通过流式细胞术分离、固定和表征幼年 Gilthead 海鲷头肾白细胞

摘要

这份手稿描述了从金头鲷头肾中提取的白细胞的分离和固定，以及通过流式细胞术评估它们的活力。这项工作有助于方案的标准化，并在不影响样品质量的情况下处理更多样品，促进鱼类免疫学知识的进步。

摘要

免疫力对于生物体的生理调节至关重要，是抵御病原体和环境压力源的主要防御措施。免疫细胞的分离和分析为免疫对外部压力的反应提供了关键见解。然而，对于研究较少的物种（如海洋鱼类），缺乏统一的方案，往往会导致技术和分析挑战，阻碍数据解释和对物种特异性免疫反应的透彻理解。本研究旨在建立一种基于流式细胞术的优化分析程序，以表征和确定幼年金头鲷 （Sparus aurata） 头肾（硬骨鱼的主要造血器官）白细胞的活力。该程序首先使用 Hanks 平衡盐溶液通过均质化过程分离白细胞，然后采用优化的 Percoll 密度梯度离心方法，以确保白细胞的高回收率，同时将高效后续流式细胞术分析所需的红细胞污染降至最低。此外，采用了一种使用细胞反应性染料的新技术 （LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit） 根据荧光染色模式区分活细胞和死细胞。用 3.7% 甲醛实现固定，保留细胞形态、活力和染色效率。流式细胞术分析成功鉴定了三个主要的白细胞群：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。这种方法不仅可以进行活力测试，还可以准确区分细胞类型。流式细胞术方案的改进通过提高免疫细胞分析的准确性和效率，代表了鱼类免疫学向前迈进了一步。此外，通过允许固定细胞以供以后分析，该方案显着减少了免疫评估所需的时间和精力，使其成为各个研究领域的研究和实际应用的宝贵工具。

引言

免疫力在生物体的生理调节中起着核心作用，是抵御各种病原体和环境压力源的主要防御措施¹。与其他脊椎动物一样，鱼类具有复杂、动态和协调的免疫系统，这对它们的整体健康和福祉至关重要¹。

硬骨鱼具有先天免疫系统和适应性免疫系统，它们同时发挥作用以检测、响应和中和有害入侵者²。先天免疫系统充当第一道防线，对病原体提供即时和非特异性反应²，而适应性免疫系统随着时间的推移而发展，提供更专业的反应，使鱼类能够识别特定病原体并建立免疫记忆³。鱼类免疫系统依靠专门的原代淋巴器官（即胸腺和头肾）和次级淋巴器官（例如脾脏和粘膜相关淋巴组织 （MALT））来支持免疫防御并维持整体健康⁴。头肾是硬骨鱼的主要造血器官，在免疫细胞（包括白细胞）的发育和成熟中起着至关重要的作用⁵。

近年来，在研究几种鱼类的免疫反应方面取得了重大进展²。一个重点领域是了解白细胞群及其活性。白细胞，也称为白细胞，通常分为单核细胞、淋巴细胞和粒细胞，在鱼类的免疫防御中起着至关重要的作用。它们具有吞噬细胞，负责吞噬和破坏病原体并释放杀菌活性氧，有助于消除入侵的微生物⁶。白细胞还参与炎症过程，有助于隔离和根除感染，同时促进组织修复⁶。白细胞群的丰度和活性是动物健康和疾病中免疫状态的重要指标 ^7,8。

一些研究表明，应激因素（如不利的环境条件）可以改变红细胞的数量和形态以及循环白细胞的组成 ^9,10。例如，正如 Franke 等人（2024 年）所回顾的那样，在气候变化情景下研究鱼类的免疫系统至关重要，因为环境压力源会损害鱼类的免疫力，增加疾病易感性，并增强某些病原体的传染性，最终加速疾病进展¹¹。此外，了解鱼类的免疫力不仅对于推进基础生物学研究至关重要，而且对于支持社会各个部门（例如水产养殖业）也至关重要。随着水产养殖在全球范围内的不断发展，确保养殖鱼类的健康和福利变得越来越重要。然而，鱼类福利仍然是一个相对较新的研究领域，养殖鱼类的免疫反应仍然需要彻底和标准化的评估。优先考虑免疫反应研究至关重要，因为获得的信息可以通过有效和量身定制的方法提高水产养殖的可持续性和生产力，从而提高养殖动物的福利和复原力。

