유세포 분석에 의한 Juvenile Gilthead Seabream Head Kidney Leukocytes 의 분리, 고정 및 특성화

요약

이 원고는 길트헤드 도미의 머리-신장에서 추출한 백혈구의 분리 및 고정과 유세포 분석을 통한 생존력 평가를 설명합니다. 이 작업은 프로토콜의 표준화에 기여하고 샘플 품질을 손상시키지 않으면서 더 많은 수의 샘플을 처리하는 데 활용되어 어류 면역학 지식의 발전을 촉진합니다.

초록

면역은 유기체의 생리적 조절에 결정적인 역할을 하며, 병원체와 환경 스트레스 요인에 대한 1차 방어 역할을 합니다. 면역 세포의 분리 및 분석은 외부 압력에 대한 면역 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 그러나 해양 어류와 같이 연구가 덜 된 종에 대한 조화로운 프로토콜이 부족하기 때문에 데이터 해석과 종별 면역 반응에 대한 철저한 이해를 방해하는 기술 및 분석 문제가 발생하는 경우가 많습니다. 이 연구는 어린 귀도미(Sparus aurata)의 머리 신장(teleost fish의 주요 조혈 기관)에서 백혈구의 생존 능력을 특성화하고 결정하기 위해 최적화된 유세포 분석 기반 분석 절차를 설정하는 것을 목표로 했습니다. 이 절차는 Hanks의 균형 염 용액을 사용한 균질화 공정을 통해 백혈구를 분리하는 것으로 시작되었으며, 효율적인 후속 유세포 분석에 필요한 적혈구 오염을 최소화하면서 백혈구의 높은 회수율을 보장하기 위해 최적화된 Percoll 밀도 구배 원심분리 방법이 이어졌습니다. 또한 세포 반응성 염료(LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit)를 사용하는 새로운 기술을 사용하여 형광 염색 패턴을 기반으로 생존 세포와 사멸 세포를 구별했습니다. 3.7% 포름알데히드로 고정이 이루어졌으며 세포 형태, 생존력 및 염색 효율이 보존되었습니다. 유세포 분석 분석은 3가지 우세한 백혈구 집단인 림프구, 단핵구, 과립구를 성공적으로 식별했습니다. 이 방법을 통해 생존 능력을 시험할 수 있었을 뿐만 아니라 세포 유형을 정확하게 구별할 수 있었습니다. 유세포 분석 프로토콜의 개선은 면역 세포 분석의 정확성과 효율성을 높임으로써 어류 면역학의 한 걸음을 의미합니다. 또한 이 프로토콜은 추후 분석을 위해 세포를 고정할 수 있도록 함으로써 면역 평가에 필요한 시간과 노력을 크게 줄여 다양한 연구 분야의 연구 및 실제 응용 모두에 유용한 도구가 됩니다.

서문

면역은 유기체의 생리적 조절에 중심적인 역할을 하며, 다양한 병원체와 환경적 스트레스 요인에 대한 일차적인 방어 역할을 합니다¹. 다른 척추동물과 마찬가지로 물고기는 전반적인 건강과 웰빙에 필수적인 복잡하고 역동적이며 조정된 면역 체계를 가지고 있습니다¹.

텔레오스트 어류는 선천면역계와 후천면역계를 모두 가지고 있으며, 이 면역체계는 해로운 침입자를 탐지하고, 대응하고, 무력화하는 기능을 동시에 합니다². 선천면역체계(innatureimmune system)는 1차 방어선 역할을 하여 병원체에 대한 즉각적이고 비특이적인 반응을 보^이며2, 적응면역체계(adaptive immune system)는 시간이 지남에 따라 발달하여 물고기가 특정 병원체를 인식하고 면역기억을 형성할 수 있도록 보다 전문화된 반응을 제공합니다³. 어류의 면역 체계는 면역 방어를 지원하고 전반적인 건강을 유지하기 위해 전문화된 1차 림프 기관(예: 흉선 및 두부 신장)과 2차 림프 기관(예: 비장 및 점막 관련 림프 조직(MALT))에 의존합니다⁴. 두부 신장(head kidney)은 텔레오스트 어류(teleost fish)의 주요 조혈 기관으로, 백혈구를 포함한 면역 세포의 발달과 성숙에 중요한 역할을 한다⁵.

최근 몇 년 동안 여러 어종의 면역 반응을 연구하는 데 상당한 진전이 이루어졌습니다². 초점의 핵심 영역 중 하나는 백혈구 개체군과 그들의 활동을 이해하는 것입니다. 백혈구라고도 하는 백혈구는 일반적으로 단핵구, 림프구, 과립구로 분류되며 어류의 면역 방어에 중요한 역할을 합니다. 그들은 식세포 세포를 가지고 있는데, 이 세포는 병원체를 집어삼키고 파괴하며 살균 활성 산소 종을 방출하여 침입하는 미생물을 제거하는 데 기여합니다⁶. 백혈구는 또한 염증 과정에 관여하여 조직 복구를 촉진하는 동시에 감염을 격리하고 근절하는 데 도움이 됩니다⁶. 백혈구 개체군의 풍부함과 활동은 동물의 건강과 질병에 대한 면역 상태를 나타내는 중요한 지표이다 ^7,8.

