Bu çalışma, MK ve BKK Ellison Tıp Vakfı için bir hibe ile desteklenmiştir. MK Yaşlanma Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar. Biz çekimler sırasında yardım almak için Soumya&#39;den Kotireddy teşekkür etmek istiyorum.

Bölüm 1: replikatif ömrü analizi için suşları ve plakalar hazırlayın Bu bölümde, replikatif ömrü deneyi ve ömrü analiz için maya hücreleri hazırlanmasında kullanılmak üzere sağlam YEPD tabak hazırlanması açıklamaktadır. <ol><li> Uygun steril tekniği kullanarak, kültür maya hücreleri ve replikatif ömrü analizi için kullanılacaktır YEPD agar plakları (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 agar,% 2 glukoz) hazırlar. Ömrü deneyi analiz edilmesi için her 4-5 suşları için en az 2 tabak hazırlamak gerekir. Plakalar ömrü deneyden önce en az 2 gün önce hazırlanan ve ömrünü tahlil başlamadan önce kurumasına izin olmalıdır. Deney plakaları dökme 4-5 gün içinde yapılması durumunda, soğutmalı inkübatör yerleştirilir ve parafilm sarılmış veya kuruma önlemek için plastik olmalıdır. </li><li> YEPD agar plakları üzerine tek koloniler için dondurulmuş hisse senetleri ve çizgi maya suşları çıkarın. 6 suşları kolayca eşit büyüklükteki pasta şeklinde takozlar plaka bölümleme aynı YEPD plaka çizgili olabilir. </li><li> Hücreler, 2 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Inkübatör ve tek bir koloni yama hücreleri hücreleri, taze bir YEPD tabağa çıkarın. Iki farklı koloniler İki yamalar her bir suş için oluşturulan olmalıdır. Bu zamanda, analiz edilecek suşların dissectors bireysel suşlarının kimliğini bilmiyorum replikatif ömrü deney, &quot;kör&quot; yapılır sağlamak için kodlanmış olmalıdır. </li><li> Aşağıdaki akşama kadar 30 yamalı, kodlu hücreleri ° C inkübe edin. </li><li> Replikatif ömrü analizi için kullanılan deneysel bir tabak olarak hizmet verecek taze YEPD plakaları her kodlu gerginlik hücreleri ve hafifçe yama hücreleri çıkarın. Hücreler YEPD plaka (Şekil 1) sol tarafta dikey bir çizgi boyunca yamalı olmalıdır. Plaka başına yaklaşık 3-5 yamalar her yama 20 hücre replikatif ömrü analizi varsayarak, en uygunudur. Bu hücrelerin sonraki replikatif ömrü sınırlayabilir gecelik inkübasyon sırasında kalın büyümeye neden olarak, taze YEPD plaka hücrelerin çok sayıda transfer etmek için (ne de arzu edilir) gerekli değildir. </li><li> Geceleme tezgah üstüne taze yamalı plakaları inkübe edin. </li></ol> Bölüm 2: replikatif ömrü analizi için pozisyon hücreleri. Bu bölümde, maya hücreleri ve plaka nasıl replikatif ömrü analizi için bakire kızı hücreleri elde etmek için nasıl konumlandırmak için açıklar. Bu noktadan itibaren, tüm plakaları kuruma önlemek için diseksiyonu uygulanan durumlar dışında, parafilmed olmalıdır. <ol><li> Maya uygun bir mikrodiseksiyon cihazları ile donatılmış bir mikroskop kullanarak ilk yamalı gerginlik yaklaşık 50 hücreleri, yamalı hücreleri distal plaka bir konuma aktarın. Mikroskop sahne derecelendirildi ise hücreleri sonraki iterasyon sırasında bulmak kolay olacak, bu geçişleri sağlamak için kullanılabilir. Zeiss Axioscope 40, ilk yamalı gerginlik hücreleri koordinatları 90 x 10 yerleştirilir ve oradan dikey olarak dizilmiş. </li><li> Art arda agar yüzeyine dokunarak hücre iğne temizleyin, sonra agar agar yüzeyi boyunca iğne zorlayarak bir delik oluşturmak. Bu delik, diseksiyon ve yavru hücre çıkarılması sonraki iterasyon sırasında plaka üzerinde yönlendirmek sizin için bir işaretleyici olarak hizmet edecektir. Delik maya hücreleri elde etmek için ya da büyüyecek ve bir koloni formu dikkatli olun. </li><li> Doğrudan delik üzerinde, dikey, her hücre