フローサイトメトリーによる幼若魚イタドリ頭部腎臓白血球の単離、固定および特性評価

要約

この原稿では、金箔鯛の頭部腎臓から抽出した白血球の単離と固定、およびフローサイトメトリーによる生存率の評価について説明しています。この研究は、プロトコルの標準化に貢献し、サンプルの品質を損なうことなくより多くのサンプルの処理を活用し、魚の免疫学知識の進歩を促進します。

要約

免疫は生物の生理学的調節に不可欠であり、病原体や環境ストレス要因に対する主要な防御として機能します。免疫細胞の単離と解析は、外部からの圧力に対する免疫応答に関する重要な洞察を提供します。しかし、海産魚など、あまり研究されていない種については、調和のとれたプロトコルがないため、技術的および分析的な課題が生じ、データの解釈や種特異的な免疫応答の完全な理解が妨げられることがよくあります。この研究は、金箔の鯛の稚魚(Sparus aurata)の頭部腎臓(魚類の主要な造血器官)から採取された白血球の生存率を特徴付け、決定するための最適化されたフローサイトメトリーベースの分析手順を設定することを目的としていました。この手順は、Hanksの平衡塩溶液を使用した均質化プロセスによる白血球の単離から始まり、その後、最適化されたPercoll密度勾配遠心分離法により、その後の効率的なフローサイトメトリー分析に必要な赤血球汚染を最小限に抑えながら白血球の高い回収率を確保しました。さらに、細胞反応性色素を用いた新しい技術(LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit)を採用し、蛍光染色パターンに基づいて生存細胞と死細胞を区別しました。3.7%のホルムアルデヒドで固定を行い、細胞の形態、生存率、および染色効率を維持しました。フローサイトメトリー解析により、リンパ球、単球、顆粒球の3つの主要な白血球集団を同定することに成功しました。この方法により、生存率試験だけでなく、細胞タイプの正確な分化も可能になりました。フローサイトメトリープロトコルの改善は、免疫細胞解析の精度と効率を向上させることにより、魚類免疫学における一歩前進を表しています。さらに、このプロトコルは、後の解析のために細胞を固定することができるため、免疫評価に必要な時間と労力を大幅に削減し、研究だけでなく、さまざまな研究分野での実用化にも貴重なツールとなります。

概要

免疫は、生物の生理学的調節において中心的な役割を果たし、さまざまな病原体や環境ストレス要因に対する主要な防御として機能します¹。他の脊椎動物と同様に、魚類は、全体的な健康と幸福に不可欠な、複雑で動的で協調的な免疫システムを持っています¹。

魚類は自然免疫系と適応免疫系の両方を持っており、これらは同時に機能し、有害な侵入者を検出し、反応し、中和します²。自然免疫系は防御の最前線として機能し、病原体に対して即時かつ非特異的な反応を示します²、一方、適応免疫系は時間の経過とともに発達し、魚が特定の病原体を認識し、免疫学的記憶を確立することを可能にするより特殊な応答を提供します³。魚類の免疫系は、特殊な一次リンパ器官(胸腺および頭部腎臓)および二次リンパ器官(脾臓および粘膜関連リンパ組織(MALT)など)に依存して、免疫防御をサポートし、全体的な健康を維持します⁴。頭部腎臓は、魚類の主要な造血器官であり、白血球⁵を含む免疫細胞の発生と成熟に重要な役割を果たしている。

近年、いくつかの魚種の免疫応答の研究は大きな進歩を遂げています²。焦点を当てている重要な分野の1つは、白血球の集団とその活動を理解することです。白血球は、白血球とも呼ばれ、一般に単球、リンパ球、顆粒球に分類され、魚の免疫防御に重要な役割を果たしています。それらは食細胞を持っており、病原体を飲み込んで破壊し、殺菌活性酸素種を放出する役割を担っており、侵入する微生物の排除に貢献しています⁶。白血球は炎症過程にも関与しており、組織の修復を促進しながら感染を分離および根絶するのに役立ちます⁶。白血球集団の存在量と活性は、動物の健康と病気における免疫状態の重要な指標です^7,8。

いくつかの研究では、悪環境条件などのストレス要因が赤血球の数と形態、および循環白血球の組成を変化させる可能性があることが実証されています^9,10。例えば、Franke et al. (2024) がレビューしたように、環境ストレス要因は魚の免疫を損ない、病気の感受性を高め、特定の病原体の感染力を高め、最終的に病気の進行を加速させる可能性があるため、気候変動シナリオにおける魚の免疫系を研究することが重要です¹¹。また、魚類の免疫力を理解することは、基礎生物学研究を進めるだけでなく、養殖業など社会のさまざまな分野を支えるためにも不可欠です。養殖が世界的に拡大し続ける中、養殖魚種の健康と福祉を確保することはますます重要になっています。しかし、魚の福祉は依然として比較的新しい研究分野であり、養殖魚の免疫応答には依然として徹底的かつ標準化された評価が必要です。免疫応答研究を優先することは最も重要であり、得られた情報は、養殖動物の福祉と回復力を向上させる効果的でカスタマイズされたアプローチを通じて、水産養殖の持続可能性と生産性を向上させることができます。

