Isolamento, fissazione e caratterizzazione di leucociti renali giovanili di orata mediante citometria a flusso

Riepilogo

Questo manoscritto descrive l'isolamento e la fissazione di leucociti estratti dalla testa-rene dell'orata e la valutazione della loro vitalità mediante citometria a flusso. Questo lavoro contribuisce alla standardizzazione dei protocolli e sfrutta l'elaborazione di un numero maggiore di campioni senza compromettere la qualità dei campioni, promuovendo i progressi nelle conoscenze sull'immunologia dei pesci.

Abstract

L'immunità è fondamentale per la regolazione fisiologica degli organismi, fungendo da difesa primaria contro gli agenti patogeni e i fattori di stress ambientale. L'isolamento e l'analisi delle cellule immunitarie forniscono informazioni chiave sulle risposte immunitarie alle pressioni esterne. Tuttavia, la mancanza di protocolli armonizzati per le specie meno studiate, come i pesci marini, porta spesso a sfide tecniche e analitiche che ostacolano l'interpretazione dei dati e una comprensione approfondita delle risposte immunitarie specie-specifiche. Questo studio mirava a mettere a punto una procedura analitica ottimizzata basata sulla citometria a flusso per caratterizzare e determinare la vitalità dei leucociti dal rene della testa (il principale organo ematopoietico nei pesci teleostei) del novellame di orata (Sparus aurata). La procedura è iniziata con l'isolamento dei leucociti attraverso un processo di omogeneizzazione utilizzando la soluzione salina bilanciata di Hanks, seguita da un metodo di centrifugazione a gradiente di densità Percoll ottimizzato per garantire alti tassi di recupero dei leucociti con una contaminazione eritrocitaria minima necessaria per un'efficiente successiva analisi di citometria a flusso. Inoltre, è stata impiegata una nuova tecnica che utilizza un colorante reattivo alle cellule (LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit) per distinguere le cellule vitali da quelle morte in base ai loro modelli di colorazione fluorescente. La fissazione è stata ottenuta con il 3,7% di formaldeide, preservando la morfologia cellulare, la vitalità e l'efficienza di colorazione. L'analisi della citometria a flusso ha identificato con successo tre popolazioni di leucociti predominanti: linfociti, monociti e granulociti. Questo metodo non solo ha permesso test di vitalità, ma anche l'accurata differenziazione dei tipi di cellule. Il miglioramento dei protocolli di citometria a flusso rappresenta un passo avanti nell'immunologia dei pesci aumentando l'accuratezza e l'efficienza dell'analisi delle cellule immunitarie. Inoltre, consentendo la fissazione delle cellule per analisi successive, questo protocollo riduce significativamente il tempo e lo sforzo necessari per le valutazioni immunitarie, rendendolo uno strumento prezioso sia per la ricerca che per le applicazioni pratiche in vari campi di ricerca.

Introduzione

L'immunità svolge un ruolo centrale nella regolazione fisiologica degli organismi, agendo come difesa primaria contro un'ampia gamma di agenti patogeni e fattori di stress ambientale¹. Come altri vertebrati, i pesci hanno un sistema immunitario complesso, dinamico e coordinato, essenziale per la loro salute^{e il loro} benessere generale.

I pesci teleostei possiedono un sistema immunitario sia innato che adattativo, che funziona contemporaneamente per rilevare, rispondere e neutralizzare gli invasori dannosi². Il sistema immunitario innato agisce come prima linea di difesa, fornendo risposte immediate e non specifiche ai patogeni², mentre il sistema immunitario adattativo si sviluppa nel tempo, offrendo una risposta più specializzata che consente ai pesci di riconoscere patogeni specifici e stabilire la memoria immunologica³. Il sistema immunitario dei pesci si basa su organi linfoidi primari specializzati (ad esempio, timo e rene della testa) e organi linfoidi secondari (ad esempio, milza e tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT)) per supportare la difesa immunitaria e mantenere la salute generale⁴. Il rene della testa è l'organo ematopoietico primario nei pesci teleostei e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo e nella maturazione delle cellule immunitarie, compresi i leucociti⁵.

Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi significativi nello studio delle risposte immunitarie di diverse specie ittiche². Un'area chiave di interesse è stata la comprensione delle popolazioni di leucociti e della loro attività. I leucociti, noti anche come globuli bianchi, sono generalmente classificati in monociti, linfociti e granulociti e svolgono un ruolo cruciale nella difesa immunitaria dei pesci. Hanno cellule fagocitarie, che sono responsabili dell'inghiottimento e della distruzione degli agenti patogeni e rilasciano specie battericide reattive dell'ossigeno, contribuendo all'eliminazione dei microrganismi invasori⁶. I leucociti sono anche coinvolti nel processo infiammatorio, aiutando a isolare e sradicare le infezioni e promuovendo la riparazione dei tessuti⁶. L'abbondanza e l'attività delle popolazioni leucocitarie sono indicatori importanti dello stato immunitario nella salute e nella malattia degli animali ^7,8.