pozisyonlar (Şekil 1) arasında 1-3 iğne çapları (~ 100 mcM), 20 eşit aralıklı pozisyonlara bireysel maya hücreleri hizalamak. Her birkaç hücreler, birbirine bitişik iki hücre yerine birden paralel olarak aynı konumda yerleştirin. Devredilen hücreleri bölmek için başarısız olursa, bu, bakire kızı hücre seçimi sırasında artıklık sağlar. </li><li> 10. ve 11. pozisyonu doğrultusunda arasında, agar 7-8 delik yatay bir dizi oluşturmak. Bu diseksiyon ve yavru hücre çıkarılması sonraki iterasyon sırasında plaka yönlendirmek sizin için bir işaretleyici olarak hizmet verecek. Deliklere maya hücreleri elde etmek için ya da büyüyecek ve bir koloni formu dikkatli olun. </li><li> Tekrar aynı eksen boyunca dizi hücreleri dikey devam plaka üzerinde her yama için 2,1-2,4 adımları. 2.2 adım için, oluşturulan delik yama sayısı (ilk yama için bir delik, ikincisi için iki delik, vb.) Uygun olmalıdır. </li><li> Bir keresinde hücreleri parafilm plaka ve inkübe 30 ° C yaklaşık 2 saat boyunca, her yama için dizilmiş edilmiştir. </li><li> Deneyde, her plaka için 2,1-2,6 adımları tekrarlayın. </li></ol> Bölüm 3: ömrü analizi için elde bakire kızı hücreleri Bu bölümde, her hücre bir bakire kızı olarak başlar sağlayarak ömrü analizi başlatmakhücresi. <ol><li> Inkübatör plakaları çıkarın ve dizilmiş hücreler çoğu hücre bölünmesi uğramadığını kontrol edin. Hücre bölünmesi tamamlanmış olmasını sağlamak için ek süreye ihtiyaç duyulması halinde, inkübatör plaka dönün. </li><li> Ilk dizilmiş hücre ile başlayarak, ana hücreden yavru hücrelere bağlı hücrelerin üstüne hafifçe iğne koyarak ayırmak için iğne kullanın. Bu iğne hücreleri üzerinde dinlenme ise mikroskop tabanı yan dokunun bazen yararlı olabilir. </li><li> Ana hücre ve herhangi bir ek kızı hücrelerinin yerine, geçici olarak bir kenara taşıyarak dikey çizgi müstakil yavru hücre yerleştirin. </li><li> Dizilmiş hücrelerin her biri için 3.2 ve 3.3 adımı yineleyin. Bir hücre bölmek için başarısız olursa, adım 2.3 &#39;de yer gereksiz hücreler biri bir kızı hücre alır. Bittiğinde, ömrünün plaka üzerine dikey hizalanmış her yama için 20 yavru hücreye sahip olmalıdır. </li><li> Yığınına anne hücreleri ve ilave kızı hücreleri toplamak ve yamalar yakın bir alanda (&quot;mezarlık&quot;) geri aktarabilirsiniz. Kadar ömrü analizi mikrokoloniler ve yerel besinlerin tükenmesi oluşumunu engellemek için uygulanan hücrelerin istenmeyen hücrelerin tutmak için önemlidir. </li><li> Parafilm plaka ve inkübe 30 ° C yaklaşık 2 saat. </li><li> Deneyde, her plaka için 3,2-3,6 adımları tekrarlayın. </li></ol> Bölüm 4: Ölçüm tek tek hücrelerin replikatif kapasitesi <ol><li> Ömrü veri sayfaları hazırlayın. Bir ömrü veri sayfası, her satırı ayrı bir anne hücreye karşılık gelir ve her sütunun bir yaş-noktası (Şekil 2) karşılık gelen basit bir kılavuz olabilir. Analiz edilecek suşların sayısına göre her bir veri sayfasının etiketleyin. </li><li> Inkübatör plakaları çıkarın ve dizilmiş hücreler çoğu en az bir hücre bölünmesi uğramadığını kontrol edin. Hücre bölünmesi tamamlanmış olmasını sağlamak için ek süreye ihtiyaç duyulması halinde, inkübatör plaka dönün. </li><li> Ilk plaka üzerine dizilmiş ilk hücre ile başlayarak, anne ve yavru hücre (ler) görsel olarak gözlemlemek ve meydana gelen hücre bölünmeleri sayısını belirlemek. Bir anne, cep düzenlemelerin karakteristik kalıplarına dayalı üretti kaç kızı hücreleri belirlemek için genellikle kolaydır. Ömrü puan kağıda uygun kutuya ana hücre tarafından üretilen yavru hücreye numarasını kaydedin. </li><li> Adım 3.2 &#39;de açıklandığı gibi ana hücreden kızı hücreleri ayırmak için iğne