白血球の定量と同定は、通常、ビュルカー、ノイバウアー、またはトーマ血球計算盤による手動カウントや、染色された血液塗抹標本^7,10などの血液学的方法を使用して行われます。血液細胞の可視化と分化を支援するために、Wright、May-Grünwald-Giemsa、Hemacolorなどの染色キットがよく採用されます^7,12。しかし、これらの手動による細胞カウント技術は面倒で時間がかかり、人為的ミスが発生しやすい^8,10。エラーの一般的な原因には、血液の不適切な混合または希釈、染色の問題、血球計算盤チャンバーの不適切なローディングなどがあり、これらはすべて不正確な細胞数につながる可能性があります¹²。さらに、手動の血液学的分析では、結果の信頼性と再現性を確保するために、高度な専門知識と経験が必要です⁷。正確で効率的な診断ツールへの需要が高まる中、魚の個体群の免疫状態を深く理解する革新的な方法の開発は、この分野を前進させる上でますます重要なステップとなっています。

フローサイトメトリーは、この文脈における強力なツールとして浮上しており、白血球集団と細胞^生存率8を解析するためのハイスループットで定量的なアプローチを提供しています。この最新の診断技術により、混合集団の個々の細胞の迅速な検出、カウント、および特性評価が驚くべき精度で可能になります¹³。さらに、フローサイトメトリーでは、表現型と機能的特性の両方について、マルチパラメトリックな同時測定が可能です。人間の臨床現場や獣医学で広く使用されていますが、魚の白血球の研究におけるその応用は非常に限られています⁸。さまざまな魚種1,6,8,13,14,15,16,17についていくつかの研究が行われてきましたが、いくつかの重要な課題に対処する必要があります。これらの解析における大きな課題の1つは、末梢血や頭部腎臓^などのリンパ組織から抽出した生きた白血球の懸濁液を得る必要があることである1。白血球の単離は、魚類の独特な特性、すなわち有核赤血球の存在のためにしばしば困難である。赤血球による意図しない汚染は、そのサイズ、卵形、および核の存在により、白血球の分析を妨げる可能性があります¹。したがって、白血球懸濁液から赤血球を除去して高い純度を達成し、フローサイトメトリー分析によって白血球の表現型および機能特性を研究することが不可欠です。哺乳動物では、白血球の単離には通常、赤血球の浸透圧溶解またはFicollまたはPercoll¹による密度勾配分離が含まれます。しかし、浸透圧溶解は、赤血球が有核化しているため、海産魚にも淡水魚にも効果がなく、適切に溶解することはできません¹。代わりに、密度勾配分離は、細胞の安定性を経時的に効果的に維持するため、魚類に適しています¹。いくつかの研究では、稚魚から白血球を単離することに成功していますが、多くの研究はまだ主に成魚の集団に焦点を当てています¹⁷。それにもかかわらず、初期の段階は病気の発生に対してより脆弱であるだけでなく、サイズも小さいため、サンプリングプロセスがより複雑で困難になります。また、現在の分析法では、白血球の生存率を評価するには即時の処理が必要なため、一度にサンプル数や反復数が限られていることが多いという制限もあります。サンプル処理の遅延は、細胞の生存率に悪影響を及ぼし、サンプリングプロセスにさらなる複雑さをもたらし、研究全体を危険にさらす可能性があります。

私たちの知る限りでは、発表された方法のいずれも、フローサイトメトリーによるその後の生存率解析のために白血球細胞をうまく固定していません。本研究は、南欧諸国で養殖されている主要な魚種である金箔鯛(Sparus aurata)の頭部腎臓から白血球をPercoll密度勾配分離法を用いて効率的に単離する方法を確立した先駆的な研究です。また、フローサイトメトリーを通じて主要な白血球集団(リンパ球、単球、および顆粒球)を同定しながら、生細胞と死細胞を区別する改良された染色ベースの技術も紹介します。改良されたプロトコールには細胞固定が伴い、処置後1ヶ月までの生存細胞解析が可能になります。このフローサイトメトリープロトコルの実装は、免疫評価に通常必要な時間と労力を大幅に削減する可能性を秘めており、水産養殖セクター内の研究とより実用的なアプリケーションの両方にとって貴重な技術となります。この方法論の適用は、多数のサンプルを分析し、細胞を保存し、フローサイトメトリーによる遅延分析を可能にするという利点を提供します。したがって、魚の免疫メカニズムや、細胞の生存能力がさまざまな環境条件や実験条件によってどのように影響を受けるかについて、貴重な洞察を得ることは非常に役立つかもしれません。さらに、この生存率アッセイは、特定の免疫細胞集団のマルチパラメトリック表現型および機能特性評価と統合することができます。このアプローチにより、いくつかの免疫学的パラメータのより包括的な解析が可能になり、それらを対応する細胞タイプに直接リンクし、免疫応答をより明確に理解することができます。これらの知見は、水産養殖における疾病管理のアプローチの改善など、より効果的な戦略の開発に貢献する可能性がある。