Alcuni studi hanno dimostrato che i fattori di stress, come le condizioni ambientali avverse, possono alterare il numero e la morfologia degli eritrociti e la composizione dei leucociti circolanti ^9,10. Ad esempio, come esaminato da Franke et al. (2024), è fondamentale studiare il sistema immunitario dei pesci negli scenari di cambiamento climatico, poiché i fattori di stress ambientale possono compromettere l'immunità dei pesci, aumentare la suscettibilità alle malattie e migliorare l'infettività di alcuni agenti patogeni, accelerando in ultima analisi la progressione della malattia¹¹. Inoltre, comprendere l'immunità dei pesci è essenziale non solo per far progredire la ricerca biologica fondamentale, ma anche per sostenere vari settori della società, come l'industria dell'acquacoltura. Con la continua espansione dell'acquacoltura a livello globale, garantire la salute e il benessere delle specie ittiche d'allevamento sta diventando sempre più importante. Tuttavia, il benessere dei pesci rimane un'area di ricerca relativamente nuova e le risposte immunitarie dei pesci d'allevamento richiedono ancora valutazioni approfondite e standardizzate. Dare priorità agli studi sulla risposta immunitaria è della massima importanza, poiché le informazioni acquisite possono migliorare la sostenibilità e la produttività dell'acquacoltura attraverso approcci efficaci e su misura che migliorano il benessere e la resilienza degli animali allevati.

La quantificazione e l'identificazione dei leucociti vengono solitamente eseguite utilizzando metodi ematologici, come il conteggio manuale con emocitometri Bürker, Neubauer o Thoma, nonché strisci di sangue colorati ^7,10. Per aiutare nella visualizzazione e nella differenziazione delle cellule del sangue, vengono^{spesso utilizzati kit} di colorazione, come Wright, May-Grünwald-Giemsa e Hemacolor. Tuttavia, queste tecniche di conteggio manuale delle cellule sono noiose, dispendiose in termini di tempo e soggette a errori umani ^8,10. Le fonti di errore più comuni includono una miscelazione o una diluizione inadeguata del sangue, problemi di colorazione e un caricamento errato della camera dell'emocitometro, che possono portare a una conta cellulare imprecisa¹². Inoltre, l'analisi ematologica manuale richiede un alto livello di competenza ed esperienza per garantire l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati⁷. Con l'aumento della domanda di strumenti diagnostici precisi ed efficienti, lo sviluppo di metodi innovativi che forniscano una comprensione approfondita dello stato immunitario delle popolazioni ittiche diventa un passo sempre più importante per far progredire questo campo.

La citometria a flusso è emersa come uno strumento potente in questo contesto, offrendo un approccio quantitativo ad alto rendimento per analizzare le popolazioni di leucociti e la vitalità cellulare⁸. Questa moderna tecnologia diagnostica consente di rilevare, contare e caratterizzare rapidamente le singole cellule in popolazioni miste con notevole precisione¹³. Inoltre, la citometria a flusso consente misure multiparametriche simultanee sia per la caratterizzazione fenotipica che funzionale. Sebbene ampiamente utilizzato in contesti clinici umani e in medicina veterinaria, la sua applicazione nello studio dei leucociti dei pesci rimane molto limitata⁸. Sebbene siano state condotte alcune ricerche su diverse specie ittiche 1,6,8,13,14,15,16,17, devono ancora essere affrontate diverse sfide critiche. Una delle principali sfide in queste analisi è la necessità di ottenere sospensioni di leucociti vivi estratti dal sangue periferico o da tessuti linfoidi, come il rene della testa¹. L'isolamento dei leucociti è spesso difficile a causa di una caratteristica unica dei pesci teleostei: la presenza di eritrociti nucleati. La contaminazione involontaria con eritrociti può interferire con l'analisi dei leucociti a causa delle loro dimensioni, della forma ovoidale e della presenza di un nucleo¹. È quindi imperativo eliminare gli eritrociti dalle sospensioni leucocitarie per ottenere un'elevata purezza leucocitaria e studiare le caratteristiche fenotipiche e funzionali dei leucociti mediante analisi di citometria a flusso. Nei mammiferi, l'isolamento dei leucociti comporta tipicamente la lisi osmotica degli eritrociti o la separazione in gradiente di densità con Ficoll o Percoll¹. Tuttavia, la lisi osmotica è inefficace sia per i pesci marini che per quelli d'acqua dolce a causa dei loro eritrociti nucleati, che non possono essere^{lisati correttamente}. Invece, la separazione in gradiente di densità è preferita per i pesci in quanto preserva efficacemente la stabilità cellulare nel tempo¹. Sebbene alcuni studi abbiano isolato con successo i leucociti dai pesci giovani, molte ricerche si concentrano ancora principalmente sulle popolazioni adulte¹⁷. Tuttavia, le prime fasi della vita non sono solo più vulnerabili alle epidemie, ma anche di dimensioni ridotte, rendendo il processo di campionamento più complesso e impegnativo. Un'altra limitazione è che i metodi attuali sono spesso limitati a un numero limitato di campioni o repliche alla volta, poiché la valutazione della vitalità dei leucociti richiede un'elaborazione immediata. I ritardi nell'elaborazione dei campioni possono influire negativamente sulla vitalità cellulare, introducendo così ulteriori complicazioni nel processo di campionamento e potenzialmente mettendo a rischio l'intero lavoro.