kullanın. </li><li> Dikey çizgi konumunu anne hücre saklayın ve bir kenara geçici olarak yavru hücre (ler) taşımak. </li><li> Dizilmiş hücrelerin her biri için 4,3-4,5 adımları tekrarlayın. </li><li> Atılır kızı hücrelerinin tümünü toplayın ve orijinal yamalar yakınında bulunan &#39;mezarlık&#39; taşıyabilirsiniz. </li><li> 30 Parafilm plaka ve inkübe ° C 2-3 saat. </li><li> Deneyde, her plaka için 4,3-4,8 adımları tekrarlayın. </li><li> Tüm anne hücreleri bölünerek geçinceye kadar tekrarlayın 4,2-4,9 adımları. Hücrelerinin annenin yaşı gibi, hücre döngüsünün ilerlemesi daha yavaş olur ve bu yaş noktaları arasında daha uzun süre için plaka inkübe arzu olacaktır. Plakalar 4 ° C gecede yerleştirilebilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci Sonuçlar. Replikatif ömrü deneyi tarafından üretilen ham veriler, her yaş-noktası (Şekil 2) Her bir ana hücre tarafından üretilen yavru hücreye karşılık gelen bir liste numaraları. Puan sayfasının her satır toplayarak, her anne hücre için replikatif ömrü elde edilir. Veri aynı deney grubu anne hücreleri için bir hayatta kalma eğrisi (Şekil 3A) oluşturmak ve ortalama yaşam süresi, ortalama yaşam süresi, ve standart sapma gibi istatistiksel hesaplamalar gerçekleştirmek için toplanmış olabilir. Wilcoxon Rank Sum testi gibi non-parametrik bir test, deney grupları arasında tespit ömrü önemli farklılıklar olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. Deney düzgün çalışır, hayatta kalma eğrisi düşük erken mortalite ile sigmoidal Shap gösteren Gompertz-Makeham kinetik ile görece hızlı bir gerileme ve bir yaşam eğrisinin düzleşme dışında daha geç yaşlarda takip kabaca tutarlı olmalıdır. Bu aralıkta değişimi dışında olmasına rağmen, en vahşi-tip suşlar, 20-30 nesil aralığında replikatif ömrü değerleri var. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Şekil 1.5" /> Şekil 1. Tipik bir replikatif ömrü plakası diyagramı. Maya hücrelerinin mikrodiseksiyon başlamadan önce akşam, 3-5 suşları plakanın bir tarafı hafifçe boyunca dikey bir çizgi (kırmızı kutu) YEPD plaka yüzeyine yamalı vardır. Gecede büyümesinin ardından, her bir suş yaklaşık 30 ayrı hücreler 20 pozisyonları içeren bir satır içine dikey olarak dizilmiş. Life a analysiler bu ilk hücreleri elde v bakire kızı hücreleri üzerinde yapılacaktır. Koloniler olarak besin yerel tükenmesi önlemek için uzak deneysel hücreleri yer almaktadır &quot;mezarlık&quot; (gri oval), deney sırasında (örneğin istenmeyen kızı hücreleri) mikrodiseksiyon elde Ekstra hücreleri yerleştirilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Bir replikatif ömrü taksitli sayfalık bir replikatif ömrü deneyi Ham veri gösterilmiştir. Her satır, tek bir maya anne hücreye karşılık gelir ve her sütunun bir yaş noktasına karşılık gelir. Her kutuda girilen numarayı bu yaş noktada o ana hücre tarafından üretilen kızı hücrelerinin sayısı. Her suş maya hücreleri diseksiyon bireysel analiz edilen suşların kimliğini hiçbir bilgiye sahip olduğunu kodlu bir numara ile etiketlenir. Yirmi hücrelerin her bir suş için test. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Replikatif ömrü deneyi Temsilcisi hayatta kalma ve büyüme eğrileri (A), (hücre bölünmesi sayısı. Replikatif yaş bir fonksiyonu olarak hala hayatta anne hücreleri kısmını komplo ile elde edilen sağkalım eğrileri (B) Büyüme eğrilerinin çizilmesi ile elde edilir . Bu örnekte yaş noktasının bir fonksiyonu olarak belirli bir suş tarafından üretilen yavru hücreye ortalama sayısı., gerginlik # 2 uzun ömürlü ama daha yavaş büyüme komplo azaltılmış ilk eğimi ile kanıtlandığı gibi, büyüyen.