白细胞定量和鉴定通常使用血液学方法进行，例如使用 Bürker、Neubauer 或 Thoma 血细胞计数器进行手动计数，以及染色的血涂片 ^7,10。为了帮助血细胞的可视化和分化，通常使用 Wright、May-Grünwald-Giemsa 和 Hemacolor 等染色试剂盒 ^7,12。然而，这些手动细胞计数技术繁琐、耗时且容易出现人为错误 ^8,10。常见的错误来源包括血液混合或稀释不足、染色问题以及血细胞计数器室加载不正确，所有这些都可能导致细胞计数不准确¹²。此外，手动血液学分析需要高水平的专业知识和经验，以确保结果的可靠性和可重复性⁷。随着对精确和高效诊断工具的需求增加，开发深入了解鱼类种群免疫状态的创新方法成为推进该领域越来越重要的一步。

在这种情况式细胞术已成为一种强大的工具，它提供了一种高通量、定量的方法来分析白细胞群和细胞活力⁸。这种现代诊断技术能够以极高的精度对混合细胞群中的单个细胞进行快速检测、计数和表征¹³。此外，流式细胞术允许同时进行表型和功能表征的多参数测量。尽管广泛用于人类临床环境和兽医学，但它在鱼白细胞研究中的应用仍然非常有限⁸。虽然已经对不同的鱼类物种进行了一些研究 1,6,8,13,14,15,16,17，但仍需要解决一些关键挑战。这些分析中的一个主要挑战是必须获得从外周血或淋巴组织（如头肾）中提取的活白细胞的悬浮液¹。由于硬骨鱼的一个独特特征：有核红细胞的存在，白细胞的分离通常很困难。由于红细胞的大小、卵形和细胞核的存在，红细胞的意外污染会干扰白细胞分析¹。因此，必须从白细胞悬液中去除红细胞以获得高白细胞纯度，并通过流式细胞术分析研究白细胞的表型和功能特征。在哺乳动物中，白细胞分离通常涉及红细胞渗透裂解或用 Ficoll 或 Percoll¹ 进行密度梯度分离。然而，渗透裂解对海水鱼和淡水鱼都是无效的，因为它们的有核红细胞不能被正确裂解¹。相反，密度梯度分离是鱼类的首选，因为它可以有效地保持细胞随时间的稳定性¹。尽管一些研究已经成功地从幼鱼中分离出白细胞，但许多研究仍然主要集中在成年鱼群^{上 17}。尽管如此，早期阶段不仅更容易受到疾病爆发的影响，而且规模也较小，这使得采样过程更加复杂和具有挑战性。另一个限制是当前方法通常仅限于一次有限数量的样品或重复，因为评估白细胞活力需要立即处理。样品处理的延迟会对细胞活力产生不利影响，从而给样品过程带来进一步的复杂性，并可能危及整个工作。

据我们所知，已发表的方法均未成功固定白细胞以进行随后的流式细胞术活力分析。本研究具有开创性，因为它建立了一种有效的方法，用于使用 Percoll 密度梯度分离方法从南欧国家养殖的主要鱼类幼鱼金头鲷 （Sparus aurata） 的头肾中分离白细胞。我们还提出了一种改进的基于染色的技术，该技术可以区分活细胞和死细胞，同时通过流式细胞术识别主要的白细胞群（淋巴细胞、单核细胞和粒细胞）。改进的方案需要细胞固定，这使得术后长达 1 个月的活细胞分析成为可能。这种流式细胞术方案的实施有可能显着减少免疫评估通常需要的时间和精力，使其成为水产养殖部门研究和更实际应用的宝贵技术。该方法的应用为分析大量样品、保存细胞以及允许通过流式细胞术进行延迟分析提供了优势。因此，对鱼类免疫机制以及不同环境或实验条件如何影响细胞活力产生有价值的见解可能非常有帮助。此外，该活力测定可以与特定免疫细胞群的多参数表型和功能表征相结合。这种方法能够对几个免疫学参数进行更全面的分析，将它们直接与相应的细胞类型联系起来，并提供更清晰的免疫反应信息。这些发现可能有助于制定更有效的策略，包括改进水产养殖中疾病管理的方法。

