وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة المعهد المصرفي # 0615996.

الجزء 1 : إعداد وسائط النمو الخيطية (NGM) لوحات بتري الديدان الخيطية التجريبية مثل ايليجانس جيم و P. عادة ما يتم تربيتها في المختبر pacificus في 6 لوحات تحتوي على نيماتودا بيتري الطول متوسطة النمو (NGM) 1. يتم الاحتفاظ الديدان في 20 درجة مئوية ، ولكن يمكن المحتضنة في مجموعة من درجات الحرارة (بين 4 درجات مئوية -- 25 درجة مئوية) ، تبعا للأنواع الديدان الخيطية والتصميم التجريبي. لإعداد لوحات مع NGM والتقنيات القياسية عقيمة لا بد من استخدامها لمنع التلوث الفطرية والبكتيرية. التالي هو بروتوكول لإعداد لوحات NGM : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن 15 ز آغار ، 2.4 غرام كلوريد الصوديوم ، 2 ز تريبتون ، و2،72 ز KH 2 PO 4 في دورق مخروطي L 2 ، وجعل حجم ما يصل إلى 1 لتر مع الأوتوكلاف ، والمياه ، والسماح لتبرد إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.8 مل من كل CaCl M 1 2 ، والكولسترول (5 ملغ / مل في الإيثانول) ، و 1 م MgSO 4. وسعها لمنع تلوث الفطرية والبكتيرية ، 1 مل ستربتوميسين (100 ملغ / مل) ، والنيستاتين 1ml (10 ملغ / مل) يمكن ان تضاف الى كل ليتر من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جهاز Unispense والحفاظ على ظروف معقمة ، يصب في وسائل الاعلام على لوحات المطلوب. ينبغي أن تملأ لوحات لنحو 2 / 3 الثالث كامل. وهناك معيار قطرها 60 ملم لوحة يتطلب حوالي 10 مل من وسائل الإعلام. لا تتحرك لوحات حتى يتم gelified تماما آغار ، وإلا سيكون هناك تفاوت سطح آغار ، مما يجعل من الصعب التركيز على stereomicroscope الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة المجففة ، ويمكن لوحات المصنف مباشرة أو تخزينها في 4 درجات مئوية حتى مع بذر البكتيريا. </li></ol> الجزء 2 : إعداد OP50 البكتيريا وبذر NGM وحات بيتري هو مثقف P. pacificus في المختبر من خلال تغذيتها على سلالة OP50 القولونية. OP50 لديها نمو محدود على لوحات NGM ، وبالتالي تكوين حشيش رقيقة يسهل تصور من الديدان 1. أن تنمو ثقافة OP50 ، استخدم LB - مرق : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ز bactotryptone ، خلاصة الخميرة 2.5 و 2.5 ز ز كلوريد الصوديوم إلى 500 مل زجاجة كأب المسمار ، يشكلون وحدة التخزين إلى 500 مل بالماء المقطر والأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحصين مرق مع مستعمرة واحدة من OP50 من لوحة الثقافة تحت ظروف معقمة وتركها تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LB - OP50 مستعد لاستخدامها ، ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أشهر إذا استمر العقم. كلما لوحات تحتاج إلى المصنف ، صب كمية صغيرة من المرق في الدورق معقمة صغيرة ، وهذا سيساعد على منع التلوث من ثقافة الأسهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات البذور ، والاستغناء عن 100-120 ميكرولتر من OP50 على القطر 60 ملم لوحة بيتري NGM ودوامة لانتشاره. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه اللوحات المصنفة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لالعشب ينمو. ويمكن الآن هذه اللوحات المصنفة يتم تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. تخزينها في وضع مقلوب يساعد على منع الجفاف السريع. </li></ol> الجزء 3 : جعل معول في هذا القسم ونحن تصف كيفية جعل لالتقاط الديدان. يستخدم لنقل التقاط الديدان من موقع إلى آخر. يتم اختيار من 30 سلك قياس 90 ٪ من البلاتين إيريديوم 10 ٪ ، رغم أن بعض الباحثين قد تفضل التراكيب المعدنية مختلفة قليلا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع حوالي 3-4 سم من الأسلاك ، ومكان منه 0.5 سم داخل غيض من ماصة باستير (الذي تم كسره تلميح إلى أصغر والطول) ، ثم ختم ذلك في الزجاج فوق الموقد بنسن. طول السلك يبرز من الزجاج حوالي 3-3،5 سم ، ولكن يمكن أن تختلف وفقا لتفضيلات الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتسطح نهاية السلك الذي جاحظ باستخدام مطرقة أو كماشة. ينحني ثم صعودا جزء بالارض لتشكيل حلج القطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنعيم