	Fisherbrand IsotempTM (P/N U01318)
Water-resistant Luminaires	N/A	N/A