プロトコル

このプロトコルは、動物実験の認定を受けた研究者(EU機能AおよびB)によって実施されなければなりません。動物の取り扱いとサンプル収集に関連するすべての手順は、ARRIVEガイドライン(Animal Research: in vivo Experimentsの報告)に準拠し、欧州実験動物科学協会連盟(FELASA)の推奨事項に従って、動物の世話と使用に関する倫理基準を遵守しなければなりません。本研究は、これらすべての基準と、実験動物科学に関するポルトガルの法律(EU指令2010/63;政令-法律第113/2013号)。この研究は、IPMAの動物福祉・倫理機関(ORBEA, LABVIVOS-002-AquaClimAdapt)によって承認され、国立生物動物使用局(National Authority for the Use of Live Animals)の監督下にある食品獣医学総局(DGAV)によって、倫理クリアランス番号20596/25-Sで承認されました。

1. 研究モデルと生物のメンテナンス

注:この研究は、平均体重が30.0±5.0 g、全長が12.0 ± 2.0 cmの幼魚である金箔鯛(Sparus aurata)のために特別に設計されました。この方法は、他の魚種に直接適用できない場合があります。これは、異なる種が白血球の分離、細胞固定、および生存率の評価に影響を与える可能性のある独自の生理学的および免疫学的特性を持っているためです。他の種については、プロトコルへの適応が必要になる場合があり、各対象種に対して条件を最適化するための予備的な研究が推奨される。

1. 魚の順応(検疫期間)
   1. 魚を大容量の水槽に均等に分配します(たとえば、それぞれ合計容量が660 Lの2つの水槽- 補足図1を参照)。
      注:使用するタンクは、効率的な水の使用と水質の管理の改善を可能にする再循環養殖システム(RAS)の一部である場合があります。RASでは、水はシステム内で継続的にリサイクルおよび処理され、魚に安定した制御された環境を提供します。この設定は、魚の健康と成長に最適な条件を維持し、均一な分布を確保し、研究中のストレスを最小限に抑えるのに役立ちます。
   2. 最適な非生物的条件を維持します。
      1. 魚を自然の生息地を模倣した条件下で3週間隔離します。
         温度:20.0 ± 0.5°C;
         溶存酸素:7.2 ± 0.2 mg / L;
         塩分濃度:35.0 ± 0.5 ‰;
         pH:8.0±0.1単位;
         日長:14時間明るい/10時間暗い。
         注意: 理想的なメンテナンス条件は、魚種によって異なる場合があります。他の種には異なる要件がある場合があるため、生物の健康と福祉を確保するために、これらの条件を対象種の特定のニーズに適合させることが重要です。また、海水温や日長は季節によって変化するため、実験室で自然条件を再現する際には季節変動を考慮する必要があります。
2. 実験的研究を開始します。
   1. 各ケーススタディの実験セットアップデザインに基づいて、必要な水槽と魚の数を定義します。
   2. 検疫期間後、魚を独立したRASに移します( 補足図2を参照)。
      1. 各システムにプロテインスキマーを装備して、水から過剰な有機化合物を除去します。物理的ろ過(フィルターバッグ[400μm]、フィルタースポンジ、グラスウール);生物学的ろ過(バイオボール[1.5インチ]、紫外線水滅菌器、水中エアストーン)。自動海水冷凍システムと水中デジタルヒーターは、どちらも温度センサーを備えたコンピューター制御システム(ProfiLux)に接続され、各タンクの温度を調整します。溶存酸素を制御するために、各タンクにエアストーンを沈めます。
   3. 実験を進める前に、魚を新しいシステムに2週間順応させます。
   4. 日常のメンテナンスを行う
      1. 各インキュベーションタンクから魚の糞を取り除き、25%の海水の更新を行います。
      2. ポータブル精密温度計を使用して温度を測定します。
      3. マルチパラメータ測定器を使用して、他の海水非生物的パラメータ(塩分、溶存酸素、pH)を監視します。
      4. 必要に応じて海水の非生物的パラメータを調整し、実験全体の安定性を確保します。
         注:実験システムの非生物的条件は、各ケーススタディの特定の要件によって異なります。例えば、この研究が季節変化や海洋熱波のシミュレーションを目的としている場合、気温と日長は、自然の季節変動を模倣するようにそれに応じて調整する必要があります。同様に、研究が低酸素状態または海洋酸性化のシミュレーションに焦点を当てている場合は、海水の酸素レベルとpHを調整する必要があります。これにより、実験条件が可能な限り現実的で関連性のあるものになり、研究結果の妥当性と適用性が向上します。
      5. 魚の健康と幸福を評価し、ステップ1.2.4.6-1.2.4.8で説明されているように、ストレスや病気の兆候を特定して管理します。
      6. 不規則な水泳、食欲不振、無気力、攻撃性、孤立などの異常な行動を探します。
      7. 病変、潰瘍、変色、ひれの締め付け、過度の粘液、急速な鰓の動きなど、病気の兆候がないか確認してください。
      8. すべての観察を記録し、日付と実行したアクションを記録します。
   5. 毎週水質検査を実施します。
      1. 比色試験を使用して、アンモニア(NH₃ / NH₄)、亜硝酸塩(NO₂^-)、および硝酸塩(NO₃^-)のレベルを測定します。
         注:これらのパラメータがすべて検出可能なレベルを下回っていることを確認してください。レベルが制限を超える場合は、追加の水交換を実行するか、曝気を増やすか、ろ過を調整します。
   6. 魚の栄養を給餌し、監視します。
      1. 稚魚の特定の栄養要件を満たす高品質の食事を提供します(食事の詳細な組成の例については、 補足表1 を参照してください)。
         注:アクアフィードペレットのサイズ(2〜3 mm)が幼魚に適していることを確認し、摂取と消化を容易にします。
      2. 魚の1日の平均体重の2%に対応するように飼料量を調整します。
      3. 魚に1日2回、午前と午後に1回、手動で魚に餌をやります(安定した給餌ルーチンを維持するために特定の時間を設定します)。