일부 연구에서는 불리한 환경 조건과 같은 스트레스 요인이 적혈구의 수와 형태 및 순환 백혈구의 구성을 변화시킬 수 있음을 입증했습니다 ^9,10. 예를 들어, Franke et al. (2024)가 검토한 바와 같이, 환경 스트레스 요인은 어류의 면역력을 손상시키고, 질병 감수성을 증가시키고, 특정 병원체의 감염성을 향상시켜 궁극적으로 질병 진행을 가속화할 수 있기 때문에 기후 변화 시나리오에서 물고기의 면역 체계를 연구하는 것이 중요합니다¹¹. 또한, 어류 면역에 대한 이해는 기초 생물학 연구를 진전시키는 것뿐만 아니라 양식 산업과 같은 사회의 다양한 부문을 지원하는 데 필수적입니다. 양식업이 전 세계적으로 계속 확장됨에 따라 양식 어종의 건강과 복지를 보장하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다. 그러나 어류 복지는 여전히 비교적 새로운 연구 분야이며, 양식 어류의 면역 반응은 여전히 철저하고 표준화된 평가가 필요합니다. 면역 반응 연구의 우선 순위를 정하는 것이 가장 중요한데, 획득한 정보는 농장 동물의 복지와 회복력을 향상시키는 효과적이고 맞춤화된 접근 방식을 통해 양식업의 지속 가능성과 생산성을 향상시킬 수 있기 때문입니다.

백혈구 정량화 및 식별은 일반적으로 Bürker, Neubauer 또는 Thoma 혈구계를 사용한 수동 계수와 같은 혈액학적 방법과 염색된 혈액 도말 ^7,10을 사용하여 수행됩니다. 혈액 세포의 시각화 및 분화를 돕기 위해 Wright, May-Grünwald-Giemsa 및 Hemacolor와 같은 염색 키트가 종종 사용됩니다 ^7,12. 그러나 이러한 수동 세포 계수 기술은 지루하고 시간이 많이 걸리며 인적 오류가 발생하기 쉽습니다 ^8,10. 오류의 일반적인 원인으로는 혈액의 부적절한 혼합 또는 희석, 염색 문제, 혈구계 챔버의 잘못된 로딩 등이 있으며, 이 모든 것들은 부정확한 세포 수로 이어질 수 있습니다¹². 또한 수동 혈액 분석에는 결과의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해 높은 수준의 전문 지식과 경험이 필요합니다⁷. 정확하고 효율적인 진단 도구에 대한 수요가 증가함에 따라 어류 개체군의 면역 상태에 대한 심층적인 이해를 제공하는 혁신적인 방법의 개발은 이 분야를 발전시키는 데 점점 더 중요한 단계가 되고 있습니다.

유세포분석은 이러한 맥락에서 강력한 도구로 부상했으며, 백혈구 집단 및 세포 생존율을 분석하기 위한 고처리량 정량적 접근 방식을 제공합니다⁸. 이 현대적인 진단 기술은 놀라운 정밀도로 혼합된 집단에서 개별 세포를 신속하게 검출, 계수 및 특성화할 수 있습니다¹³. 또한 유세포 분석은 표현형 및 기능적 특성화를 위한 동시 다중 파라미터 측정을 가능하게 합니다. 인간 임상 환경 및 수의학에서 널리 사용되지만 어류 백혈구 연구에서의 적용은 매우 제한적입니다⁸. 다양한 어종 1,6,8,13,14,15,16,17에 대한 일부 연구가 수행되었지만 몇 가지 중요한 과제는 여전히 해결되어야 합니다. 이러한 분석의 주요 과제 중 하나는 말초 혈액 또는 두부 신장과 같은 림프 조직에서 추출한 살아있는 백혈구의 현탁액을 얻어야 한다는 것입니다¹. 백혈구의 분리는 teleost fish의 독특한 특성, 즉 핵이 있는 적혈구의 존재로 인해 어려운 경우가 많습니다. 적혈구에 대한 의도하지 않은 오염은 백혈구의 크기, 난형 모양 및 핵¹의 존재로 인해 백혈구 분석을 방해할 수 있습니다. 따라서 높은 백혈구 순도를 달성하고 유세포 분석을 통해 백혈구의 표현형 및 기능적 특성을 연구하기 위해 백혈구 현탁액에서 적혈구를 제거하는 것이 필수적입니다. 포유류에서 백혈구 분리는 일반적으로 적혈구 삼투압 용해 또는 Ficoll 또는 Percoll¹을 사용한 밀도 구배 분리를 포함합니다. 그러나 삼투압 용해는 적절하게 용해될 수 없는 핵이 있는 적혈구로 인해 해양 및 민물고기 모두에 효과가 없습니다¹. 대신, 밀도 구배 분리는 시간이 지남에 따라 세포 안정성을 효과적으로 보존하기 때문에 물고기에 선호됩니다¹. 일부 연구에서는 어린 어류에서 백혈구를 성공적으로 분리했지만, 많은 연구는 여전히 주로 성체 집단에 초점을 맞추고 있다¹⁷. 그럼에도 불구하고 생애 초기 단계는 질병 발병에 더 취약할 뿐만 아니라 규모가 작아 표본 추출 과정을 더 복잡하고 까다롭게 만듭니다. 또 다른 한계는 현재 방법이 백혈구 생존율을 평가하기 위해 즉각적인 처리가 필요하기 때문에 한 번에 제한된 수의 샘플 또는 복제로 제한되는 경우가 많다는 것입니다. 시료 처리의 지연은 세포 생존력에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 시료 채취 공정에 추가적인 복잡성이 발생하고 전체 작업이 위태로워질 수 있습니다.