研究方案

该协议必须由获得动物实验认证的研究人员（欧盟功能 A 和 B）执行。与动物处理和样本采集相关的所有程序必须符合 ARRIVE 指南（动物研究： 体内 实验报告），并遵守根据欧洲实验动物科学协会联合会 （FELASA） 的建议照顾和使用动物的道德标准。本研究遵循所有这些标准以及葡萄牙实验动物科学立法（欧盟指令 2010/63;第 113/2013 号法令）。该研究获得了 IPMA 动物福利和伦理机构 （ORBEA， LABVIVOS-002-AquaClimAdapt） 的批准，该机构由国家活体动物使用管理局监督，即食品和兽医总局 （DGAV），伦理许可编号为 20596/25-S。

1. 研究模型和生物体的维护

注：本研究专为幼年金头鲷 （Sparus aurata） 设计，平均体重为 30.0 ± 5.0 g，总长度为 12.0 ± 2.0 cm。这种方法可能不直接适用于其他鱼类，因为不同的物种具有独特的生理和免疫学特征，可能会影响白细胞分离、细胞固定和活力评估。其他物种可能需要适应该方案，建议进行初步研究以优化每个目标物种的条件。

1. 让鱼适应（检疫期）
   1. 将鱼均匀分布在大容量的水箱中（例如，两个水箱，每个水箱的总容量为 660 升 - 见 补充图 1）。
      注意：要使用的水箱可能是循环水产养殖系统 （RAS） 的一部分，该系统可以有效地使用水并改善对水质的控制。在 RAS 中，水在系统内不断循环和处理，为鱼类提供稳定和受控的环境。这种设置有助于维持鱼类健康和生长的最佳条件，确保均匀分布并最大限度地减少研究期间的压力。
   2. 保持最佳的非生物条件。
      1. 在模拟其自然栖息地的条件下将鱼隔离 3 周：
         温度：20.0 ± 0.5 °C;
         溶解氧：7.2 ± 0.2 mg/L;
         盐度：35.0 ± 0.5 ‰;
         pH 值：8.0 ± 0.1 单位;
         光周期：光照 14 小时/黑暗 10 小时。
         注意：理想的维护条件可能因不同的鱼种而异。其他物种可能有不同的要求，因此根据目标物种的特定需求调整这些条件以确保生物体的健康和福利非常重要。此外，海水温度和光周期会随季节变化，因此在实验室中复制自然条件时应考虑季节性变化。
2. 启动实验研究。
   1. 根据每个案例研究的实验设置设计定义所需的水箱和鱼的数量。
   2. 检疫期过后，将鱼转移到独立的 RAS 中（见 补充图 2）。
      1. 为每个系统配备蛋白质分离器，以去除水中过量的有机化合物;物理过滤（滤袋 [400 μm]、过滤海绵和玻璃棉）;生物过滤（生物球 [1.5“]、紫外线水消毒器和浸没式空气石）;自动海水制冷系统和浸没式数字加热器，两者都连接到带有温度传感器的计算机控制系统 （ProfiLux） 以调节每个水箱中的温度;每个水箱中浸没空气石以控制溶解氧。
   3. 在进行实验之前，将鱼在新系统中适应 2 周。
   4. 执行日常维护
      1. 从每个孵化池中清除鱼粪，并进行 25% 的海水更新。
      2. 使用便携式精密温度计测量温度。
      3. 使用多参数测量仪器监测其他海水非生物参数（盐度、溶解氧和 pH 值）。
      4. 根据需要调整海水非生物参数，以确保整个实验的稳定性。
         注：实验系统中的非生物条件可以根据每个案例研究的具体要求而变化。例如，如果该研究旨在模拟季节性变化或海洋热浪，则应相应地调整温度和光周期以模拟自然季节性变化。同样，如果研究的重点是模拟缺氧条件或海洋酸化，则应调整海水的氧气水平和 pH 值。这确保了实验条件尽可能真实和相关，从而提高了研究结果的有效性和适用性。
      5. 评估鱼的健康状况，识别和管理压力或疾病的迹象，如步骤 1.2.4.6-1.2.4.8 所述。
      6. 寻找异常行为，例如游泳不稳定、食欲不振、嗜睡、攻击性或孤立。
      7. 检查是否有疾病体征，包括病变、溃疡、变色、鳍夹住、粘液过多或鳃快速移动。
      8. 记录所有观察结果，记下日期和采取的行动。
   5. 每周进行水质测试。
      1. 使用比色法测量氨 （NH₃/NH₄）、亚硝酸盐 （NO₂^-） 和硝酸盐 （NO₃^-） 水平。
         注意：确保所有这些参数都低于可检测水平。如果水位超过限值，请进行额外的换水、增加曝气或调整过滤。
   6. 喂养和监测鱼类营养。
      1. 提供满足幼鱼特定营养需求的优质饮食（有关饮食详细成分的示例，请参见 补充表 1 ）。
         注意：确保水产饲料颗粒的大小 （2-3 mm） 适合幼鱼，便于摄入和消化。
      2. 调整饲料量，使其对应于鱼每天平均体重的 2%。
      3. 每天手动喂鱼两次 - 早上一次，下午一次（设定特定时间以保持稳定的喂食程序）。