Per quanto ne sappiamo, nessuno dei metodi pubblicati ha fissato con successo le cellule leucocitarie per la successiva analisi della vitalità mediante citometria a flusso. Il presente studio è pionieristico, in quanto stabilisce un metodo efficiente per isolare i leucociti dal rene della testa del giovane orata (Sparus aurata), la principale specie ittica allevata nei paesi dell'Europa meridionale, utilizzando una metodologia di separazione in gradiente di densità Percoll. Presentiamo anche una tecnica migliorata basata sulla colorazione che discrimina le cellule vive da quelle morte identificando le principali popolazioni di leucociti (linfociti, monociti e granulociti) attraverso la citometria a flusso. Il protocollo migliorato prevede la fissazione cellulare, che consente un'analisi cellulare vitale fino a 1 mese dopo la procedura. L'implementazione di questo protocollo di citometria a flusso ha il potenziale per ridurre significativamente il tempo e lo sforzo tipicamente necessari per le valutazioni immunitarie, rendendola una tecnica preziosa sia per la ricerca che per applicazioni più pratiche nel settore dell'acquacoltura. L'applicazione di questa metodologia offre vantaggi per l'analisi di un gran numero di campioni, la conservazione delle cellule e la possibilità di ritardare l'analisi mediante citometria a flusso. Pertanto, potrebbe essere molto utile produrre preziose informazioni sui meccanismi immunitari dei pesci e su come la vitalità cellulare sia influenzata da diverse condizioni ambientali o sperimentali. Inoltre, questo test di vitalità può essere integrato con la caratterizzazione fenotipica e funzionale multiparametrica di specifiche popolazioni di cellule immunitarie. Questo approccio consente un'analisi più completa di diversi parametri immunologici, collegandoli direttamente ai tipi di cellule corrispondenti e fornendo una comprensione più chiara delle risposte immunitarie. Questi risultati potrebbero contribuire allo sviluppo di strategie più efficaci, compresi approcci migliori per la gestione delle malattie in acquacoltura.

Protocollo

Questo protocollo deve essere eseguito da ricercatori certificati in sperimentazione animale (funzioni UE A e B). Tutte le procedure relative alla manipolazione degli animali e alla raccolta dei campioni devono essere conformi alle linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) e aderire a standard etici per la cura e l'uso degli animali in conformità con le raccomandazioni della Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Il presente studio ha seguito tutti questi standard, nonché la legislazione portoghese per la scienza degli animali da laboratorio (Direttiva UE 2010/63; D.L. n. 113/2013). La ricerca è stata approvata dall'Ente per il benessere e l'etica degli animali dell'IPMA (ORBEA, LABVIVOS-002-AquaClimAdapt), supervisionato dall'Autorità nazionale per l'uso di animali vivi, nota come Direzione generale per l'alimentazione e la veterinaria (DGAV), con il numero di autorizzazione etica 20596/25-S.

1. Studio del modello e mantenimento degli organismi

NOTA: Questo studio è stato specificamente progettato per il novellame di orata (Sparus aurata), con un peso medio di 30,0 ± 5,0 g e una lunghezza totale di 12,0 ± 2,0 cm. Questo metodo potrebbe non essere direttamente applicabile ad altre specie ittiche, poiché specie diverse hanno caratteristiche fisiologiche e immunologiche uniche che possono influenzare l'isolamento dei leucociti, la fissazione cellulare e la valutazione della vitalità. Potrebbero essere necessari adattamenti al protocollo per altre specie e si raccomandano studi preliminari per ottimizzare le condizioni per ciascuna specie bersaglio.

1. Acclimatare i pesci (Periodo di Quarantena)
   1. Distribuire i pesci in modo uniforme in vasche di grande capacità (ad esempio, due vasche con una capacità totale di 660 L ciascuna - vedere la Figura 1 supplementare).
      NOTA: Le vasche da utilizzare possono far parte di un sistema di acquacoltura a ricircolo (RAS), che consente un uso efficiente dell'acqua e un migliore controllo sulla qualità dell'acqua. In un RAS, l'acqua viene continuamente riciclata e trattata all'interno del sistema, fornendo un ambiente stabile e controllato per i pesci. Questa configurazione aiuta a mantenere le condizioni ottimali per la salute e la crescita dei pesci, garantendo una distribuzione uniforme e riducendo al minimo lo stress durante lo studio.
   2. Mantenere condizioni abiotiche ottimali.
      1. Tenere i pesci in quarantena per 3 settimane in condizioni che imitano il loro habitat naturale:
         temperatura: 20,0 ± 0,5 °C;
         ossigeno disciolto: 7,2 ± 0,2 mg/L;
         salinità: 35,0 ± 0,5 ‰;
         pH: 8,0 ± 0,1 unità;
         Fotoperiodo: 14 ore di luce/10 ore di buio.
         NOTA: Le condizioni ideali di manutenzione possono variare tra le diverse specie ittiche. Altre specie possono avere esigenze diverse, quindi è importante adattare queste condizioni alle esigenze specifiche delle specie bersaglio per garantire la salute e il benessere degli organismi. Inoltre, la temperatura dell'acqua di mare e il fotoperiodo possono cambiare con le stagioni, quindi le variazioni stagionali dovrebbero essere prese in considerazione quando si replicano le condizioni naturali in laboratorio.
2. Avviare lo studio sperimentale.
   1. Definisci il numero di vasche e pesci necessari in base al progetto di configurazione sperimentale di ciascun caso di studio.
   2. Dopo il periodo di quarantena, trasferire il pesce in RAS indipendente (cfr. figura supplementare 2).
      1. Dotare ogni sistema di schiumatoi di proteine per rimuovere i composti organici in eccesso dall'acqua; filtrazione fisica (sacco filtrante [400 μm], spugna filtrante e lana di vetro); filtrazione biologica (bio ball [1,5"], sterilizzatore d'acqua a raggi ultravioletti e pietre porose sommerse); sistemi automatici di refrigerazione dell'acqua di mare e riscaldatori digitali sommersi, entrambi collegati ad un sistema di controllo computerizzato (ProfiLux) con sensori di temperatura per regolare la temperatura in ogni vasca; pietre porose sommerse in ogni serbatoio per controllare l'ossigeno disciolto.
   3. Acclimatare i pesci per 2 settimane nei nuovi sistemi prima di procedere con l'esperimento.
   4. Eseguire la manutenzione quotidiana
      1. Rimuovere le feci di pesce da ogni vasca di incubazione ed eseguire un rinnovo dell'acqua di mare del 25%.
      2. Misura la temperatura utilizzando un termometro di precisione portatile.
      3. Monitora altri parametri abiotici dell'acqua di mare (salinità, ossigeno disciolto e pH) utilizzando uno strumento di misura multiparametrico.
      4. Regolare i parametri abiotici dell'acqua di mare, se necessario, per garantire la stabilità durante l'esperimento.
         NOTA: Le condizioni abiotiche nei sistemi sperimentali possono variare a seconda dei requisiti specifici di ciascun caso di studio. Ad esempio, se lo studio mira a simulare i cambiamenti stagionali o le ondate di calore marine, la temperatura e il fotoperiodo devono essere regolati di conseguenza per imitare le variazioni stagionali naturali. Allo stesso modo, se lo studio si concentra sulla simulazione di condizioni di ipossia o acidificazione degli oceani, è necessario apportare modifiche ai livelli di ossigeno e al pH dell'acqua di mare. Ciò garantisce che le condizioni sperimentali siano il più realistiche e pertinenti possibile, migliorando la validità e l'applicabilità dei risultati dello studio.
      5. Valutare la salute e il benessere dei pesci, identificando e gestendo i segni di stress o malattia come descritto nei passaggi 1.2.4.6-1.2.4.8.
      6. Cerca comportamenti anormali come nuoto irregolare, perdita di appetito, letargia, aggressività o isolamento.
      7. Verificare la presenza di segni di malattia, tra cui lesioni, ulcere, scolorimento, pinne serrate, muco eccessivo o rapido movimento delle branchie.
      8. Registrare tutte le osservazioni, annotando la data e le azioni intraprese.
   5. Condurre test settimanali sulla qualità dell'acqua.
      1. Misurare i livelli di ammoniaca (NH₃/NH₄), nitriti (NO₂^-) e nitrati (NO₃^-) utilizzando test colorimetrici.
         NOTA: Assicurarsi che tutti questi parametri siano al di sotto dei livelli rilevabili. Se i livelli superano i limiti, eseguire un ulteriore cambio dell'acqua, aumentare l'aerazione o regolare la filtrazione.
   6. Nutrire e monitorare l'alimentazione dei pesci.
      1. Fornire una dieta di alta qualità che soddisfi le esigenze nutrizionali specifiche del novellame (vedere la Tabella supplementare 1 per un esempio della composizione dettagliata della dieta).
         NOTA: Assicurarsi che la dimensione dei pellet di aquafeed (2-3 mm) sia adatta ai giovani, facilitando l'ingestione e la digestione.
      2. Regolare la quantità di mangime in modo che corrisponda al 2% del peso corporeo medio del pesce al giorno.
      3. Nutrire i pesci manualmente due volte al giorno: una al mattino e una al pomeriggio (impostare un orario specifico per mantenere una routine di alimentazione stabile).