우리가 아는 한, 발표된 방법 중 어느 것도 유세포 분석에 의한 후속 생존율 분석을 위해 백혈구 세포를 성공적으로 고정하지 못했습니다. 본 연구는 Percoll 밀도 구배 분리 방법론을 사용하여 남부 유럽 국가에서 양식되는 주요 어종인 어린 금도미(Sparus aurata)의 머리 신장에서 백혈구를 분리하는 효율적인 방법을 확립하기 때문에 선구적입니다. 또한 유세포 분석을 통해 주요 백혈구 집단(림프구, 단핵구 및 과립구)을 식별하면서 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 개선된 염색 기반 기술을 제시합니다. 개선된 프로토콜에는 세포 고정이 수반되어 시술 후 최대 1개월까지 생존 가능한 세포 분석이 가능합니다. 이 유세포 분석 프로토콜의 구현은 일반적으로 면역 평가에 필요한 시간과 노력을 크게 줄일 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 이는 양식 부문의 연구 및 보다 실용적인 응용 프로그램 모두에 유용한 기술이 됩니다. 이 방법론을 적용하면 많은 수의 시료를 분석하고, 세포를 보존하고, 유세포 분석을 통한 지연 분석을 수행할 수 있는 이점이 있습니다. 따라서 어류의 면역 메커니즘과 세포 생존력이 다양한 환경 또는 실험 조건에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 귀중한 통찰력을 얻는 것이 매우 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 생존력 분석은 특정 면역 세포 집단의 다중 매개변수 표현형 및 기능적 특성화와 통합될 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 여러 면역학적 매개변수를 보다 포괄적으로 분석하여 해당 세포 유형에 직접 연결하고 면역 반응을 보다 명확하게 이해할 수 있습니다. 이러한 발견은 양식업의 질병 관리를 위한 개선된 접근 방식을 포함하여 보다 효과적인 전략 개발에 기여할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 동물 실험(EU 기능 A 및 B)에서 인증을 받은 연구원이 수행해야 합니다. 동물 취급 및 검체 채취와 관련된 모든 절차는 ARRIVE 지침(Animal Research: Reporting of in vivo Experiments)을 준수해야 하며, 유럽 실험동물과학협회연맹(Federation of European Laboratory Animal Science Associations, FELASA)의 권고에 따라 동물 관리 및 사용에 대한 윤리적 기준을 준수해야 합니다. 본 연구는 이러한 모든 표준과 실험실 동물 과학에 대한 포르투갈 법률(EU 지침 2010/63; 법령 번호 113/2013). 이 연구는 IPMA의 동물 복지 및 윤리 기관(ORBEA, LABVIVOS-002-AquaClimAdapt)의 승인을 받았으며, DGAV(Directorate-General for Food and Veterinary)로 알려진 살아있는 동물 사용 국가 당국(National Authority for the Use of Live Animals)의 감독을 받고 윤리적 승인 번호 20596/25-S로 승인되었습니다.

1. 연구 모델 및 유기체의 유지 관리

참고: 이 연구는 평균 체중이 30.0 ± 5.0g이고 총 길이가 12.0 ± 2.0cm인 어린 금두미 도미(Sparus aurata)를 위해 특별히 설계되었습니다. 이 방법은 다른 어종에 직접 적용되지 않을 수 있는데, 다른 종은 백혈구 분리, 세포 고정 및 생존력 평가에 영향을 미칠 수 있는 고유한 생리학적 및 면역학적 특성을 가지고 있기 때문입니다. 다른 종에 대해서는 프로토콜에 대한 조정이 필요할 수 있으며, 각 대상 종에 대한 조건을 최적화하기 위해 예비 연구가 권장됩니다.

