この作品は、NSFの助成IOB＃0615996によって資金を供給されています。

パート1：準備線虫の増殖培地（NGM）ペトリ皿このような線虫やPと実験線虫pacificusは通常、線虫の増殖培地（NGM）1を含む6センチメートルペトリプレート上で実験室で培養されています。ワームは、20 ° Cに保たれていますが、気温の範囲（° C 4との間の - 25℃）でインキュベートすることができる線虫の種および実験計画に応じて、。 NGMでプレートを準備するには、標準的な滅菌技術は、真菌や細菌汚染を防ぐために使用する必要があります。以下は、NGMプレートを準備するプロトコルです。 <ol><li> 15gの寒天、2.4グラムのNaCl、2gのトリプトン、および2.72グラムのKH 2 2 Lの三角フラスコ中のPO 4を量り、水で1 Lにボリュームを構成してオートクレーブし、60℃の水浴中を冷却することができます。 </li><li> 0.8ミリリットル1 M 塩化カルシウム、コレステロール（エタノール中の5 mg / ml）をそれぞれ、と1 M MgSO 4を追加。真菌や細菌汚染を防ぐために、1 mlのストレプトマイシン（100 mg / ml）をし、1ミリリットルナイスタチン（10 mg / mlのは）培地の各リットルに追加することができます。 </li><li> Unispenseのマシンを使用し、無菌状態を維持し、目的の板にメディアを注ぐ。プレートは完全な約2 / 3番目に記入してください。標準的な直径60mmのプレートは、メディアの約10mlが必要です。寒天が完全にgelifiedされるまで、プレートを移動したりしないでください、それ以外は困難な実体顕微鏡でワームを集中すること、寒天の表面に凹凸があるでしょう。 </li><li>いったん乾燥させ、プレートはすぐに播種または4℃で保存できます細菌でシードまでのC。 </li></ol>パート2：OP50細菌を準備し、NGMペトリ皿を播種 P. pacificusは、大腸菌 OP50株を食べることによって実験室で培養される。 OP50は、それによって、ワーム1の可視化を容易に薄い芝生を形成し、NGMプレート上の限られた成長を持っています。 OP50の文化を成長させるために、LB -ブロスを使用します。 <ol><li> 500 mlのスクリューキャップのボトルに、蒸留水とオートクレーブで500 mlにボリュームを構成する5グラムバクトトリプトン、2.5 gの酵母エキスと2.5グラムのNaClを追加。 </li><li>無菌条件下での培養プレートからOP50のシングルコロニーを液体培地に接種し、37℃で一晩成長させ℃に</li><li> LB - OP50は、使用する準備ができており、無菌性が維持されている場合、4℃で数ヶ月保存できます。プレートがシードされる必要がある場合は、必ず小さな滅菌ビーカーに培養液の少量を注ぎ、これは株式の文化の汚染を防ぐことができます。 </li><li>シードのプレートに、直径60mm NGMペトリ皿とそれを広めるために渦巻きにOP50の100から120μlを分注する。 </li><li>成長する芝生のため、室温で一晩これらのシードプレートをインキュベートする。これらの生成済のプレートは、現在、最大3週間までは4℃で保存することができます。倒立位置にそれらを保管すると急激な乾燥を防ぐのに役立ちます。 </li></ol>パート3：ピックを作るこのセクションでは、ワームのピックを作成する方法について説明します。ピックは、ある場所から別の場所にワームを転送するために使用されます。一部の研究者がわずかに異なる金属組成を好むかもしれませんがピックは、30ゲージ90％プラチナ10％イリジウムのワイヤーで作られています。 <ol><li>ワイヤーの3-4 cmのカット、場所は、パスツールピペット（その先端より小さい長さに切断された）の先端部、及び内部のそれの0.5 cmのブンゼンバーナーを介してガラスにそれを封印。ガラスから突出線の長さは約3〜3.5センチメートルですが、個々の好みに応じて変えることができます。 </li><li>ハンマーやペンチを使って出ているワイヤの端を平らに。その後、スクープを形成するために平坦化された部分を上に曲げる。 </li><li>ワームや寒天の損傷を防ぐために、サンドペーパーでピックのシャープなエッジを滑らかに。 </li></ol>パート4：ピッキングワーム<ol><li>ワームを選択するために、穿刺または損傷寒天表面​​に注意していないながら、厚い粘着性細菌との先端を炎に白金線を殺菌し、コートに細菌の芝生に沿ってピックアップの平坦化された先端をドラッグします。 </li><li>実体顕微鏡を使用して、非常に軽くワームはピックで細菌に付くまでピックアップされるワーム/ワームに対してスティッキー先端を磨きます。 </li><li>ワームは、ピックの先端にしたら、触れたり、新しいプレートの細菌の芝生に対してピックの先端をスライドさせて新しいプレートにすぐにそれを転送し、ワームがオフクロールする必要があります。ケアは、ワームは、それが難しいそれらを取得すること穴にクロールする他のプレートに寒天の表面を傷つけないように注意する必要があります。ワームが長すぎるためにピックしたままの場合、それは生気を奪うかもしれない。 </li></ol>第5部：EMS変異誘発エチルメタンスルホネート（EMS）は、ゲノム2での突然変異の広いスペクトルを誘導する。変異体は、産卵、筋肉の欠陥などの欠陥によって識別することができますの、性決定、dauer形成、行動、および生殖腺の形成。 EMS変異誘発のためのプロトコルは、Cに対して記載したものと同様です。 エレガンス 1。 <ol><li> 1N NaOHを500mlのを（またはそれ以上）を準備。 </li><li> 4-5取る、ワームの完全な直径6cmペトリ皿、サード幼虫幼若（J3）の段階で数百ワームを含む、プレート当たり滅菌M9 2〜3 ​​mlを使用してからワームを洗う。 </li><li>滅菌済み、使い捨て15 ml遠心チューブ内のすべてのワームを収集する。ワームは、ペレットを形成するまで5-7分のためのまたは1500 × gで遠心する。 </li><li>液体を吸引し、再度サスペンドワームにM9の2 mlを使用してください。 M9の2ミリリットルを含むチューブに20μlのEMSを追加し、それを溶かすために振る。その後、静かにワームのサスペンションと渦の2ミリリットルにこのEMSソリューションを追加します。 EMSの最終濃度は47 mMのようになります。注意：EMSが非常に強い変異原性物質であり、ドラフト内で処理する必要があります。この変異原物質と接触するすべての材料は（手袋、ピペ​​ット、チップ）は、非アクティブEMSに1N NaOHで処理されるべきである。全体のEMS突然変異誘発手順の間に二重手袋を着用してください。あなたの機関のガイドラインに従って有害廃棄物を処分する。 </li><li>遠心管を配置し、パラフィルムでキャップをカバーする、ドラフト内で水平に配置し、3.5時間インキュベートワームを聞かせ。チューブはまた、低速度のロッカー上に配置することができます。 </li><li>チューブを回して、パラフィルムでキャップをカバーする、ワームのシンクまでの垂直位置とインキュベートの場所。 </li><li>上清を吸引除去し、1N NaOHを含むビーカー/フラスコにそれを捨てる。これは、EMSを不活性化されます。 </li><li>ワームから5 mL M9を追加する、ワームのペレットを形成するまで5〜7分のためにまたは1500 × gでワーム、遠心分離機を洗浄するためにチューブを25から30回転倒。上清を吸引除去し、1NのNaOHのビーカーに捨てる。 </li><li>洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。 </li><li>最終洗浄後、M9の最小量（〜500μl）をでワームペレットを再サスペンドし、OP50細菌の芝生を含むNGMプレート上にそれらをピペット。この時点で、もはや化学のフード内で作業する必要はありません。 </li><li>数分間液体を乾燥させて、その後新鮮なシードのプレートにJ4幼虫を探して、健康を選択して転送する。あなたの機関の有害廃棄物のガイドラインにしたがって原版を破棄。 </li><li>突然変異ワームの自己受精させて。実体顕微鏡を使用して、関心の劣性突然変異体のF2世代の表現型をスクリーニングする。 </li></ol>パート6：ソラレン変異誘発このセクションでは、長波長紫外線（UV）と一緒にTMPを使用して突然変異誘発のための手順を説明します。変異誘発のTMP / UV法は、広くゲノム3内に欠失変異を誘発するために使用されます。 <ol><li>前の手順で説明した15 mlの遠心管に4-5、直径6cmペトリ皿からワームを収集する。 </li><li> 10ミリリットルM9を追加し、20回反転ワームを洗い、5分間1500 × gで遠心する。上清を捨て、3回の合計のために洗浄を繰り返します。 TMPの30μg/ mlを含むM9の約10倍の体積の液体と再サスペンドワームを吸引除去する。 M9の2mlにTMPのピペットを20μl（3 mg / ml）を。 EMSと同様に、TMPは強力な発がん性物質であり、適切な安全対策を取って処理する必要があります。適切な眼が身に着けている紫外光の潜在的な危険を防止するために使用する必要があります。使い捨ては、適切なバイオハザードバッグに廃棄する必要があります。 </li><li>低速のロッカー（40 UPM）に室温で15分間、暗所でチューブをインキュベートします。すべてのワームのシンクを聞かせ、10分間垂直に覆われた管を設定します。 </li><li>パスツールピペットでチューブの底からワームを削除し、シーディングされていないNGMプレートに移す。あなたの機関の有害化学物質のガイドラインに従って、上清を捨てる。 </li><li>過剰なTMPが板に吸収されるまでは暗いところでプレートを保管してください。 </li><li>紫外線強度計を用いて、プレート上の強度は500μW/ cm 2と4であることを長波UV光源とそのようなプレート間の距離を設定します。アルミカバーと蓋を取り外し、50秒間長波長紫外線にTMP扱わワームを含むプレートをカバーし、公開します。 </li><li>室温で5時間、暗所でワームをカバーしておきます。 </li><li>ピックと新鮮なシードのプレートに健康なJ4幼虫を移す。あなたの機関の有害化学物質のガイドラインに従って、原版を破棄。 </li><li>実体顕微鏡を使用して、関心の突然変異のためにF2世代の表現型をスクリーニングする。 </li></ol>パート7：代表的な結果 P.のいくつか変異誘発（どちらかEMSまたはTMP / UVによる）に起因するpacificus変異体の表現型は図1に示されています。それぞれの変異体は野生型の動物から容易に区別できる特徴的な表現型を持っています。ワームからその変異で処理した、親世代（P0）から30 J3/J4幼虫は、別々のプレートに配置し、F1世代な卵を、レイアウトを許された。健康なF1子孫を示したプレートから、1000 F1Sの合計は、個々のプレートに移し、F2子孫は、表現型をスクリーニングした。みすぼらしい5,6、非協調6と変圧器7の表現型を有する動物が発見された。 <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。Pristionchus pacificus野生型および変異動物。 A.重量両性B.重量男性C. ほかの細胞系列変異体D. UNC変異体E. TRA変異体。残りのパネルで別の変異体と比較する野生型雌雄同体（左）とオス（右）の動物を示す上の2つのパネル。