2. Campionamento dei pesci, eutanasia, dissezione e raccolta del rene della testa

1. Assaggia i pesci dalle vasche.
   1. Seleziona i pesci in modo casuale dalle vasche per evitare distorsioni di campionamento.
   2. Usa una rete per trasferire delicatamente il pesce in un contenitore temporaneo riempito con acqua dell'acquario.
      NOTA: Ridurre al minimo il tempo di manipolazione per ridurre lo stress.
2. Prepara la soluzione per l'eutanasia.
   1. Utilizzare un contenitore appropriato (ad es. un secchio da 3 L) adatto a contenere il pesce.
   2. Sciogliere la quantità appropriata di Tricaina (MS-222) nell'acqua di mare per raggiungere una concentrazione finale di 200-300 mg/L¹⁸ (ATTENZIONE: vedere la Tabella 2 supplementare e il file 1 supplementare).
   3. Tamponare la soluzione con bicarbonato di sodio a un pH di 7,2-7,5.
3. Somministrare la soluzione per l'eutanasia.
   1. Mettere il pesce nella soluzione per l'eutanasia per almeno 10 minuti o fino a quando non si osserva la cessazione del movimento opercolare e la perdita dei riflessi (confermare l'eutanasia controllando l'assenza di risposta agli stimoli esterni).
   2. Registrare il peso corporeo (g) e la lunghezza totale (cm) del pesce.
4. Eseguire la dissezione dei pesci.
   NOTA: Per garantire una qualità ottimale del campione e la vitalità cellulare, il processo di dissezione deve essere completato il più rapidamente possibile, idealmente entro 5 minuti dall'eutanasia.
   1. Assicurarsi che la temperatura del laboratorio sia mantenuta a 19 °C utilizzando l'aria condizionata per ridurre al minimo le fluttuazioni durante il campionamento e l'elaborazione.
   2. Sterilizzare gli strumenti di dissezione (preferibilmente strumenti metallici in autoclave quando possibile) e allestire uno spazio di lavoro pulito con etanolo al 70% (ATTENZIONE, vedere la Tabella 2 supplementare).
   3. Posizionare il pesce soppresso su un lato su un vassoio di dissezione sterile con la testa rivolta verso la mano non dominante.
   4. Usando un bisturi, fai un'attenta incisione lungo la linea mediana ventrale del pesce dallo sfiato (ano) fino alle branchie.
      NOTA: Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità per evitare di danneggiare gli organi interni.
   5. Utilizzare con cautela le forbici da dissezione per estendere l'incisione ed esporre gli organi interni. Sollevare delicatamente i lembi della parete del corpo per fornire una visione chiara dell'anatomia interna.
   6. Localizzare il rene della testa: il rene della testa è posizionato appena dietro le branchie, vicino alla regione dorsale anteriore della cavità corporea, e si estende lungo il lato superiore della cavità corporea, sotto la colonna vertebrale.
      NOTA: Il rene della testa è in genere di colore più scuro rispetto ai tessuti circostanti (Figura 1).
   7. Elimina con cura tutti i tessuti circostanti, come il grasso e il tessuto connettivo, per visualizzare meglio il rene della testa.
      NOTA: Questo passaggio richiede una manipolazione delicata per evitare di danneggiare il rene della testa.
   8. Usando una pinza e forbici a punta fine, solleva con cautela il rene della testa e fai dei tagli precisi attorno ad esso per liberarlo dai tessuti circostanti.
      NOTA: Maneggiare delicatamente il fazzoletto per evitare danni. In un pesce che pesa circa 30 g, il rene della testa dovrebbe pesare circa 20-30 mg.
   9. Posizionare immediatamente l'organo asportato in un colino cellulare (rete di nylon da 100 μm) all'interno di una piastra di Petri sterile per garantire la sterilità e facilitare le successive fasi di lavorazione.
      NOTA: Da questo punto in poi, tutti i passaggi devono essere eseguiti il più rapidamente possibile (entro 5 minuti) per mantenere la vitalità cellulare. Per mantenere il campione fresco, eseguire i passaggi seguenti con la capsula di Petri posta su un contenitore riempito di ghiaccio e coperto con un foglio di alluminio.