1. 물고기 적응 (격리 기간)
   1. 큰 용량의 수조에 물고기를 균등하게 분배합니다(예: 각각 총 용량이 660L인 두 개의 수조 - 보충 그림 1 참조).
      알림: 사용할 탱크는 효율적인 물 사용과 수질 관리를 개선할 수 있는 재순환 양식 시스템(RAS)의 일부일 수 있습니다. RAS에서 물은 시스템 내에서 지속적으로 재활용 및 처리되어 물고기에게 안정적이고 통제된 환경을 제공합니다. 이 설정은 물고기의 건강과 성장을 위한 최적의 조건을 유지하고 균일한 분포를 보장하며 연구 중 스트레스를 최소화하는 데 도움이 됩니다.
   2. 최적의 비생물적 조건을 유지합니다.
      1. 자연 서식지를 모방한 조건에서 물고기를 3주 동안 격리하십시오.
         온도 : 20.0 ± 0.5 °C;
         용존 산소 : 7.2 ± 0.2 mg / L;
         염분 : 35.0 ± 0.5 °C;
         pH : 8.0 ± 0.1 단위;
         광주기: 14시간 조명/10시간 어둠.
         알림: 이상적인 유지 관리 조건은 어종에 따라 다를 수 있습니다. 다른 종은 요구 사항이 다를 수 있으므로 유기체의 건강과 복지를 보장하기 위해 대상 종의 특정 요구에 맞게 이러한 조건을 조정하는 것이 중요합니다. 또한 해수 온도와 광주기는 계절에 따라 변할 수 있으므로 실험실에서 자연 조건을 복제할 때 계절적 변화를 고려해야 합니다.
2. 실험 연구를 시작합니다.
   1. 각 사례 연구의 실험 설정 설계에 따라 필요한 수조와 물고기의 수를 정의합니다.
   2. 격리 기간이 끝나면 물고기를 독립적인 RAS로 옮깁니다( 보충 그림 2 참조).
      1. 물에서 과도한 유기 화합물을 제거하기 위해 각 시스템에 단백질 스키머를 장착하십시오. 물리적 여과 (필터 백 [400 μm], 필터 스폰지 및 유리솜); 생물학적 여과 (바이오 볼 [1.5"], 자외선 살균기 및 수중 에어 스톤); 자동 해수 냉동 시스템 및 수중 디지털 히터는 모두 온도 센서가 있는 컴퓨터 제어 시스템(ProfiLux)에 연결되어 각 탱크의 온도를 조정합니다. 용존 산소를 제어하기 위해 각 탱크에 잠긴 공기 돌.
   3. 실험을 진행하기 전에 새로운 시스템에서 2주 동안 물고기를 적응시킵니다.
   4. 일일 유지 보수 수행
      1. 각 배양 탱크에서 물고기 배설물을 제거하고 25% 해수 재생을 수행합니다.
      2. 휴대용 정밀 온도계를 사용하여 온도를 측정합니다.
      3. 다중 매개변수 측정 기기를 사용하여 다른 해수 비생물적 매개변수(염도, 용존 산소 및 pH)를 모니터링합니다.
      4. 실험 전반에 걸쳐 안정성을 보장하기 위해 필요에 따라 해수 비생물 매개변수를 조정합니다.
         참고: 실험 시스템의 비생물적 조건은 각 사례 연구의 특정 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 연구가 계절 변화나 해양 열파를 시뮬레이션하는 것을 목표로 하는 경우 자연적인 계절 변화를 모방하기 위해 온도와 광주기를 적절하게 조정해야 합니다. 마찬가지로, 연구가 저산소 상태 또는 해양 산성화를 시뮬레이션하는 데 초점을 맞추는 경우 바닷물의 산소 수준과 pH를 조정해야 합니다. 이를 통해 실험 조건이 가능한 한 현실적이고 관련성이 높도록 하여 연구 결과의 타당성과 적용 가능성을 높일 수 있습니다.
      5. 1.2.4.6-1.2.4.8 단계에 설명된 대로 스트레스 또는 질병의 징후를 식별하고 관리하여 물고기의 건강과 웰빙을 평가합니다.
      6. 불규칙한 수영, 식욕 부진, 무기력, 공격성 또는 고립과 같은 비정상적인 행동을 찾으십시오.
      7. 병변, 궤양, 변색, 뻣뻣한 지느러미, 과도한 점액 또는 빠른 아가미 움직임을 포함한 질병의 징후를 확인하십시오.
      8. 모든 관찰 내용을 기록하고 날짜와 취한 조치를 기록합니다.
   5. 매주 수질 테스트를 실시합니다.
      1. 비색 테스트를 사용하여 암모니아(NH₃/NH₄), 아질산염(NO₂^-) 및 질산염(NO₃^-) 수준을 측정합니다.
         알림: 이러한 모든 매개변수가 감지 가능한 수준 미만인지 확인하십시오. 수준이 한계를 초과하면 추가 물 교체를 수행하거나 폭기를 높이거나 여과를 조정하십시오.
   6. 물고기에게 먹이를 주고 영양을 모니터링합니다.
      1. 어린 물고기의 특정 영양 요구 사항을 충족하는 고품질 식단을 제공합니다(식단의 자세한 구성에 대한 예는 보충 표 1 참조).
         알림: 아쿠아 피드 펠릿의 크기(2-3mm)가 청소년에게 적합하여 섭취와 소화를 용이하게 하는지 확인하십시오.
      2. 하루 물고기 평균 체중의 2%에 해당하도록 사료량을 조정합니다.
      3. 하루에 두 번, 아침에 한 번, 오후에 한 번 물고기에게 수동으로 먹이를 줍니다(안정적인 먹이 주기 루틴을 유지하기 위해 특정 시간을 설정).

2. 물고기 표본 추출, 안락사, 해부 및 머리 신장 채취

1. 수조에서 물고기를 맛보세요.
   1. 표본 추출 편향을 피하기 위해 수조에서 무작위로 물고기를 선택하십시오.
   2. 그물을 사용하여 물고기를 탱크 물로 채워진 임시 보관 용기로 부드럽게 옮깁니다.
      알림: 스트레스를 줄이기 위해 취급 시간을 최소화하십시오.
2. 안락사 용액을 준비합니다.
   1. 물고기를 담기에 적합한 적절한 용기(예: 3L 양동이)를 사용하십시오.
   2. 200-300 mg/L의 최종 농도를 달성하기 위해 적절한 양의 트리카인(MS-222)을 바닷물에 용해시킵니다¹⁸(주의: 보충 표 2 및 보충 파일 1 참조).
   3. 용액을 중탄산나트륨으로 완충하여 pH 7.2-7.5로 만듭니다.
3. 안락사 용액을 투여합니다.
   1. 물고기를 안락사 용액에 최소 10분 동안 또는 수술 움직임이 멈추고 반사 신경 상실이 관찰될 때까지 두십시오(외부 자극에 대한 반응이 없는지 확인하여 안락사 확인).
   2. 물고기의 체중(g)과 총 길이(cm)를 기록합니다.
4. 물고기 해부를 수행합니다.
   참고: 최적의 샘플 품질과 세포 생존력을 보장하기 위해 박리 과정은 가능한 한 빨리, 이상적으로는 안락사 후 5분 이내에 완료되어야 합니다.
   1. 샘플링 및 처리 중 변동을 최소화하기 위해 에어컨을 사용하여 실험실 온도를 19°C로 유지하십시오.
   2. 해부 도구(가능하면 오토클레이브 금속 기구 권장)를 소독하고 70% 에탄올로 깨끗한 작업 공간을 설정합니다(주의, 보충 표 2 참조).
   3. 안락사된 물고기를 멸균 해부 트레이에 옆으로 눕히고 머리가 주로 사용하지 않는 손을 향하도록 합니다.
   4. 메스를 사용하여 환풍구(항문)에서 아가미 방향으로 물고기의 복부 정중선을 따라 조심스럽게 절개합니다.
      알림: 내부 장기가 손상되지 않도록 너무 깊게 자르지 않도록 주의하십시오.
   5. 절개 가위를 조심스럽게 사용하여 절개 부위를 확장하고 내부 장기를 노출시킵니다. 내부 해부학적 구조를 명확하게 볼 수 있도록 신체 벽 덮개를 부드럽게 들어 올립니다.
   6. 두부 신장 찾기: 두부 신장은 아가미 바로 뒤, 체강의 앞쪽 등쪽 근처에 위치하며 체강의 위쪽을 따라 척추 아래 뻗어 있습니다.
      참고: 머리 신장은 일반적으로 주변 조직에 비해 색이 더 어둡습니다(그림 1).
   7. 두부 신장을 더 잘 볼 수 있도록 지방 및 결합 조직과 같은 주변 조직을 조심스럽게 제거합니다.
      알림: 이 단계에서는 두부 신장 손상을 방지하기 위해 섬세한 취급이 필요합니다.
   8. 끝이 가는 집게와 가위를 사용하여 머리 신장을 조심스럽게 들어 올리고 주위를 정밀하게 잘라 주변 조직으로부터 분리시킵니다.
      알림: 손상을 방지하기 위해 티슈를 부드럽게 다루십시오. 무게가 약 30g인 물고기의 경우 머리 신장의 무게는 약 20-30mg일 것으로 예상됩니다.
   9. 절제된 장기를 멸균 페트리 접시 내의 세포 여과기(100μm 나일론 메쉬)에 즉시 넣어 멸균 상태를 보장하고 후속 처리 단계를 용이하게 합니다.
      참고: 이 시점부터는 세포 생존력을 유지하기 위해 가능한 한 빨리(5분 이내) 모든 단계를 수행해야 합니다. 샘플을 시원하게 유지하려면 얼음으로 채워진 용기에 페트리 접시를 놓고 알루미늄 호일로 덮은 상태에서 다음 단계를 수행하십시오.