2.魚のサンプリング、安楽死、解剖、および頭部腎臓の収集

1. 水槽から魚を試食します。
   1. サンプリングバイアスを避けるために、水槽からランダムに魚を選択します。
   2. ネットを使用して、魚をタンクの水で満たされた一時的な保管容器にそっと移します。
      注意: ストレスを軽減するために、取り扱い時間を最小限に抑えてください。
2. 安楽死溶液を準備します。
   1. 魚を保持するのに適した適切な容器(例:3Lバケツ)を使用してください。
   2. 適量のトリカイン(MS-222)を海水に溶解して、最終濃度200〜300 mg / L¹⁸を達成します(注意:補足表2および補足ファイル1を参照)。
   3. 重炭酸ナトリウムを含む溶液を7.2〜7.5のpHに緩衝します。
3. 安楽死解決策を投与します。
   1. 魚を少なくとも10分間、または手術運動の停止と反射の喪失が観察されるまで安楽死溶液に入れます(外部刺激に反応しないことを確認して安楽死を確認します)。
   2. 魚の体重(g)と全長(cm)を記録します。
4. 魚の解剖を行います。
   注:最適なサンプル品質と細胞生存率を確保するために、解剖プロセスはできるだけ早く、理想的には安楽死後5分以内に完了する必要があります。
   1. サンプリングおよび処理中の変動を最小限に抑えるために、エアコンを使用してラボの温度が19°Cに保たれていることを確認してください。
   2. 解剖ツール(できれば可能な限りオートクレーブ金属器具)を滅菌し、70%エタノールで清潔なワークスペースを設定します(注意、 補足表2を参照)。
   3. 安楽死させた魚を横にして、頭を利き手でない方に向けた滅菌解剖トレイに置きます。
   4. メスを使用して、通気口(肛門)から鰓に向かって魚の腹側正中線に沿って慎重に切開します。
      注意: 内臓を傷つけないように、深く切りすぎないように注意してください。
   5. 解剖ハサミを慎重に使用して切開部を伸ばし、内臓を露出させます。体壁のフラップをそっと持ち上げて、内部の解剖学的構造をはっきりと表示します。
   6. 頭部腎臓の位置を特定する:頭部腎臓は、鰓のすぐ後ろ、体腔の前背部近くに位置し、体腔の上側に沿って脊柱の下に伸びています。
      注:頭部腎臓は通常、周囲の組織に比べて色が濃いです(図1)。
   7. 脂肪や結合組織などの周囲の組織を慎重に取り除き、頭部の腎臓をよりよく視覚化します。
      注:このステップでは、頭部の腎臓の損傷を避けるために、繊細な取り扱いが必要です。
   8. 先端の細い鉗子とハサミを使用して、頭の腎臓を慎重に持ち上げ、周囲の組織から解放するためにその周りを正確に切り込みます。
      注意: 損傷を防ぐために、ティッシュを優しく取り扱ってください。体重約30gの魚では、頭の腎臓の重さは約20〜30mgと予想されます。
   9. 切除した臓器を直ちに滅菌ペトリ皿内のセルストレーナー(100μmナイロンメッシュ)に入れて、無菌性を確保し、その後の処理ステップを容易にします。
      注:この時点から、細胞の生存率を維持するために、すべてのステップをできるだけ早く(5分以内に)実行する必要があります。サンプルを冷たく保つために、氷で満たされた容器にペトリ皿を置き、アルミホイルで覆った状態で次の手順を実行します。