Figura 1: Posizione del rene della testa: (A) Illustrazione che raffigura la posizione tipica del rene della testa dietro le branchie e lungo la regione dorsale anteriore della cavità corporea; (B) Immagine rappresentativa del rene della testa nell'orata, sottolineando la sua colorazione più scura rispetto ai tessuti circostanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Isolamento dei leucociti renali della testa (Figura 2)

Figura 2: Descrizione illustrativa dell'isolamento dei leucociti dal rene testa. Il protocollo prevede diverse fasi: a partire dall'omogeneizzazione del tessuto, seguita dalla centrifugazione in gradiente di densità, dalla raccolta dell'anello leucocitario, dal lavaggio dell'anello leucocitario e concludendo con la risospensione e l'aggiustamento della concentrazione cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

1. Omogeneizzare il tessuto.
   1. Mettere 2 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) in una capsula di Petri sterile.
   2. Assicurarsi che la maglia del filtro cellulare (rete di nylon da 100 μm) sia a contatto con l'HBSS ma non completamente sommersa.
   3. Macerare il rene di testa sul colino cellulare utilizzando lo stantuffo di una siringa. Applicare una leggera pressione per forzare i frammenti dell'organo attraverso la rete di nylon, creando una sospensione cellulare.
      NOTA: Se si elaborano più campioni, la piastra di Petri contenente la sospensione cellulare può essere conservata in frigorifero a 4 °C per alcuni minuti fino al passaggio successivo. Questa sospensione cellulare verrà utilizzata per l'isolamento dei leucociti.
2. Eseguire la centrifugazione in gradiente di densità.
   1. Preparare una soluzione di terreno a gradiente di densità con una densità di 1,077 g/mL, un'osmolarità di 353 mOsm/kg e un pH di 7,4 (vedere il file supplementare 1).
      NOTA: L'osmolarità può variare tra le diverse specie ittiche, quindi è fondamentale regolare l'osmolarità della soluzione del mezzo di gradiente di densità per soddisfare le esigenze specifiche di ciascuna specie.
   2. In provette di polistirene a fondo tondo da 5 mL, aggiungere con cautela 600 μL della soluzione del terreno a gradiente di densità.
   3. Prendere la sospensione cellulare (2 mL) e aggiungerla lentamente alla provetta contenente il mezzo di gradiente di densità. La prima goccia è fondamentale: aggiungerla molto delicatamente per evitare di destabilizzare la fase media del gradiente di densità.
      NOTA: Questo dovrebbe essere fatto con un rapporto 3:10 (Gradiente di densità medio: Sospensione cellulare). Utilizzare una pipetta Pasteur sterile da 1 ml per un'aggiunta precisa e delicata. Assicurarsi che la punta della pipetta tocchi il lato della provetta per evitare di disturbare lo strato medio del gradiente di densità. Evitare di mescolare il campione con il mezzo del gradiente di densità.
   4. Centrifugare le provette a 400 x g per 45 min a 4 °C con il freno disinserito. Ciò garantisce che gli strati rimangano intatti durante il processo.
      NOTA: Dopo la centrifugazione, dovrebbero essere visibili strati distinti. I leucociti formeranno un anello all'interfaccia tra il mezzo del gradiente di densità e il pellet di detriti cellulari (Figura 3).

Figura 3: I leucociti si riuniscono all'interfaccia tra il mezzo del gradiente di densità e il pellet di detriti cellulari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