2. 鱼类取样、安乐死、解剖和头肾采集

1. 从水箱中品尝鱼。
   1. 从鱼缸中随机选择鱼，以避免采样偏差。
   2. 用网轻轻地将鱼转移到装满水箱水的临时容器中。
      注意： 尽量减少处理时间以减轻压力。
2. 准备安乐死溶液。
   1. 使用适合盛放鱼的适当容器（例如 3 升桶）。
   2. 将适量的三卡因 （MS-222） 溶解在海水中，以达到 200-300 mg/L^{的最终浓度 18}（注意：参见补充表 2 和补充文件 1）。
   3. 用碳酸氢钠将溶液缓冲至 pH 值 7.2-7.5。
3. 管理安乐死解决方案。
   1. 将鱼放入安乐死溶液中至少 10 分钟或直到观察到鳃盖运动停止和反射丧失（通过检查对外部刺激没有反应来确认安乐死）。
   2. 记录鱼的体重 （g） 和总长度 （cm）。
4. 进行鱼类解剖。
   注意：为确保最佳样品质量和细胞活力，应尽快完成解剖过程，最好在安乐死后 5 分钟内完成。
   1. 使用空调确保实验室温度保持在 19 °C，以尽量减少采样和处理过程中的波动。
   2. 对解剖工具进行消毒（最好尽可能使用高压灭菌金属器械）并用 70% 乙醇建立一个干净的工作空间（注意，参见 补充表 2）。
   3. 将安乐死的鱼侧放放在无菌解剖盘上，头部指向非惯用手。
   4. 使用手术刀，沿着鱼的腹侧中线从通风口（肛门）向鳃小心切开。
      注意：小心不要切得太深，以免损坏内脏。
   5. 小心地使用解剖剪刀延长切口并露出内部器官。轻轻提起体壁皮瓣，以便清楚地看到内部解剖结构。
   6. 找到头肾：头肾位于鳃的正后方，靠近体腔的前背区，并沿着体腔的顶部延伸，在脊柱下方。
      注意：与周围组织相比，头肾的颜色通常较深（图 1）。
   7. 小心清除任何周围的组织，例如脂肪和结缔组织，以更好地观察头肾。
      注意：此步骤需要小心处理，以免损坏头肾。
   8. 使用细尖镊子和剪刀，小心地提起头肾并在其周围进行精确切割，使其从周围组织中分离出来。
      注意：请轻柔处理纸巾，以防止损坏。在一条重约 30 克的鱼中，头肾预计重约 20-30 毫克。
   9. 立即将切除的器官放入无菌培养皿内的细胞过滤器（100 μm 尼龙网）中，以确保无菌并促进后续处理步骤。
      注：从此时起，应尽快（在 5 分钟内）执行所有步骤，以保持细胞活力。为了保持样品冷却，将培养皿放在装满冰块并覆盖有铝箔的容器上，执行以下步骤。

图 1：头肾的位置： （A） 描绘头肾在鳃后面和体腔前背侧区域的典型位置的插图;（B） 鲷鱼头肾的代表性图像，强调与周围组织相比，其颜色较深。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 分离头部肾白细胞（图 2）

图 2： 从头肾分离白细胞的说明性描述。该方案涉及几个步骤：从组织匀浆开始，然后是密度梯度离心，收集白细胞环，洗涤白细胞环，最后以重悬和调整细胞浓度结束。 请单击此处查看此图的较大版本。