그림 1: 두부 신장의 위치: (A) 아가미 뒤와 체강의 앞쪽 등쪽 부위를 따라 두부 신장의 전형적인 위치를 묘사한 그림; (B) 도미의 머리 신장의 대표적인 이미지로, 주변 조직에 비해 더 어두운 색을 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 두부 신장 백혈구의 분리(그림 2)

그림 2: 두부 신장에서 백혈구 분리에 대한 예시적인 설명. 프로토콜은 조직의 균질화부터 시작하여 밀도 구배 원심분리, 백혈구 고리 채취, 백혈구 고리 세척, 세포 농도의 재현탁 및 조정으로 마무리하는 여러 단계를 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

1. 조직을 균질화합니다.
   1. 멸균 페트리 접시에 행크스 균형 소금 용액(HBSS) 2mL를 넣습니다.
   2. 셀 스트레이너의 메쉬(100μm 나일론 메쉬)가 HBSS와 접촉하지만 완전히 잠기지 않았는지 확인합니다.
   3. 주사기의 플런저를 사용하여 세포 여과기에 머리 신장을 침식합니다. 부드러운 압력을 가하여 장기 조각이 나일론 그물망을 통과하도록 밀어 세포 현탁액을 만듭니다.
      참고: 여러 샘플을 처리하는 경우amples, 세포 현탁액이 포함된 페트리 접시는 다음 단계까지 몇 분 동안 4°C의 냉장고에 보관할 수 있습니다. 이 세포 현탁액은 백혈구 분리에 사용됩니다.
2. 밀도 구배 원심분리를 수행합니다.
   1. 밀도 1.077g/mL, 삼투압 353mOsm/kg, pH 7.4의 밀도 구배 배지 용액을 준비합니다( 보충 파일 1 참조).
      참고: 삼투압은 어종에 따라 다를 수 있으므로 각 종의 특정 요구 사항을 충족하도록 밀도 구배 매체 용액의 삼투압을 조정하는 것이 중요합니다.
   2. 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 600μL의 밀도 구배 매체 용액을 조심스럽게 추가합니다.
   3. 세포 현탁액(2mL)을 취하여 밀도 구배 배지가 들어 있는 튜브에 천천히 추가합니다. 첫 번째 방울은 매우 중요합니다 - 밀도 구배 중간 단계를 불안정하게 만들지 않도록 매우 부드럽게 첨가하십시오.
      참고: 이 작업은 3:10 비율(밀도 구배 매체: 셀 현탁액)로 수행해야 합니다. 정확하고 부드럽게 첨가하려면 멸균 1mL 파스퇴르 피펫을 사용하십시오. 밀도 구배 중간 층을 방해하지 않도록 피펫의 끝이 튜브 측면에 닿는지 확인하십시오. 샘플을 밀도 구배 매체와 혼합하지 마십시오.
   4. 브레이크를 끈 상태에서 400 x g 에서 45 °C에서 4분 동안 튜브를 원심분리하십시오. 이렇게 하면 프로세스 중에 레이어가 그대로 유지됩니다.
      참고: 원심분리 후에는 뚜렷한 층이 보여야 합니다. 백혈구는 밀도 구배 매질과 세포 파편 펠릿 사이의 계면에서 고리를 형성합니다(그림 3).

그림 3: 밀도 구배 매질(density gradient medium)과 세포 파편 펠릿(cellular debris pellet) 사이의 계면에서 백혈구 고리(leukocytes ring). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