図1:頭部腎臓の位置: (A)鰓の後ろと体腔の前背部に沿った頭部腎臓の典型的な位置を示すイラスト。(B)鯛の頭部腎臓の代表的な画像で、周囲の組織に比べて暗い色を強調しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 頭部腎白血球の単離(図2)

図2: 頭部腎臓からの白血球分離の実例説明。このプロトコールには、組織の均質化から始まり、密度勾配遠心分離、白血球リングの収集、白血球リングの洗浄、細胞濃度の再懸濁と調整で終わるいくつかのステップが含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 組織を均質化します。
   1. 2 mLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)を滅菌ペトリ皿に入れます。.
   2. セルストレーナのメッシュ(100μmナイロンメッシュ)がHBSSに接触しているが、完全に水没していないことを確認します。
   3. 注射器のプランジャーを使用して、細胞ストレーナーで頭部腎臓を浸軟させます。穏やかな圧力を加えて臓器の断片をナイロンメッシュに押し込み、細胞懸濁液を作成します。
      注:複数のサンプルを処理する場合、細胞懸濁液を含むシャーレは、次のステップまで数分間、4°Cの冷蔵庫に保存できます。この細胞懸濁液は、白血球の単離に使用されます。
2. 密度勾配遠心分離を行います。
   1. 密度1.077 g/mL、浸透圧353 mOsm/kg、pH 7.4の密度グラジエント培地溶液を調製します( 補足ファイル1を参照)。
      注:浸透圧は魚種によって異なる場合があるため、密度勾配培地溶液の浸透圧を各種の特定の要件を満たすように調整することが重要です。
   2. 5 mLのポリスチレン丸底チューブに、600 μLの密度勾配培地溶液を慎重に加えます。
   3. 細胞懸濁液(2 mL)を取り、密度勾配培地を含むチューブにゆっくりと加えます。最初の一滴は非常に重要です - 密度勾配中相を不安定にしないように、非常に穏やかに追加します。
      注:これは3:10の比率で行う必要があります(密度勾配培地:細胞懸濁液)。滅菌済みの1 mLパスツールピペットを使用して、正確かつ穏やかに添加します。ピペットの先端がチューブの側面に接触していることを確認してください。サンプルを密度勾配媒体と混合することは避けてください。
   4. ブレーキをオフにした状態で、チューブを400 x g で45分間、4°Cで遠心分離します。これにより、プロセス中にレイヤーがそのまま残ります。
      注:遠心分離後、明確な層が見えるはずです。白血球は、密度勾配培地と細胞破片ペレットとの間の界面にリングを形成します(図3)。

図3: 白血球は、密度勾配培地と細胞デブリペレットとの間の界面で環状に形成されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 白血球リングを収集します。
   1. 滅菌パスツールピペットを使用して、白血球リング(~100 μL)を穏やかに吸引し、2 mLの微量遠心チューブに移します。
      注意: 汚染を避けるために、層を大きく乱さないように注意してください。白血球リングに破片や暗い懸濁液が含まれているように見える場合は、採取した白血球懸濁液を新しいミニセルストレーナー(100μm)に通して純度を確保することをお勧めします。ミニセルストレーナーを2mLの微量遠心チューブの上に置き、白血球懸濁液をストレーナーを通して穏やかに移します。
4. 白血球リングを洗浄します。
   1. 白血球リングを含む微量遠心チューブにHBSSを容量が2 mLに達するまで加え、細胞を穏やかに再懸濁します。
      注:チューブを氷で満たされた容器に保管し、アルミホイルで覆って、サンプルを低温に保ちます。チューブが氷に直接接触しないようにしてください。この冷却設定は、洗浄プロセス全体を通して維持します。
   2. サンプルを400 × g で4°Cで10分間遠心分離します(ブレーキをオンにすることができます)。
   3. 遠心分離後、上清を慎重に捨て、ペレットを底に残します(ほとんど見えない場合があります)。
   4. ペレットに不純物がなくなるまで、洗浄手順(HBSSの添加、再懸濁、遠心分離、上清の廃棄)を繰り返します。
5. 再懸濁して細胞濃度を調整します。
   1. 洗浄に使用したのと同じ2 mL微量遠心チューブ内のHBSS1 mLに細胞を再懸濁します。
   2. 1 mLあたり1 × 10⁴ 4 から 1 × 10⁶ 細胞の細胞濃度を達成します。最初のペレットが大きい場合、細胞濃度を所望の範囲に希釈するために追加のHBSSが必要になることがあります。細胞懸濁液を15mLチューブに移し、得られた細胞数に基づいて必要に応じてHBSSを追加します。
      注:プロセスを容易にするために、自動セルカウンターの使用をお勧めします。