1. 匀浆组织。
   1. 将 2 mL Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） 放入无菌培养皿中。
   2. 确保细胞过滤器的网（100 μm 尼龙网）与 HBSS 接触，但未完全浸没。
   3. 使用注射器的柱塞在细胞过滤器上浸渍头肾。轻轻按压，迫使器官碎片穿过尼龙网，形成细胞悬液。
      注：如果处理多个样品，则含有细胞悬液的培养皿可以在 4 °C 的冰箱中储存几分钟，直到下一步。该细胞悬液将用于白细胞分离。
2. 进行密度梯度离心。
   1. 制备密度梯度培养基溶液，密度为 1.077 g/mL，渗透压为 353 mOsm/kg，pH 值为 7.4（参见 补充文件 1）。
      注：不同鱼类的渗透压可能有所不同，因此调整密度梯度介质溶液的渗透压以满足每个物种的特定要求至关重要。
   2. 在 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，小心加入 600 μL 密度梯度培养基溶液。
   3. 取细胞悬液 （2 mL） 并将其缓慢加入含有密度梯度培养基的试管中。第一滴至关重要 - 添加得非常轻柔，以避免破坏密度梯度介质相的稳定性。
      注意：这应该以 3：10 的比例进行（密度梯度培养基：细胞悬液）。使用无菌 1 mL 巴斯德移液器进行精确和温和的添加。确保移液器的尖端接触试管的侧面，以防止干扰密度梯度介质层。避免将样品与密度梯度介质混合。
   4. 将试管在 4 °C 下以 400 x g 离心 45 分钟，同时关闭制动器。这确保了各层在此过程中保持完整。
      注：离心后，应可以看到不同的层。白细胞将在密度梯度培养基和细胞碎片沉淀之间的界面处形成一个环（图 3）。

图 3： 白细胞在密度梯度培养基和细胞碎片沉淀之间的界面处环状。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 收集白细胞环。
   1. 使用无菌巴斯德移液器，轻轻吸出白细胞环 （~100 μL） 并将其转移到 2 mL 微量离心管中。
      注意： 注意不要明显干扰各层，以避免污染。如果白细胞环似乎包含碎片或深色悬浮液，建议将收集的白细胞悬浮液通过新的微型细胞过滤器 （100 μm） 以确保纯度。将微型细胞过滤器放在 2 mL 微量离心管上，然后轻轻地将白细胞悬液通过过滤器转移。
4. 清洗白细胞环。
   1. 将 HBSS 添加到含有白细胞环的微量离心管中，直至体积达到 2 mL，然后轻轻重悬细胞。
      注：将试管放在装满冰块的容器中，并用铝箔覆盖，以保持样品处于低温。确保管子不与冰直接接触。在整个洗涤过程中保持这种冷却设置。
   2. 将样品在 4 °C 下以 400 × g 离心 10 分钟（可以打开制动器）。
   3. 离心后，小心丢弃上清液，将沉淀留在底部（可能几乎看不见）。
   4. 重复洗涤步骤（添加 HBSS、重悬、离心和丢弃上清液），直到沉淀无杂质。
5. 重悬并调整细胞浓度。
   1. 将细胞重悬于用于洗涤的相同 2 mL 微量离心管内的 1 mL HBSS 中。
   2. 使细胞浓度介于 1 × 10 ×⁴ 和 1 10⁶ 个细胞/mL 之间。如果初始沉淀较大，则可能需要额外的 HBSS 以将细胞浓度稀释到所需范围。将细胞悬液转移至 15 mL 试管中，并根据获得的细胞计数根据需要添加更多 HBSS。
      注：建议使用自动细胞计数仪以促进该过程。

4. 白细胞的染色和固定（图 4）

注：LIVE/DEAD 可固定死细胞染色试剂盒提供了一种使用流式细胞术评估固定细胞活力的改进方法。这些检测利用与细胞胺相互作用的荧光反应性染料。如果细胞膜受损，染料可以穿透细胞，与细胞内部和细胞表面的游离胺发生反应，导致强烈的荧光染色。相反，在活细胞中，只有细胞表面的胺可以与染料反应，导致染色相对较暗。用甲醛固定后，染色强度得以保持，甲醛还可以通过防止微生物生长来保护样品。LIVE/DEAD 可固定死细胞染色试剂盒除荧光染料外完全相同 - 有蓝色、紫色、浅绿色、黄色、绿色、红色、远红或近红外（红外）可供选择。在这项研究中，我们使用了 Near-IR 荧光反应性染料。此外，这种单色检测允许在多色实验中并行测试其他参数。