3. 백혈구 고리를 수집합니다.
   1. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 백혈구 고리(~100μL)를 부드럽게 흡인하고 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      알림: 오염을 방지하기 위해 층을 크게 방해하지 않도록 주의하십시오. 백혈구 고리에 파편이나 어두운 현탁액이 포함되어 있는 것으로 보이는 경우, 순도를 보장하기 위해 수집된 백혈구 현탁액을 새로운 미니 세포 여과기(100μm)에 통과시키는 것이 좋습니다. 미니 세포 스트레이너를 2mL 마이크로 원심분리 튜브 위에 놓고 스트레이너를 통해 백혈구 현탁액을 부드럽게 옮깁니다.
4. 백혈구 고리를 씻으십시오.
   1. 백혈구 고리가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 HBSS를 부피가 2mL에 도달할 때까지 추가하고 세포를 부드럽게 재현탁합니다.
      참고: 튜브를 얼음으로 채우고 알루미늄 호일로 덮은 용기에 보관하여 샘플을 저온으로 유지하십시오. 튜브가 얼음에 직접 닿지 않도록 하십시오. 세탁 과정 전반에 걸쳐 이 냉각 설정을 유지하십시오.
   2. 400 × g 에서 4°C에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다(브레이크가 켜져 있을 수 있음).
   3. 원심분리 후 상등액을 조심스럽게 버리고 펠릿을 바닥에 남겨둡니다(거의 보이지 않을 수 있음).
   4. 펠릿에 불순물이 없어질 때까지 세척 단계(HBSS 추가, 재현탁, 원심분리 및 상등액 폐기)를 반복합니다.
5. 세포 농도를 재현탁하고 조정합니다.
   1. 세척에 사용된 것과 동일한 2mL 마이크로 원심분리 튜브 내에 1mL의 HBSS에 세포를 재현탁합니다.
   2. mL당 1 × 10⁴ 및 1 × 10⁶ 세포 사이의 세포 농도를 달성합니다. 초기 펠릿이 큰 경우 세포 농도를 원하는 범위로 희석하기 위해 추가 HBSS가 필요할 수 있습니다. 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 얻은 세포 수에 따라 필요에 따라 HBSS를 더 추가합니다.
      참고: 프로세스를 용이하게 하기 위해 자동화된 세포 계수기를 사용하는 것이 좋습니다.

4. 백혈구의 염색 및 고정(그림 4)

참고: LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit는 유세포 분석을 사용하여 고정 세포에서 세포 생존율을 평가하는 개선된 방법을 제공합니다. 이러한 분석은 세포 아민과 상호 작용하는 형광 반응성 염료를 사용합니다. 세포막이 손상되면 염료가 세포에 침투하여 세포 내부와 표면 모두에서 유리 아민과 반응하여 강렬한 형광 염색을 유발할 수 있습니다. 반대로, 생존 가능한 세포에서는 세포 표면 아민만 염료와 반응할 수 있어 상대적으로 희미한 염색을 유발할 수 있습니다. 염색 강도는 포름알데히드로 고정한 후에도 유지되며, 이는 또한 미생물의 성장을 방지하여 샘플을 보존합니다. LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit는 청색, 보라색, 청록색, 황색, 녹색, 적색, 근적외선 또는 근적외선(적외선)으로 제공되는 형광 염료를 제외하고는 동일합니다. 이 연구에서는 Near-IR 형광 반응성 염료를 사용했습니다. 또한 이 단색 분석을 통해 다색 실험에서 다른 파라미터를 병렬로 테스트할 수 있습니다.

1. 염료를 준비합니다.
   1. 시약을 실온(RT)으로 가져오기: 캡을 제거하기 전에 형광 반응성 염료 바이알 하나와 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO) 바이알이 RT에 도달하도록 합니다.
   2. 염료 재구성: 반응성 염료가 들어 있는 바이알에 DMSO 50μL를 추가합니다. 완전히 혼합하고 염료가 완전히 용해되었는지 확인하십시오.
   3. 재구성된 염료 용액을 가능한 한 빨리, 가급적이면 몇 시간 이내에 사용하십시오.
      참고: 각 키트에는 5개의 반응성 염료 바이알이 포함되어 있어 최소 40개의 세포 샘플을 염색하기에 충분한 물질을 제공합니다. 그러나 재구성 후 염료의 DMSO 용액은 특히 수분에 노출될 때 상대적으로 불안정합니다. 사용하지 않은 부분은 빛과 습기로부터 보호되어 ≤-20 °C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
2. 세포를 염색하고 고정하십시오.
   참고: 세포 염색에 적합한 완충액에는 소 혈청 알부민 또는 혈청과 같은 외부 단백질을 포함하지 않는 한 Hanks의 Balanced Salt Solution(HBSS), 인산염 완충 식염수(PBS) 및 Dulbecco의 PBS(D-PBS)가 포함됩니다. 아미노 반응성 염료를 사용할 때는 세포 재현탁 및 세척을 위해 아지드화나트륨 또는 외부 단백질이 포함된 Tris 완충액 및 용액을 피하십시오. 이 연구에서는 삼투압 균형을 유지하는 데 도움이 되고 염색 과정에서 세포 대사와 생존력을 지원하는 필수 이온과 포도당을 제공하는 균형 잡힌 이온 구성으로 인해 HBSS를 사용했습니다. HBSS는 또한 외부 단백질이 없어 반응성 염료에 대한 간섭을 방지하고 정확한 생존율 평가를 보장합니다.
   1. HBSS를 사용하여 세포를 계수하고 밀도를 mL당 1 x 10⁶ 세포로 조정한 후 이 세포 현탁액 1mL를 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      1. 매일 하나 이상의 샘플에서 세포 사멸을 유도하여 살아있는 세포와 죽은 세포 사이의 형광 강도 임계값을 설정하기 위한 대조군으로 사용합니다. 다음과 같이 마이크로 원심분리기 튜브에 샘플을 준비합니다.
         튜브 1: 살아있는 세포 - 염색되지 않음
         튜브 2: 살아있는 세포 - 염색
         튜브 3: 죽은 세포 - 염색되지 않음
         튜브 4: 죽은 세포 - 염색
         참고: 이 4개의 튜브는 각 실험에서 대조군으로 단일 샘플에 대해서만 준비하면 됩니다. 나머지 샘플의 경우 두 개의 튜브(튜브 1: 샘플 - 염색되지 않음 및 튜브 2: 샘플 - 염색됨)만 필요하며, 이는 살아 있는 세포와 죽은 세포에 대한 정보를 제공하기 때문입니다.
   2. 세포 사멸에 대한 양성 대조군: 라벨링된 튜브 Dead unstained(Tube 3) 및 Dead-stained(Tube 4)를 50°C의 수조에 7분 동안 넣어 열처리로 세포 사멸을 유도합니다.
   3. 세포 염색: 1μL의 재구성된 형광 반응성 염료(단계 4.1.2)를 튜브 2 및 4(염색될 튜브)의 세포 현탁액 1mL에 추가하고 잘 혼합합니다.
   4. 빛으로부터 보호받으며 30분 동안 상온에서 배양합니다.
      참고: 고정이 필요하지 않은 경우 아래 4.2.5-4.2.7 단계를 건너뛸 수 있습니다. 대신, 1% 소 혈청 알부민이 함유된 HBSS 1mL로 세포를 두 번 세척하고( 보충 파일 1 참조) HBSS 1mL에 1% 소 혈청 알부민과 함께 재현탁합니다. 가능한 한 빨리 유세포 분석기에 대한 분석을 수행합니다. 그렇지 않으면 세포가 고정되지 않아 세포 생존력이 손상될 수 있습니다.
   5. HBSS 1mL로 세포를 두 번 세척하고 HBSS 900μL에 세포를 재현탁합니다.
   6. 100μL의 37% 포름알데히드를 추가합니다(주의, 보충 표 2 참조).
   7. RT에서 15분 동안 배양합니다.
   8. 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 함유된 HBSS 1mL로 2회 세척한 다음 1% BSA가 함유된 HBSS 1mL에 세포를 재현탁합니다.
   9. 샘플을 4°C의 냉장고에 보관하십시오. 고정 후 1개월 이내에 세포를 분석합니다.
   10. 적절한 excitation 및 detection channel을 사용하여 유세포 분석으로 fixed cell suspension을 분석합니다.
       알림: 올바른 여기 및 감지 채널은 사용 중인 기기에 따라 다를 수 있습니다( 보충 표 3 참조).