4. 白血球の染色と固定(図4)

注:LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kitsは、フローサイトメトリーを使用して固定細胞の細胞生存率を評価するための改良された方法を提供します。これらのアッセイは、細胞アミンと相互作用する蛍光反応性色素を利用します。細胞膜が損なわれると、色素は細胞に浸透し、細胞内部と細胞表面の両方で遊離アミンと反応し、強い蛍光染色を引き起こす可能性があります。逆に、生細胞では、細胞表面のアミンのみが色素と反応するため、染色が比較的暗くなります。ホルムアルデヒドで固定した後も染色強度が維持され、微生物の増殖を防ぐことでサンプルが保存されます。LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kitsは、蛍光色素以外は同一で、青色、紫色、水色、黄色、緑色、赤色、遠赤色、または近赤外(赤外線)からお選びいただけます。本研究では、Near-IR蛍光反応性色素を使用しました。さらに、この単色アッセイにより、マルチカラー実験で他のパラメータを並行して試験することができます。

1. 染料を準備します。
   1. 試薬を室温(RT)にしてください:キャップを取り外す前に、蛍光反応性色素のバイアル1つと無水ジメチルスルホキシド(DMSO)のバイアルをRTに到達させます。
   2. 色素を再構成する:反応性色素を含むバイアルに50μLのDMSOを加えます。よく混ぜて、染料が完全に溶けたことを確認します。
   3. 再構成した色素溶液は、できるだけ早く、できれば数時間以内に使用してください。
      注:各キットには反応性色素のバイアルが5本含まれており、少なくとも40個の細胞サンプルを染色するのに十分な材料を提供します。しかし、再溶解後、染料のDMSO溶液は、特に湿気にさらされると比較的不安定になります。未使用の部分は、光や湿気から保護され、≤〜20°Cで最大2週間保存できます。
2. 細胞を染色して固定します。
   注:細胞染色に適したバッファーには、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、およびダルベッコPBS(D-PBS)が含まれますが、ウシ血清アルブミンや血清などの無関係なタンパク質を含んでいない限り、これらの抗体は軟化しています。アミノ反応性色素を使用する場合は、細胞の再懸濁および洗浄のために、トリスバッファーおよびアジ化ナトリウムまたは無関係タンパク質を含む溶液は避けてください。本研究では、浸透圧バランスの維持に役立ち、染色過程で細胞の代謝と生存能力をサポートする必須イオンとグルコースを提供するバランスの取れたイオン組成を持つHBSSを使用しました。また、HBSSには外来タンパク質が含まれていないため、反応性色素との干渉を防ぎ、正確な生存率評価を保証します。
   1. 細胞をカウントし、HBSSで密度を1 x 10⁶ 細胞/mLに調整した後、この細胞懸濁液1 mLを2 mLの微量遠心チューブに移します。
      1. 毎日、少なくとも1つのサンプルで細胞死を誘導し、生細胞と死細胞の間の蛍光強度閾値を設定するためのコントロールとして使用します。次のように、微量遠心チューブにサンプルを調製します。
         チューブ1:生細胞 - 未染色
         チューブ 2:生細胞 - 染色済み
         チューブ3:死細胞 - 未染色
         チューブ4:死細胞 - 染色済み
         注:これらの4つのチューブは、コントロールとして各実験の1つのサンプルに対してのみ準備する必要があります。残りのサンプルについては、生きていた細胞と死んでいた細胞に関する情報が得られるため、必要なチューブは2本(チューブ1:サンプル-未染色とチューブ2:サンプル-染色)のみです。
   2. 細胞死のポジティブコントロール:標識したチューブ「Dead unstained」(チューブ3)と「Dead-stained」(チューブ4)を50°Cの水浴に7分間入れ、熱処理により細胞死を誘導します。
   3. 細胞の染色:チューブ2および4(染色するチューブ)中の細胞懸濁液1 mLに、再構成した蛍光反応性色素(ステップ4.1.2)1 μLを加え、よく混合します。
   4. 光から保護して、室温で30分間インキュベートします。
      注:固定が不要な場合は、以下の手順4.2.5〜4.2.7をスキップできます。代わりに、1%ウシ血清アルブミンを含むHBSS1 mLで細胞を2回洗浄し( 補足ファイル1を参照)、1%ウシ血清アルブミンを含むHBSS1 mLに再懸濁します。フローサイトメーターでできるだけ早く解析を実施します。そうしないと、細胞が固定されていないため、細胞の生存率が損なわれる可能性があります。
   5. 1 mLのHBSSで細胞を2回洗浄し、900 μLのHBSSで細胞を再懸濁します。
   6. 37%ホルムアルデヒドを100μL加えます(注意、 補足表2を参照)。
   7. 室温で15分間インキュベートします。
   8. 1 mLのHBSSと1%ウシ血清アルブミン(BSA)で2回洗浄し、1 mLのHBSSと1%BSAで細胞を再懸濁します。
   9. サンプルは4°Cの冷蔵庫で保存します。 固定後1ヶ月以内に細胞を解析してください。
   10. 適切な励起および検出チャネルを用いたフローサイトメトリーにより、固定細胞懸濁液を解析します。
       注意: 正しい励起チャンネルと検出チャンネルは、使用する機器によって異なる場合があります( 補足表3を参照)。