1. 准备染料。
   1. 将试剂置于室温 （RT）：在取下瓶盖之前，让一小瓶荧光反应性染料和一小瓶无水二甲基亚砜 （DMSO） 达到 RT。
   2. 重构染料：向含有活性染料的小瓶中加入 50 μL DMSO。充分混合并确保染料已完全溶解。
   3. 尽快使用复溶的染料溶液，最好在几个小时内使用。
      注：每个试剂盒包括 5 个单独的反应性染料小瓶，提供足够的材料来对至少 40 个细胞样品进行染色。然而，重构后，染料的 DMSO 溶液相对不稳定，尤其是在暴露于湿气时。任何未使用的部分可以在 ≤-20 °C 下储存长达 2 周，避光和防潮。
2. 染色并固定细胞。
   注：适用于细胞染色的缓冲液包括 Hanks 平衡盐溶液 （HBSS）、磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 Dulbecco PBS （D-PBS），只要它们不含外来蛋白质，如牛血清白蛋白或血清。使用氨基反应性染料时，避免使用含有叠氮化钠或外来蛋白的 Tris 缓冲液和溶液进行细胞重悬和洗涤。在这项研究中，我们使用 HBSS，因为它的离子组成平衡，有助于维持渗透平衡，并提供必需的离子和葡萄糖，以支持染色过程中的细胞代谢和活力。HBSS 也不含外来蛋白质，可防止干扰活性染料并确保准确的活力评估。
   1. 对细胞进行计数并用 HBSS 将密度调节至 1 x 10⁶ 个细胞/mL 后，将 1 mL 该细胞悬液转移到 2 mL 微量离心管中。
      1. 每天，在至少一个样品中诱导细胞死亡，用作对照，以设置活细胞和死细胞之间的荧光强度阈值。按如下方式在微量离心管中制备样品：
         试管 1：活细胞 - 未染色
         试管 2：活细胞 - 染色
         管 3：死细胞 - 未染色
         试管 4：死细胞 - 染色
         注意：这四个试管只需要为每个实验中的单个样品作为对照准备。对于其余样品，只需要两管（试管 1：样品 - 未染色和试管 2：样品 - 染色），因为它将提供有关活细胞和死细胞的信息。
   2. 细胞死亡阳性对照：将标记的未染色 Dead （Tube 3） 和 Dead-stained （Tube 4） 试管置于 50 °C 的水浴中 7 分钟，以通过热处理诱导细胞死亡。
   3. 细胞染色：将 1 μL 重构的荧光反应性染料（来自步骤 4.1.2）加入到管 2 和 4（将要染色的管）中的 1 mL 细胞悬液中并充分混合。
   4. 在 RT 下避光孵育 30 分钟。
      注意：如果不需要固定，则可以跳过下面的步骤 4.2.5-4.2.7。相反，用 1 mL 含 1% 牛血清白蛋白的 HBSS 洗涤细胞两次（参见 补充文件 1），并在 1 mL 含 1% 牛血清白蛋白的 HBSS 中重悬。尽快在流式细胞仪上进行分析;否则，由于细胞未固定，细胞活力可能会受到影响。
   5. 用 1 mL HBSS 洗涤细胞两次，并将细胞重悬于 900 μL HBSS 中。
   6. 加入 100 μL 37% 甲醛（注意，参见 补充表 2）。
   7. 在 RT 孵育 15 分钟。
   8. 用 1 mL 含 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 HBSS 洗涤两次，然后将细胞重悬于 1 mL 含 1% BSA 的 HBSS 中。
   9. 将样品储存在 4 °C 的冰箱中。 固定后 1 个月内分析细胞。
   10. 使用适当的激发和检测通道通过流式细胞术分析固定的细胞悬液。
       注：正确的激发和检测通道可能因所使用的仪器而异（参见 补充表 3）。