3. Raccogli l'anello dei leucociti.
   1. Utilizzando una pipetta sterile Pasteur, aspirare delicatamente l'anello leucocitario (~100 μL) e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 2 mL.
      NOTA: Fare attenzione a non disturbare gli strati in modo significativo per evitare contaminazioni. Se l'anello leucocitario sembra contenere detriti o sospensioni scure, è consigliabile far passare la sospensione leucocitaria raccolta attraverso un nuovo filtro a mini cellule (100 μm) per garantirne la purezza. Posizionare il colino per mini cellule sulla provetta da microcentrifuga da 2 ml e trasferire delicatamente la sospensione leucocitaria attraverso il colino.
4. Lavare l'anello leucocitario.
   1. Aggiungere HBSS alle provette da microcentrifuga contenenti l'anello leucocitario fino a quando il volume raggiunge i 2 mL e risospendere delicatamente le cellule.
      NOTA: Conservare le provette in un contenitore pieno di ghiaccio e coperto con un foglio di alluminio per mantenere il campione a bassa temperatura. Assicurarsi che i tubi non entrino in contatto diretto con il ghiaccio. Mantenere questa configurazione di raffreddamento durante tutto il processo di lavaggio.
   2. Centrifugare i campioni a 400 × g per 10 minuti a 4 °C (il freno può essere inserito).
   3. Dopo la centrifugazione, scartare con cura il surnatante, lasciando il pellet sul fondo (che può essere quasi invisibile).
   4. Ripetere le fasi di lavaggio (aggiunta di HBSS, risospensione, centrifugazione e scarto del surnatante) fino a quando il pellet non è privo di impurità.
5. Risospendere e regolare la concentrazione cellulare.
   1. Risospendere le cellule in 1 mL di HBSS all'interno delle stesse provette da microcentrifuga da 2 mL utilizzate per i lavaggi.
   2. Raggiungere una concentrazione cellulare compresa tra 1 × 10⁴ e 1 × 10⁶ cellule per ml. Se il pellet iniziale è di grandi dimensioni, potrebbe essere necessario un ulteriore HBSS per diluire la concentrazione della cella all'intervallo desiderato. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e aggiungere altro HBSS secondo necessità in base alla conta cellulare ottenuta.
      NOTA: Si consiglia l'uso di un contatore di celle automatizzato per facilitare il processo.

4. Colorazione e fissazione dei leucociti (Figura 4)

NOTA: I kit di colorazione per cellule morte fissabili LIVE/DEAD forniscono un metodo migliorato per valutare la vitalità cellulare nelle cellule fissate utilizzando la citometria a flusso. Questi saggi utilizzano un colorante reattivo fluorescente che interagisce con le ammine cellulari. Se le membrane cellulari sono compromesse, il colorante può penetrare nelle cellule, reagendo con le ammine libere sia all'interno che sulla superficie cellulare, determinando un'intensa colorazione fluorescente. Al contrario, nelle cellule vitali, solo le ammine della superficie cellulare sono disponibili per reagire con il colorante, portando a una colorazione relativamente debole. L'intensità di colorazione viene mantenuta dopo la fissazione con formaldeide, che preserva anche il campione impedendo la crescita di microrganismi. I kit di colorazione per cellule morte fissabili LIVE/DEAD sono identici tranne che per il colorante fluorescente: disponibile in blu, viola, acqua, giallo, verde, rosso, rosso lontano o vicino all'infrarosso (infrarosso). In questo studio, abbiamo utilizzato il colorante reattivo fluorescente nel vicino infrarosso. Inoltre, questo saggio a colore singolo consente di testare altri parametri in parallelo in un esperimento multicolore.

1. Prepara la tintura.
   1. Portare i reagenti a temperatura ambiente (RT): Lasciare che una fiala del colorante reattivo fluorescente e la fiala di dimetilsolfossido anidro (DMSO) raggiungano la RT prima di rimuovere i tappi.
   2. Ricostituire il colorante: Aggiungere 50 μl di DMSO alla fiala contenente il colorante reattivo. Mescolare accuratamente e assicurarsi che il colorante si sia completamente sciolto.
   3. Utilizzare la soluzione colorante ricostituita il prima possibile, preferibilmente entro poche ore.
      NOTA: Ogni kit include cinque fiale individuali di colorante reattivo, che forniscono materiale sufficiente per colorare almeno 40 campioni di cellule. Tuttavia, dopo la ricostituzione, la soluzione di DMSO del colorante è relativamente instabile, in particolare se esposta all'umidità. Le porzioni non utilizzate possono essere conservate fino a 2 settimane a ≤-20 °C, al riparo dalla luce e dall'umidità.
2. Colora e fissa le cellule.
   NOTA: I tamponi adatti per la colorazione cellulare includono la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e la PBS di Dulbecco (D-PBS), purché non contengano proteine estranee come l'albumina sierica bovina o il siero. Quando si utilizza un colorante ammino-reattivo, evitare i tamponi Tris e le soluzioni con azoturo di sodio o proteine estranee per la risospensione e il lavaggio cellulare. In questo studio, abbiamo utilizzato l'HBSS per la sua composizione ionica bilanciata, che aiuta a mantenere l'equilibrio osmotico e fornisce ioni essenziali e glucosio per supportare il metabolismo cellulare e la vitalità durante il processo di colorazione. L'HBSS è inoltre privo di proteine estranee, prevenendo l'interferenza con il colorante reattivo e garantendo un'accurata valutazione della vitalità.
   1. Dopo aver contato le cellule e regolato la densità a 1 x 10⁶ cellule per mL con HBSS, trasferire 1 mL di questa sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 2 mL.
      1. Per ogni giorno, indurre la morte cellulare in almeno un campione da utilizzare come controllo per impostare la soglia di intensità della fluorescenza tra cellule vive e morte. Preparare i campioni in provette per microcentrifuga come segue:
         Provetta 1: Cellule vive - non colorate
         Provetta 2: Cellule vive - colorate
         Provetta 3: Cellule morte - non colorate
         Provetta 4: Cellule morte - colorate
         NOTA: Queste quattro provette devono essere preparate solo per un singolo campione in ogni esperimento come controlli. Per i campioni rimanenti, sono necessarie solo due provette (Tubo 1: campione - non colorato e Tubo 2: campione - colorato), in quanto fornirà informazioni sulle cellule che erano vive e quelle che erano morte.
   2. Controllo positivo per la morte cellulare: Porre la provetta etichettata Dead unstained (Tube 3) e Dead-stained (Tube 4) in un bagno d'acqua a 50 °C per 7 minuti per indurre la morte cellulare mediante trattamento termico.
   3. Colorazione delle cellule: Aggiungere 1 μl di colorante reattivo fluorescente ricostituito (dal passaggio 4.1.2) a 1 mL di sospensione cellulare nelle provette 2 e 4 (provette che verranno colorate) e mescolare bene.
   4. Incubare a RT per 30 minuti, al riparo dalla luce.
      NOTA: Se il fissaggio non è richiesto, è possibile saltare i passaggi 4.2.5-4.2.7 di seguito. Invece, lavare le cellule due volte con 1 mL di HBSS con albumina sierica bovina all'1% (vedere File supplementare 1) e risospendere in 1 mL di HBSS con albumina sierica bovina all'1%. Eseguire l'analisi sul citometro a flusso il più rapidamente possibile; In caso contrario, la vitalità cellulare potrebbe essere compromessa poiché le cellule non sono fissate.
   5. Lavare le cellule due volte con 1 mL di HBSS e risospendere le cellule in 900 μL di HBSS.
   6. Aggiungere 100 μl di formaldeide al 37% (ATTENZIONE, vedere la Tabella supplementare 2).
   7. Incubare per 15 minuti a RT.
   8. Lavare due volte con 1 mL di HBSS con albumina sierica bovina (BSA) all'1%, quindi risospendere le cellule in 1 mL di HBSS con BSA all'1%.
   9. Conservare i campioni in frigorifero a 4 °C. Analizzare le cellule entro 1 mese dalla fissazione.
   10. Analizzare la sospensione cellulare fissa mediante citometria a flusso utilizzando il canale di eccitazione e rilevamento appropriato.
       NOTA: I canali di eccitazione e rilevamento corretti possono variare in base allo strumento utilizzato (vedere la Tabella supplementare 3).