그림 4: 백혈구의 염색 및 고정에 대한 설명 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

5. 유세포 분석

1. 데이터를 수집합니다.
   참고: 유세포 분석기에서 따라야 할 절차는 사용하는 특정 세포 분석기에 따라 다를 수 있습니다. 이 연구에서는 Attune NTx 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 획득했습니다.
   1. 샘플을 실행합니다.
   2. 샘플 튜브를 s에 놓습니다.amp르 포트.
   3. start를 눌러 수집을 시작한 다음 이벤트 속도(events/second)가 안정화되면 record를 클릭합니다.
   4. 신뢰할 수 있는 분석을 위해 singlets 게이트의 각 샘플에 대해 최소 10,000개의 이벤트를 기록합니다.
   5. 각 샘플에 대한 모든 데이터를 저장하고 외부 드라이브 또는 클라우드 스토리지에 백업합니다.
2. 데이터를 분석합니다.
   참고: 유세포 분석을 위해 여러 소프트웨어 옵션을 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는 FlowJo v10.8.1¹⁹를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.
   1. 데이터 파일 로드: 유세포 분석 소프트웨어를 실행하고 실험에서 획득한 .fcs 파일을 업로드합니다.
   2. 데이터 시각화(그림 5A): 전방 산란(FSC-A)(XX) 대 측면 산란(SSC-A)(YY)을 플롯하여 셀 크기와 입도를 평가합니다.
      참고: 이 플롯은 일반적으로 세포 집단을 식별하고 산란 특성에 따라 파편을 제외하는 데 사용됩니다.
   3. 단일항 세포 게이팅 및 다중항 제외(그림 5B): 전방 산란 영역(FSC-A) 대 전방 산란 높이(FSC-H) 플롯을 사용하여 다중항을 제외합니다. 그래프에 정렬된 모든 이벤트(단일 셀)를 포함하도록 게이트를 그리고 정렬되지 않은 이벤트(다중선)를 제외합니다. 샘플에 FSC가 매우 낮은 이벤트가 있는 경우 단일 세포의 게이트에 포함하지 않고 단일 세포만 남아 이벤트를 제외합니다.
   4. 백혈구 집단 식별(그림 5C): FSC-A/SSC-A 프로파일을 기반으로 3개의 백혈구 집단을 구별합니다: FSC-A^높음/SSC-A^높음 은 과립구, FSC-A^매체/SSC-A^매체 는 단핵구, FSC-A^낮음/SSC-A^낮음 은 림프구입니다.
   5. Viability gating(그림 5D): 해당 형광 채널(NIR, RL3-A)에서 viability dye staining에 대한 임계값을 설정합니다. 살아있는 세포와 죽은 세포는 LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain의 염색 강도에 따라 정의됩니다: 딤 염색된 세포는 살아있는 세포로 정의되고 강하게 염색된 세포는 죽은 세포로 정의됩니다.
   6. 인구 통계: 각 게이트의 총 이벤트(셀)와 총 및 게이트 셀의 백분율을 포함하여 소프트웨어에서 제공하는 통계를 확인합니다.
   7. 데이터 내보내기: 데이터를 스프레드시트로 내보내고 추가 통계 분석을 위해 적절한 통계 소프트웨어(GraphPad, Prism 또는 R)를 사용합니다.
      참고: 분석 방법의 선택은 연구 목적에 따라 다릅니다.

그림 5: 두부 신장 세포의 생존율 평가를 위한 유세포 분석 게이팅 전략: (A) 수집된 모든 이벤트의 FSC-A/SSC-A 프로파일을 나타냅니다. (B) 전방 산란(FSC-A)/전방 산란(FSC-H) 그래프의 선형성을 기반으로 한 단일 영역의 정의에 따른 다중항 제외를 나타냅니다. (C) 다중항 배제 후 FSC-A/SSC-A를 기반으로 정의된 3개의 주요 개체군을 나타냅니다. (D) Live/Dead Viability 염료 염색을 보여주는 히스토그램을 나타냅니다. 살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별할 수 있는 임계값을 설정하기 위해 백혈구를 가벼운 열 충격(50°C, 7분)에 투여한 다음 생존능 염료로 염색했습니다. 염색 강도가 높은 세포 양성(++)은 죽은 세포이고 염색이 적은 양성 세포(+-)는 살아있는 세포입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

그림 6은 이 연구에서 설명한 프로토콜을 사용하여 어린 길트헤드 도미(Sparus aurata)의 머리 신장에서 분리된 백혈구 개체군과 세포 생존력을 보여주는 대표적인 유세포 분석 데이터를 보여줍니다. 이 그림은 두 개의 샘플, 즉 물고기가 최적의 조건에 노출된 높은 세포 생존율을 가진 샘플(그림 6A)...