图 4： 白细胞染色和固定的说明性描述。 请单击此处查看此图的较大版本。

5. 流式细胞术

1. 获取数据。
   注：流式细胞仪上要遵循的程序可能因所使用的特定流式细胞仪而异。在本研究中，使用 Attune NTx 流式细胞仪采集数据。
   1. 运行示例。
   2. 将样品管放入样品端口。
   3. 按 start 开始采集，然后在事件速率（事件/秒）稳定后单击 Record 。
   4. 在 singlelets 门中为每个样品记录至少 10,000 个事件，以进行可靠的分析。
   5. 保存每个样品的所有数据，并将其备份到外部驱动器或云存储中。
2. 分析数据。
   注：对于流式细胞术分析，有多种软件选项可供选择。在本研究中，使用 FlowJo v10.8.1¹⁹ 进行数据分析。
   1. 加载数据文件：启动流式细胞术分析软件并上传从实验中获取的 .fcs 文件。
   2. 可视化数据（图 5A）：绘制前向散射 （FSC-A） （XX） 与侧向散射 （SSC-A） （YY） 以评估细胞大小和粒度。
      注：此图通常用于识别细胞群并根据其散射特性排除碎片。
   3. 单重态细胞门控和多重体排除（图 5B）：使用前向散射面积 （FSC-A） 与前向散射高度 （FSC-H） 图来排除多重体。绘制一个门以包括图中对齐的所有事件（单个单元格）并排除未对齐的事件（多重）。如果样品具有 FSC 非常低的事件，则通过不将它们包含在单个细胞的门上来排除这些事件，只保留单细胞。
   4. 识别白细胞群（图 5C）：根据 FSC-A/SSC-A 概况区分 3 个白细胞群：FSC-A^高/SSC-A^高 是粒细胞，FSC-A^培养基/SSC-A^培养基 是单核细胞，FSC-A^低/SSC-A^低 是淋巴细胞。
   5. 活力门控（图 5D）：在相应的荧光通道（NIR，RL3-A）上设置活力染料染色的阈值。根据 LIVE/DEAD 可固定死细胞染色剂的染色强度定义活细胞与死细胞：暗淡染色的细胞定义为活细胞，强染色细胞定义为死细胞。
   6. 种群统计：查看软件提供的统计数据，包括每个门中的事件总数（细胞）以及总细胞和门控细胞的百分比。
   7. 导出数据：将数据导出到电子表格，并使用适当的统计软件（GraphPad Prism 或 R）进行进一步的统计分析。
      注意：分析方法的选择将取决于研究的目标。

图 5：用于头肾细胞活力评估的流式细胞术门控策略： （A） 表示所有收集事件的 FSC-A/SSC-A 概况。（B） 表示基于前向散射 （FSC-A）/前向散射 （FSC-H） 图上线性的单峰区域定义的多重态排除。（C） 表示在排除多重后基于 FSC-A/SSC-A 定义的 3 个主要群体。（D） 表示显示 Live/Dead Viability 染料染色的直方图。为了设置允许区分活细胞和死细胞的阈值，将白细胞置于轻度热休克 （50 °C， 7 min） 中，然后用活力染料染色。高染色强度阳性细胞 （++） 是死细胞，低染色阳性细胞 （+-） 是活细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。

结果

图 6 显示了代表性流式细胞术数据，显示了使用本研究中描述的方案从幼鱼金头鲷 （Sparus aurata） 的头肾中分离的白细胞群及其细胞活力。该图比较了两个样品：一个具有高细胞活力，其中鱼暴露于最佳条件下（图 6A），另一个细胞活力低，细胞暴露于热应激（图 6B）。