حواف حادة للاختيار مع ورقة الرمل لمنع تلف أو أغار على دودة. </li></ol> الجزء 4 : الديدان الإلتقاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالتقاط الديدان وتعقيم سلك البلاتين على اللهب وسحب الطرف المسطح لبيك على طول العشب البكتيرية إلى معطف غيض مع البكتيريا لزجة سميكة ، مع الحرص على عدم ثقب أو تلف سطح آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام stereomicroscope ، جدا الفرشاة بخفة غيض زجة ضد الديدان دودة / ويمكن الحصول حتى على دودة العصي على البكتيريا على الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة على الدودة غيض من اختيار ونقل على الفور إلى لوحة جديدة عن طريق لمس أو انزلاق غيض من التقاط ضد العشب البكتيريا من لوحة جديدة ، والدودة ينبغي إيقاف الزحف. ويجب الحرص على عدم الاضرار سطح أغار على لوحة أخرى الديدان تزحف في ثقوب مما يجعل من الصعب استردادها. إذا الدودة يبقى على اختيار لفترة طويلة جدا ، فإنه قد يجفف. </li></ol> الجزء 5 : EMS الطفرات إيثيل سلفونات الميثان (EMS) يحرض طائفة واسعة من طفرات في الجينوم في 2. يمكن التعرف على المسوخ عن عيوب مثل وضع البيض ، وعيب العضلاتق ، وتحديد الجنس ، وتشكيل dauer ، والسلوك ، وتشكيل الغدد التناسلية. بروتوكول لالطفرات EMS مماثلة لتلك التي وصفها لجيم ايليجانس 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 500 مل (أو أكثر) من هيدروكسيد الصوديوم 1N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 4-5 ، 6 سم القطر بيتري لوحات كاملة من الديدان ، والتي تحتوي على بضع مئات من الديدان في الأحداث اليرقات الثالثة (J3) المرحلة ، ويغسل قبالة الديدان باستخدام 2-3 مل من M9 معقم لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل الديدان في ، القابل للتصرف العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق أو حتى الديدان تشكيل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح السائل واستخدامها 2 مل من M9 لإعادة تعليق الديدان. إضافة إلى 20 ميكرولتر EMS أنبوب يحتوي 2ml من M9 ويهز حلها. ثم يضاف هذا الحل EMS إلى 2ml التعليق دودة ودوامة بلطف. وسوف تركز النهائي EMS يكون 47 مم. الحذر : EMS هو المغير قوي جدا ويجب التعامل معها في غطاء الدخان. ينبغي أن يعامل جميع المواد (قفازات ، ماصات ، نصائح) التي تأتي في اتصال مع هذا المغير مع هيدروكسيد الصوديوم 1N إلى EMS والخاملة. ارتداء قفازات مزدوج خلال الإجراء بأكمله الطفرات EMS. تخلص من النفايات الخطرة وفقا لمبادئ توجيهية مؤسستكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب الطرد المركزي وتغطية سقف مع parafilm ؛ ضعه أفقيا في غطاء الدخان والسماح للديدان احتضان مقابل 3.5 ساعة. ويمكن أيضا أن يوضع أنبوب على سرعة منخفضة الروك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الأنبوب وتغطية سقف مع parafilm ؛ ضعه في وضع عمودي واحتضان حتى تغرق الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وطاف تخلص منه في كوب / قارورة تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم 1N. هذا سوف يعطل نظام الإدارة البيئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى 5 مل M9 الديدان ، عكس الأنبوب 25-30 مرات لغسل الديدان ، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة دقيقة أو حتى 5-7 الديدان تشكيل بيليه. نضح في وتجاهل طاف في الدورق 1N هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة غسل ما لا يقل عن 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي ، وإعادة تعليق بيليه دودة في الحد الأدنى (~ 500 ميكرولتر) من M9 وماصة بها على لوحات تحتوي على NGM حشيش OP50 البكتيريا. في هذه النقطة التي لم تعد بحاجة إلى العمل في هود الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا السائل الجاف لبضع دقائق ثم واختيار ونقل سليم يبحث J4 اليرقات لوحات المصنف الطازجة. تجاهل لوحة أصلية وفقا للمبادئ التوجيهية مؤسستكم النفايات الخطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك النفس الديدان mutagenized إخصاب. باستخدام stereomicroscope ، شاشة الظواهر جيل F2 للالمسوخ المتنحية من