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+yeast+aging.">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species.">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li><li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast.">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast.">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li><li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes.">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li><li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients.">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

Yaşlanma, hücresel bileşenleri ve ölüm ile sonuçlanan organelleri ilerleyici bir bozulma ile karakterize dejeneratif bir süreç. Maya<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Yaşlanma biyolojisi okumak için yaygın olarak kullanılan olmuştur ve maya uzun ömürlü birkaç belirleyicileri solucanlar da dahil olmak üzere, çok hücreli ökaryotlarda korunacak, sinekler ve fareler edilmiştir<sup&gt; 1</sup&gt;. Maya yaşlanma kolayca sayısal yaşla ilişkili fenotipler eksikliği nedeniyle, iki farklı ortak kullanım ömrü paradigmalar farklı bağlamlarda hücrelerinin ömrü ölçerek neredeyse sadece test edilmiştir<sup&gt; 2</sup&gt;. Kronolojik ömrü olmayan bir bölme, sükunet gibi devletin bir anne hücrenin hayatta olduğu zaman süresini ifade eder ve çok hücreli ökaryotlarda post-mitotik hücrelerin yaşlanma için bir model olarak hizmet etmek için önerilmiştir. Replikatif ömrü, kontrast, yaşlılık önce bir anne hücre tarafından üretilen kızı hücrelerinin sayısı anlamına gelir, ve mitotik aktif hücrelerin yaşlanma bir model olduğu düşünülmektedir. Burada Maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçmek için genelleştirilmiş bir protokol mevcut. Replikatif ömür testinin amacı, kaç kez, her anne hücre tomurcukları belirlemek için. Anne ve kızı hücreler Zeiss Axioscope 40 ya da benzeri başka bir model gibi standart bir ışık mikroskobu (toplam büyütme 160x), deneyimli bir araştırmacı tarafından kolaylıkla ayırt edilebilir. Anne hücreleri kızı hücrelerinin fiziksel olarak ayrılması, fiber-optik bir iğne ile donatılmış manuel mikromanipülatör kullanarak elde edilir. Tipik laboratuvar maya suşları anne ortalama 20-30 yavru hücreye üretmek ve bir ömür deneyi 2-3 hafta gerektirir.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast at JoVE.com

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Bu yazıda, maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçümü için genel bir protokol mevcut.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

20.5K Görüntüleme.  University of Washington. Bu yazıda, maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçümü için genel bir protokol mevcut.

Video: Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biyoloji

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.