토론

이 연구에서 개발된 방법은 어류 면역학 연구의 중요한 진전을 나타내며 어류 면역 반응에 대한 이해와 해양 자원의 지속 가능성을 향상시킬 것을 약속합니다. S. aurata 는 Sparidae과에 속하는 귀중한 해양 어종으로, 생리학, 면역학, 독성학, 양식학과 같은 여러 연구 분야의 실험실 연구에서 다재다능함뿐만 아니라 생태학적, 경제적 관련성 등 여러 가지 이유로 이상?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air Stones	N/A	N/A
Aquafeed	SPAROS, Lda., Portugal	N/A	High-quality diet
Automatic Cell Counting Equipment	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE automatic cell counter (NanoEnteK)
Automatic Water Refrigeration Systems	Foshan Weinuo Refrigeration Equipment Co., Ltd, China	N/A
Bio balls 1.5" Aquarium Pond Filter	TMC Iberia, Portugal	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Germany	A7906
Bucket (3 L)	N/A	N/A	To prepare and carry out euthanasia
Buckets (5 L)	N/A	N/A	To transport the animals
Cell Strainers	Jetbiofil, China	CSS-013-100	Cell Strainer, 100 μm nylon mesh, Sterile, Yellow
Centrifugue	Fisher Scientific, Germany	N/A	accuSpin Micro 17 R
Colorimetric Test Kit for Ammonia (NH4+/NH3)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrate (NO3-)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrite (NO2-)	Tropic Marin, USA	N/A
Computer	N/A	N/A	To acquire and analyse the data obtained from the flow cytometer
Computerized Control System (Profilux)	GHL, Germany	N/A	ProfiLux 3 Outdoor
Deionized water	N/A	N/A	To clean the Flow Cytometer
Density Gradient Medium: Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany	17-0891-01
Digital scale	KERN & Sohn GmbH, Germany	N/A	KERN EMS 300-3
Ethanol 70%	Millipore, Supelco, Portugal	EX0281	To keep the workspace clean
EVE Cell Counting Slides	NanoEnteK, Korea	N/A
Falcon Tubes (15 mL)	pluriSelect Life Science, Germany	05-00002-01	Sterile
Filter bag	TMC Iberia, Portugal	N/A	400 micron
Filter Sponge	N/A	N/A
Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune flow cytometer
FlowJo v10.8.1 Software	BD Life Sciences	N/A
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich, Germany	8.18708
Glass Wool	N/A	N/A
Hanks' Balanced Salt Solution	Merck Life Science S.L, Portugal	H6648	Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits	Life Technologies Europe, Netherlands	L10119	Near-IR fluorescent reactive dye + DMSO
Main Water Pumps	EHEIM, Germany		Universal 1200
Microcentrifuge Tubes (2 mL)	BRAND, Merck, Germany	Z628034	Sterile
Micropipette Tips	Sartorius, Germany	790010, 790200, 791000	Compatible with Sartorius, 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Micropipettes	Sartorius, Germany	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Mini Cell Strainers	pluriSelect Life Science Global Headoffice, Germany	43-10100-50	PluriStrainer 100 µm nylon mesh, Sterile
Multi-Parameter Measuring Instrument	WTW, Germany		Multi 3420 SET G + IDS digital conductivity cell (TetraCon 925) + Optical IDS DO sensor (FDO 925) + IDS pH-electrode (SenTix 940)
Pasteur Pipettes (1 mL, 5 mL)	Humeau Expert du laboratoire, France	248295	Sterile
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1194.500	60 x 15 mm, Polystyrene, Sterile
pH Meter	Hanna Instruments Inc., Romania		HANNA HI2211
Polystyrene round-bottom Falcon tubes (5 mL)	Fisher Scientific, Germany	14-959-2A	Sterile
Portable Precision Thermometer	Ebro Electronic, Germany	N/A	TFX 430
Protein Skimmers	Mantis	N/A	Tornado 120
Quality control beads/Performance test beads	Thermofisher Scientific, USA	N/A
Quarantine Tanks	N/A	N/A	Tanks with 660 L total volume
Rectangular Glass Tanks/Aquariums	N/A	N/A	Tanks with 200 L total volume
Refrigerator	N/A	N/A	To store the samples at 4 °C
Ruler 30 cm	N/A	N/A	To measure the fish's length
Sodium bicarbonate	Honeywell Fluka, Germany	31437	Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sterile Dissection Tools	N/A	N/A	(e.g. scalpel, scissors, fine-tipped forceps, dissecting tray/board)
Submerged Digital Heaters	TMC Iberia, Portugal		300 W, V2Therm Digital Heaters
Syringes 1 mL	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	Sterile, HSW Soft-Ject Syringes to macerate head-kidney
Temperature Sensors	GHL, Germany		PT 1000
Tricaine (MS-222)	ThermoFisher Scientific, Germany	118000500	Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt, 98% (C10H15NO5S)
Ultraviolet Water Sterilizer	EHEIM, Germany	5305010	ClearUVC-36
Water Bath	Fisher Scientific, Germany	N/A	Fisherbrand IsotempTM (P/N U01318)
Water-resistant Luminaires	N/A	N/A