الفائدة. </li></ol> الجزء 6 : سورالين الطفرات في هذا القسم ونحن تصف إجراءات استخدام الطفرات TMP بالتزامن مع الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة (UV). ويستخدم على نطاق واسع TMP / الأشعة فوق البنفسجية طريقة للحث على الطفرات طفرات الحذف داخل الجينوم 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الديدان 4-5 ، 6 سم القطر لوحات بتري في أنبوب الطرد المركزي 15 مل كما هو موضح في الإجراء السابق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل M9 ، عكس 20 مرة لغسل الديدان ، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتكرار الغسيل لما مجموعه 3 مرات. نضح السائل وإعادة تعليق الديدان في 10 مرات عن حجمها من M9 يحتوي على 30 ميكروغرام / مل من TMP. 20 ماصة ميكرولتر من TMP (3 ملغ / مل) في 2 مل من M9. مثل EMS ، TMP هو مادة مسرطنة قوية ، ويجب التعامل مع اتخاذ تدابير السلامة المناسبة. وينبغي لمنع الخطر المحتمل من من العين السليمة للأشعة فوق البنفسجية ضوء ترتدي استخدامها. يجب تجاهل المستهلكات في أكياس واقية مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنبوب في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز سرعة منخفضة (40 UPM). تعيين أنبوب غطت عموديا لمدة 10 دقائق للسماح للجميع مصدر الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الديدان من الجزء السفلي من أنبوب مع ماصة باستير ونقلها على لوحة NGM غير المصنف. تجاهل المبادئ التوجيهية التالية طاف مؤسستكم الكيميائية الخطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على لوحة في الظلام حتى يتم امتصاص فائض TMP في لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقياس كثافة الأشعة فوق البنفسجية ، تعيين المسافة بين مصدر الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة وطبق مثل هذه الشدة على لوحة μW هو 500 / سم 2 4. إزالة الغطاء الألومنيوم والغطاء ، وتغطي وفضح لوحة تحتوي على الديدان TMP المعالجة لأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة لمدة 50 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية وترك الديدان في الظلام لمدة 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار ونقل سليم يبحث J4 اليرقات لوحات المصنف الطازجة. تجاهل المبادئ التوجيهية التالية لوحة أصلية مؤسستكم الكيميائية الخطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام stereomicroscope ، شاشة الظواهر جيل F2 للطفرة من الاهتمام. </li></ol> الجزء 7 : النتائج الممثل بعض P. وترد الظواهر pacificus متحولة الناتجة عن الطفرات (إما عن طريق البريد الممتاز أو TMP / الأشعة فوق البنفسجية) في الشكل رقم 1. كل طافرة له النمط الظاهري هو السمة التي يمكن تمييزها بسهولة من نوع الحيوانات البرية. من الديدانالتي تم تناولها مع المغير ، 30 J3/J4 اليرقات من جيل الآباء (P0) تم وضعها في لوحات منفصلة ، وسمح لوضع البيض ، والتي هي جيل F1. من لوحات والتي أظهرت ذرية F1 صحية ، تم نقل ما مجموعه 1000 F1s على لوحات فردية وفرزهم على سلالة F2 عن الظواهر. تم العثور على الحيوانات مع بدين وقصير 5،6 و 6 غير المنسقة والظواهر محول 7. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. Pristionchus pacificus نوع البرية والحيوانات الطافرة. ألف باء بالوزن بالوزن خنثى ذكر جيم دال dpy متحولة UNC متحولة E. الهيئة متحولة. أعلى فريقين تبين البرية خنثى نوع (يسار) والذكور الحيوانات (يمين) مقارنة مع طفرات مختلفة في لوحات المتبقية.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li><li>Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-1 (2005).</li><li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li><li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li><li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الطفرات هي تقنية تستخدم على نطاق واسع للدراسات الجينية في مختلف الكائنات النموذج التجريبي. وغالبا ما تستخدم لتحديد الطفرات التجارب وظيفة الجين 2. ويمكن استخدام الإجراءات الطفرات وصفها هنا ليس فقط لP. pacificus ، ولكن أيضا لجيم ايليجانس الخيطية وغيرها من ا?...

an introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis

يصف هذا البروتوكول الإجراءات للحفاظ على الديدان الخيطية في المختبر وكيفية mutagenize عليها باستخدام طريقتين البديل : إيثيل سلفونات الميثان (EMS) و 4 &quot;5 ، 8 trimethylpsoralen مقرونة الأشعة فوق البنفسجية (TMP / الأشعة فوق البنفسجية). الديدان الخيطية هي النظم البيولوجية قوية لدراسات علم الوراثة بسبب خطتهم بسيطة الجسم ونظام التزاوج ، والذي يتكون من المخنثين المصير التسميد والذكور التي يمكن أن تولد المئات من النسل للحيوان الواحد. تتم المحافظة على الديدان الخيطية في لوحات تحتوي على الحشيش. آغار من البكتيريا ويمكن نقلها بسهولة من لوحة إلى أخرى باستخدام الاختيار. EMS هو وكيل مؤلكل تستخدم عادة للحث على الطفرات والحذف نقطة صغيرة ، في حين TMP / الأشعة فوق البنفسجية يؤدي الى الحذف أساسا. اعتمادا على نوع من الديدان الخيطية المستخدمة ، وتركيزات EMS و TMP يجب أن تكون الأمثل. لعزل الطفرات المتنحية من الديدان الخيطية Pristionchus pacificus ، تم فحص الحيوانات بصريا للجيل F2 عن الظواهر. لتوضيح هذه الأساليب ، نحن mutagenized الديدان وبحثت عن غير منسقة (UNC) ، المسوخ (الهيئة) بدين وقصير (Dpy) والمحولات.

Watch this Scientific Journal Video about An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis at JoVE.com

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

الكشف عن العيوب المظهرية مع المسوخ هو طريقة مباشرة لتحديد الجينات التي تعمل في عملية بيولوجية معينة. في هذه المادة ونحن تصف كيفية الديدان الثقافة الحية الحرة (على سبيل المثال ،<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) في المختبر وتظهر طريقتين الطفرات المختلفة ، EMS و TMP الأشعة فوق البنفسجية /.

مقدمة لمختبر دودة : من الديدان إلى التثقيف الطفرات

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

an-introduction-to-worm-lab-from-culturing-worms-to-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Biology

34.1K Views.  University of Texas at Arlington. الكشف عن العيوب المظهرية مع المسوخ هو طريقة مباشرة لتحديد الجينات التي تعمل في عملية بيولوجية معينة. في هذه المادة ونحن تصف كيفية الديدان الثقافة الحية الحرة (على سبيل المثال ، Pristionchus pacificus) في المختبر وتظهر طريقتين الطفرات المختلفة ، EMS و TMP الأشعة فوق ال...

Video: An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em &gt; في ممحوضة السائل وسائل الإعلام وإنشاء المعدلة وراثيا الديدان عن طريق قصف Microparticle

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

باستخدام الماوس الخلايا السرطانية الثديية لتعليم المفاهيم الأساسية الأحياء: وحدة مختبر بسيط

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

قياس النشاط الأنزيمي اللاكتاز في مختبر التدريس

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...