図4: 白血球の染色と固定の実例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. フローサイトメトリー

1. データを取得します。
   注:フローサイトメーターで従うべき手順は、使用するサイトメーターによって異なる場合があります。この研究では、Attune NTxフローサイトメーターを使用してデータを取得しました。
   1. サンプルを実行します。
   2. サンプルチューブをサンプルポートに入れます。
   3. startを押して取得を開始し、イベントレート(イベント/秒)が安定したらrecordをクリックします。
   4. 信頼性の高い分析のために、シングレットゲートの各サンプルに対して最低10,000のイベントを記録します。
   5. 各サンプルのすべてのデータを保存し、外付けドライブまたはクラウドストレージにバックアップします。
2. データを分析します。
   注:フローサイトメトリー解析には、いくつかのソフトウェアオプションが利用可能です。本研究では、FlowJo v10.8.1¹⁹を用いてデータ解析を行いました。
   1. データファイルのロード:フローサイトメトリー解析ソフトウェアを起動し、実験から取得した.fcsファイルをアップロードします。
   2. データを視覚化します(図5A):前方散乱光(FSC-A)(XX)と側方散乱光(SSC-A)(YY)をプロットして、セルのサイズと粒度を評価します。
      注:このプロットは、細胞集団を特定し、その散乱特性に基づいて破片を除外するために一般的に使用されます。
   3. 一重項セルゲーティングとマルチプレットの除外(図5B):前方散布図領域(FSC-A)と前方散布図高さ(FSC-H)のプロットを使用して、マルチプレットを除外します。ゲートを描画して、グラフに整列されたすべてのイベントを含め (単一セル)、整列されていないイベントを除外します (マルチプレット)。サンプルにFSCが非常に低いイベントがある場合は、それらをシングルセルのゲートに含めず、一重項セルのみを残して除外します。
   4. 白血球集団の同定(図5C):FSC-A / SSC-Aプロファイルに基づいて3つの白血球集団を区別します:FSC-A^高/ SSC-A^高 は顆粒球、FSC-A^中/ SSC-A^中等 部は単球、FSC-A^低/ SSC-A^低 はリンパ球です。
   5. 生存率ゲーティング(図5D):対応する蛍光チャネル(NIR、RL3-A)での生存率色素染色の閾値を設定します。生細胞と死細胞は、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainによる染色強度に基づいて定義されます:薄暗い染色細胞を生細胞と定義し、強く染色した細胞を死細胞と定義します。
   6. ポピュレーション統計:各ゲートの合計イベント(セル)や、合計セルとゲートセルの割合など、ソフトウェアによって提供される統計を確認します。
   7. データのエクスポート:データをスプレッドシートにエクスポートし、適切な統計ソフトウェア(GraphPad PrismまたはR)を使用してさらに統計分析を行います。
      注:分析方法の選択は、研究の目的によって異なります。

図5:頭部腎細胞の生存率評価のためのフローサイトメトリーゲーティング戦略: (A)収集されたすべてのイベントのFSC-A/SSC-Aプロファイルを表します。(B)フォワードスキャッター(FSC-A)/フォワードスキャッター(FSC-H)グラフの線形性に基づくシングレット領域の定義に基づくマルチプレット除外を表します。(C) FSC-A/SSC-A に基づいて定義された 3 つの主要な母集団を表し、マルチプレット除外後。(D)Live/Dead Viability色素染色を示すヒストグラムを表します。生細胞と死細胞を区別できる閾値を設定するために、白血球を軽度の熱ショック(50°C、7分)にさらした後、生存率色素で染色しました。高染色強度の陽性細胞(++)は死細胞であり、低染色陽性細胞(+-)は生細胞です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

図6は、幼魚の頭の腎臓から単離された白血球集団と、この研究で説明したプロトコルを使用したそれらの細胞生存率を示す代表的なフローサイトメトリーデータを示しています。この図は、魚が最適な条件にさらされた細胞生存率の高いサンプル(図6A)と、細胞が熱ストレスにさらされた細?...