Figura 4: Descrizione illustrativa della colorazione e della fissazione dei leucociti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

5. Citometria a flusso

1. Acquisisci dati.
   NOTA: Le procedure da seguire sul citometro a flusso possono variare a seconda del citometro specifico utilizzato. In questo studio, i dati sono stati acquisiti utilizzando il citometro a flusso Attune NTx.
   1. Eseguire gli esempi.
   2. Posizionare il tubo del campione nella porta del campione.
   3. Iniziare l'acquisizione premendo start e quindi fare clic su registra una volta che il tasso di eventi (eventi/secondo) si stabilizza.
   4. Registra un minimo di 10.000 eventi per ogni campione nel cancello singoletto per un'analisi affidabile.
   5. Salva tutti i dati per ogni campione ed esegui il backup su unità esterne o cloud storage.
2. Analizza i dati.
   NOTA: Per l'analisi della citometria a flusso, sono disponibili diverse opzioni software. In questo studio, l'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando FlowJo v10.8.1¹⁹.
   1. Carica i file di dati: avvia il software di analisi della citometria a flusso e carica i file .fcs acquisiti dall'esperimento.
   2. Visualizzare i dati (Figura 5A): Tracciare la dispersione diretta (FSC-A) (XX) rispetto alla dispersione laterale (SSC-A) (YY) per valutare le dimensioni e la granularità delle celle.
      NOTA: Questo grafico è comunemente usato per identificare le popolazioni cellulari ed escludere i detriti in base alle loro proprietà di dispersione.
   3. Gating delle celle singoletto ed esclusione dei multipletti (Figura 5B): utilizzare il grafico dell'area di dispersione diretta (FSC-A) rispetto all'altezza di dispersione diretta (FSC-H) per escludere i multipletti. Disegna un gate per includere tutti gli eventi allineati nel grafico (celle singole) ed escludere quelli non allineati (multipletti). Se il campione presenta eventi con FSC molto basso, escluderli non includendoli sul gate della singola cella, rimanendo solo cellule singoletto.
   4. Identificazione delle popolazioni leucocitarie (Figura 5C): Distinguere le 3 popolazioni leucocitarie in base al profilo FSC-A/SSC-A: FSC-A^alto/SSC-A^alto sono i granulociti, FSC-A^medio/SSC-A^medio sono i monociti e FSC-A^basso/SSC-A^basso sono i linfociti.
   5. Viability gating (Figura 5D): Impostare la soglia per la colorazione del colorante di vitalità sul canale di fluorescenza corrispondente (NIR, RL3-A). Le cellule vive rispetto a quelle morte sono definite in base all'intensità di colorazione con LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain: le cellule colorate in dim sono definite come cellule vive e le cellule fortemente colorate sono definite come cellule morte.
   6. Statistiche sulla popolazione: guarda le statistiche fornite dal software, inclusi gli eventi totali (celle) in ogni porta e le percentuali delle celle totali e gated.
   7. Esporta dati: esporta i dati in un foglio di calcolo e utilizza un software statistico appropriato (GraphPad Prism o R) per ulteriori analisi statistiche.
      NOTA: La scelta dei metodi di analisi dipenderà dagli obiettivi della ricerca.