讨论

本研究开发的方法代表了鱼类免疫学研究的重大进步，有望提高对鱼类免疫反应和海洋资源可持续性的理解。 S. aurata 是 Sparidae 科的一种有价值的海洋鱼类，由于多种原因，包括其生态和经济相关性，以及它在生理学、免疫学、毒理学和水产养殖等多个研究领域的实验室研究中的广泛性²⁰。 金链球菌 的主要优点之一是易于在实验室中处理?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air Stones	N/A	N/A
Aquafeed	SPAROS, Lda., Portugal	N/A	High-quality diet
Automatic Cell Counting Equipment	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE automatic cell counter (NanoEnteK)
Automatic Water Refrigeration Systems	Foshan Weinuo Refrigeration Equipment Co., Ltd, China	N/A
Bio balls 1.5" Aquarium Pond Filter	TMC Iberia, Portugal	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Germany	A7906
Bucket (3 L)	N/A	N/A	To prepare and carry out euthanasia
Buckets (5 L)	N/A	N/A	To transport the animals
Cell Strainers	Jetbiofil, China	CSS-013-100	Cell Strainer, 100 μm nylon mesh, Sterile, Yellow
Centrifugue	Fisher Scientific, Germany	N/A	accuSpin Micro 17 R
Colorimetric Test Kit for Ammonia (NH4+/NH3)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrate (NO3-)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrite (NO2-)	Tropic Marin, USA	N/A
Computer	N/A	N/A	To acquire and analyse the data obtained from the flow cytometer
Computerized Control System (Profilux)	GHL, Germany	N/A	ProfiLux 3 Outdoor
Deionized water	N/A	N/A	To clean the Flow Cytometer
Density Gradient Medium: Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany	17-0891-01
Digital scale	KERN & Sohn GmbH, Germany	N/A	KERN EMS 300-3
Ethanol 70%	Millipore, Supelco, Portugal	EX0281	To keep the workspace clean
EVE Cell Counting Slides	NanoEnteK, Korea	N/A
Falcon Tubes (15 mL)	pluriSelect Life Science, Germany	05-00002-01	Sterile
Filter bag	TMC Iberia, Portugal	N/A	400 micron
Filter Sponge	N/A	N/A
Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune flow cytometer
FlowJo v10.8.1 Software	BD Life Sciences	N/A
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich, Germany	8.18708
Glass Wool	N/A	N/A
Hanks' Balanced Salt Solution	Merck Life Science S.L, Portugal	H6648	Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits	Life Technologies Europe, Netherlands	L10119	Near-IR fluorescent reactive dye + DMSO
Main Water Pumps	EHEIM, Germany		Universal 1200
Microcentrifuge Tubes (2 mL)	BRAND, Merck, Germany	Z628034	Sterile
Micropipette Tips	Sartorius, Germany	790010, 790200, 791000	Compatible with Sartorius, 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Micropipettes	Sartorius, Germany	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Mini Cell Strainers	pluriSelect Life Science Global Headoffice, Germany	43-10100-50	PluriStrainer 100 µm nylon mesh, Sterile
Multi-Parameter Measuring Instrument	WTW, Germany		Multi 3420 SET G + IDS digital conductivity cell (TetraCon 925) + Optical IDS DO sensor (FDO 925) + IDS pH-electrode (SenTix 940)
Pasteur Pipettes (1 mL, 5 mL)	Humeau Expert du laboratoire, France	248295	Sterile
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1194.500	60 x 15 mm, Polystyrene, Sterile
pH Meter	Hanna Instruments Inc., Romania		HANNA HI2211
Polystyrene round-bottom Falcon tubes (5 mL)	Fisher Scientific, Germany	14-959-2A	Sterile
Portable Precision Thermometer	Ebro Electronic, Germany	N/A	TFX 430
Protein Skimmers	Mantis	N/A	Tornado 120
Quality control beads/Performance test beads	Thermofisher Scientific, USA	N/A
Quarantine Tanks	N/A	N/A	Tanks with 660 L total volume
Rectangular Glass Tanks/Aquariums	N/A	N/A	Tanks with 200 L total volume
Refrigerator	N/A	N/A	To store the samples at 4 °C
Ruler 30 cm	N/A	N/A	To measure the fish's length
Sodium bicarbonate	Honeywell Fluka, Germany	31437	Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sterile Dissection Tools	N/A	N/A	(e.g. scalpel, scissors, fine-tipped forceps, dissecting tray/board)
Submerged Digital Heaters	TMC Iberia, Portugal		300 W, V2Therm Digital Heaters
Syringes 1 mL	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	Sterile, HSW Soft-Ject Syringes to macerate head-kidney
Temperature Sensors	GHL, Germany		PT 1000
Tricaine (MS-222)	ThermoFisher Scientific, Germany	118000500	Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt, 98% (C10H15NO5S)
Ultraviolet Water Sterilizer	EHEIM, Germany	5305010	ClearUVC-36
Water Bath	Fisher Scientific, Germany	N/A	Fisherbrand IsotempTM (P/N U01318)
Water-resistant Luminaires	N/A	N/A