ディスカッション

この研究で開発された方法は、魚類免疫学研究の大幅な進歩を表しており、魚類の免疫応答の理解と海洋資源の持続可能性を向上させることが期待されています。 S. aurata は、スプラダエ科の貴重な海産魚種であり、その生態学的および経済的関連性、生理学、免疫学、毒物学、水産養殖などのいくつかの研究分野での実験室研究における多様性など、いくつ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air Stones	N/A	N/A
Aquafeed	SPAROS, Lda., Portugal	N/A	High-quality diet
Automatic Cell Counting Equipment	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE automatic cell counter (NanoEnteK)
Automatic Water Refrigeration Systems	Foshan Weinuo Refrigeration Equipment Co., Ltd, China	N/A
Bio balls 1.5" Aquarium Pond Filter	TMC Iberia, Portugal	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Germany	A7906
Bucket (3 L)	N/A	N/A	To prepare and carry out euthanasia
Buckets (5 L)	N/A	N/A	To transport the animals
Cell Strainers	Jetbiofil, China	CSS-013-100	Cell Strainer, 100 μm nylon mesh, Sterile, Yellow
Centrifugue	Fisher Scientific, Germany	N/A	accuSpin Micro 17 R
Colorimetric Test Kit for Ammonia (NH4+/NH3)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrate (NO3-)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrite (NO2-)	Tropic Marin, USA	N/A
Computer	N/A	N/A	To acquire and analyse the data obtained from the flow cytometer
Computerized Control System (Profilux)	GHL, Germany	N/A	ProfiLux 3 Outdoor
Deionized water	N/A	N/A	To clean the Flow Cytometer
Density Gradient Medium: Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany	17-0891-01
Digital scale	KERN & Sohn GmbH, Germany	N/A	KERN EMS 300-3
Ethanol 70%	Millipore, Supelco, Portugal	EX0281	To keep the workspace clean
EVE Cell Counting Slides	NanoEnteK, Korea	N/A
Falcon Tubes (15 mL)	pluriSelect Life Science, Germany	05-00002-01	Sterile
Filter bag	TMC Iberia, Portugal	N/A	400 micron
Filter Sponge	N/A	N/A
Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune flow cytometer
FlowJo v10.8.1 Software	BD Life Sciences	N/A
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich, Germany	8.18708
Glass Wool	N/A	N/A
Hanks' Balanced Salt Solution	Merck Life Science S.L, Portugal	H6648	Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits	Life Technologies Europe, Netherlands	L10119	Near-IR fluorescent reactive dye + DMSO
Main Water Pumps	EHEIM, Germany		Universal 1200
Microcentrifuge Tubes (2 mL)	BRAND, Merck, Germany	Z628034	Sterile
Micropipette Tips	Sartorius, Germany	790010, 790200, 791000	Compatible with Sartorius, 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Micropipettes	Sartorius, Germany	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Mini Cell Strainers	pluriSelect Life Science Global Headoffice, Germany	43-10100-50	PluriStrainer 100 µm nylon mesh, Sterile
Multi-Parameter Measuring Instrument	WTW, Germany		Multi 3420 SET G + IDS digital conductivity cell (TetraCon 925) + Optical IDS DO sensor (FDO 925) + IDS pH-electrode (SenTix 940)
Pasteur Pipettes (1 mL, 5 mL)	Humeau Expert du laboratoire, France	248295	Sterile
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1194.500	60 x 15 mm, Polystyrene, Sterile
pH Meter	Hanna Instruments Inc., Romania		HANNA HI2211
Polystyrene round-bottom Falcon tubes (5 mL)	Fisher Scientific, Germany	14-959-2A	Sterile
Portable Precision Thermometer	Ebro Electronic, Germany	N/A	TFX 430
Protein Skimmers	Mantis	N/A	Tornado 120
Quality control beads/Performance test beads	Thermofisher Scientific, USA	N/A
Quarantine Tanks	N/A	N/A	Tanks with 660 L total volume
Rectangular Glass Tanks/Aquariums	N/A	N/A	Tanks with 200 L total volume
Refrigerator	N/A	N/A	To store the samples at 4 °C
Ruler 30 cm	N/A	N/A	To measure the fish's length
Sodium bicarbonate	Honeywell Fluka, Germany	31437	Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sterile Dissection Tools	N/A	N/A	(e.g. scalpel, scissors, fine-tipped forceps, dissecting tray/board)
Submerged Digital Heaters	TMC Iberia, Portugal		300 W, V2Therm Digital Heaters
Syringes 1 mL	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	Sterile, HSW Soft-Ject Syringes to macerate head-kidney
Temperature Sensors	GHL, Germany		PT 1000
Tricaine (MS-222)	ThermoFisher Scientific, Germany	118000500	Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt, 98% (C10H15NO5S)
Ultraviolet Water Sterilizer	EHEIM, Germany	5305010	ClearUVC-36
Water Bath	Fisher Scientific, Germany	N/A	Fisherbrand IsotempTM (P/N U01318)
Water-resistant Luminaires	N/A	N/A