Figura 5: Strategia di gating della citometria a flusso per la valutazione della vitalità nelle cellule renali della testa: (A) Rappresenta il profilo FSC-A/SSC-A di tutti gli eventi raccolti. (B) Rappresenta l'esclusione dei multipletti in base alla definizione della regione dei singoletti in base alla linearità sul grafico Forward Scatter (FSC-A)/Forward Scatter (FSC-H). (C) Rappresenta le 3 principali popolazioni che sono state definite in base a FSC-A/SSC-A, dopo l'esclusione dei multipletti. (D) Rappresenta un istogramma che mostra la colorazione del colorante di vitalità viva/morta. Per impostare la soglia che permette di distinguere le cellule vive da quelle morte, i leucociti sono stati sottoposti a lieve shock termico (50 °C, 7 min) e poi colorati con colorante vitale. Le cellule positive ad alta intensità di colorazione (++) sono le cellule morte, mentre le cellule positive a bassa colorazione (+-) sono le cellule vive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

La Figura 6 presenta dati rappresentativi di citometria a flusso che mostrano le popolazioni leucocitarie isolate dal rene della testa di orata giovane (Sparus aurata) e la loro vitalità cellulare utilizzando il protocollo descritto in questo studio. La figura mette a confronto due campioni: uno con alta vitalità cellulare, in cui i pesci sono stati esposti a condizioni ottimali (Figura 6A

Discussione

Il metodo sviluppato in questo studio rappresenta un progresso significativo nella ricerca sull'immunologia dei pesci e promette di migliorare la comprensione delle risposte immunitarie dei pesci e la sostenibilità delle risorse marine. S. aurata è una preziosa specie ittica marina della famiglia degli Sparidae che funge da organismo modello ideale per diversi motivi, tra cui la sua rilevanza ecologica ed economica, nonché la sua versatilità nella ricerca di laboratorio in d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air Stones	N/A	N/A
Aquafeed	SPAROS, Lda., Portugal	N/A	High-quality diet
Automatic Cell Counting Equipment	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE automatic cell counter (NanoEnteK)
Automatic Water Refrigeration Systems	Foshan Weinuo Refrigeration Equipment Co., Ltd, China	N/A
Bio balls 1.5" Aquarium Pond Filter	TMC Iberia, Portugal	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Germany	A7906
Bucket (3 L)	N/A	N/A	To prepare and carry out euthanasia
Buckets (5 L)	N/A	N/A	To transport the animals
Cell Strainers	Jetbiofil, China	CSS-013-100	Cell Strainer, 100 μm nylon mesh, Sterile, Yellow
Centrifugue	Fisher Scientific, Germany	N/A	accuSpin Micro 17 R
Colorimetric Test Kit for Ammonia (NH4+/NH3)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrate (NO3-)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrite (NO2-)	Tropic Marin, USA	N/A
Computer	N/A	N/A	To acquire and analyse the data obtained from the flow cytometer
Computerized Control System (Profilux)	GHL, Germany	N/A	ProfiLux 3 Outdoor
Deionized water	N/A	N/A	To clean the Flow Cytometer
Density Gradient Medium: Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany	17-0891-01
Digital scale	KERN & Sohn GmbH, Germany	N/A	KERN EMS 300-3
Ethanol 70%	Millipore, Supelco, Portugal	EX0281	To keep the workspace clean
EVE Cell Counting Slides	NanoEnteK, Korea	N/A
Falcon Tubes (15 mL)	pluriSelect Life Science, Germany	05-00002-01	Sterile
Filter bag	TMC Iberia, Portugal	N/A	400 micron
Filter Sponge	N/A	N/A
Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune flow cytometer
FlowJo v10.8.1 Software	BD Life Sciences	N/A
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich, Germany	8.18708
Glass Wool	N/A	N/A
Hanks' Balanced Salt Solution	Merck Life Science S.L, Portugal	H6648	Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits	Life Technologies Europe, Netherlands	L10119	Near-IR fluorescent reactive dye + DMSO
Main Water Pumps	EHEIM, Germany		Universal 1200
Microcentrifuge Tubes (2 mL)	BRAND, Merck, Germany	Z628034	Sterile
Micropipette Tips	Sartorius, Germany	790010, 790200, 791000	Compatible with Sartorius, 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Micropipettes	Sartorius, Germany	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Mini Cell Strainers	pluriSelect Life Science Global Headoffice, Germany	43-10100-50	PluriStrainer 100 µm nylon mesh, Sterile
Multi-Parameter Measuring Instrument	WTW, Germany		Multi 3420 SET G + IDS digital conductivity cell (TetraCon 925) + Optical IDS DO sensor (FDO 925) + IDS pH-electrode (SenTix 940)
Pasteur Pipettes (1 mL, 5 mL)	Humeau Expert du laboratoire, France	248295	Sterile
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1194.500	60 x 15 mm, Polystyrene, Sterile
pH Meter	Hanna Instruments Inc., Romania		HANNA HI2211
Polystyrene round-bottom Falcon tubes (5 mL)	Fisher Scientific, Germany	14-959-2A	Sterile
Portable Precision Thermometer	Ebro Electronic, Germany	N/A	TFX 430
Protein Skimmers	Mantis	N/A	Tornado 120
Quality control beads/Performance test beads	Thermofisher Scientific, USA	N/A
Quarantine Tanks	N/A	N/A	Tanks with 660 L total volume
Rectangular Glass Tanks/Aquariums	N/A	N/A	Tanks with 200 L total volume
Refrigerator	N/A	N/A	To store the samples at 4 °C
Ruler 30 cm	N/A	N/A	To measure the fish's length
Sodium bicarbonate	Honeywell Fluka, Germany	31437	Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sterile Dissection Tools	N/A	N/A	(e.g. scalpel, scissors, fine-tipped forceps, dissecting tray/board)
Submerged Digital Heaters	TMC Iberia, Portugal		300 W, V2Therm Digital Heaters
Syringes 1 mL	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	Sterile, HSW Soft-Ject Syringes to macerate head-kidney
Temperature Sensors	GHL, Germany		PT 1000
Tricaine (MS-222)	ThermoFisher Scientific, Germany	118000500	Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt, 98% (C10H15NO5S)
Ultraviolet Water Sterilizer	EHEIM, Germany	5305010	ClearUVC-36
Water Bath	Fisher Scientific, Germany	N/A	Fisherbrand IsotempTM (P/N U01318)
Water-resistant Luminaires	N/A	N/A