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li><li>Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-1 (2005).</li><li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li><li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li><li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

変異導入は、様々な実験モデル生物で遺伝学的研究に広く使用される技術です。変異導入実験はしばしば遺伝子2の機能を識別するために使用されます。ここで説明する変異誘発の手順は、P.のためだけでなく、使用することができます。 pacificusだけでなく、Cの虫や他の関連線虫の種。ここでは二つの方法、EMSおよびTMP / UV変異導入を説明します。 <p class...

an introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis

紫外線（TMP / UV）と組み合わせエチルメタンスルホネート（EMS）と4,5&#39;、8 - トリメチル：このプロトコルは、実験室で、どのように2つの代替方法を使用して突然変異を起こさせるために線虫を維持するために手順を説明します。線虫が原因の自己施肥雌雄同体と動物あたりの子孫の数百を生成することができる男性で構成される彼らのシンプルなボディプランと配偶システムの遺伝学研究のための強力な生物学的なシステムです。線虫は、細菌の芝生を含有する寒天プレートに保持され、簡単にプレートからピックを使用して別のに転送することができます。 TMP / UVは、主に欠失を誘導しながらEMSは、一般的に点突然変異と小さな欠失を誘導するために使用されるアルキル化剤です。使用されている線虫の種によっては、EMSとTMPの濃度は、最適化する必要があります。線虫Pristionchusのpacificusの劣性変異を分離するには、F2世代の動物が視覚的に表現型のスクリーニングを行った。これらのメソッドを説明するために、我々は、ワームの突然変異誘発し、非協調（UNC）、みすぼらしい（DPY）と変圧器（トラ）変異体を探した。

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An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

表現型欠陥の変異体のスクリーニングは、特定の生物学的プロセスで機能する遺伝子を同定するための簡単​​な方法です。この記事では、どのように文化の自由生活のワーム（例えば、への説明<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;）実験室で、二つの異なる突然変異誘発法、EMSおよびTMP / UVを示しています。

ワームの研究室の紹介：培養ワームから変異へ

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.1K ビュー.  University of Texas at Arlington. 表現型欠陥の変異体のスクリーニングは、特定の生物学的プロセスで機能する遺伝子を同定するための簡単​​な方法です。この記事では、どのように文化の自由生活のワーム（例えば、への説明 Pristionchus pacificus）実験室で、二つの異なる突然変異誘発法、EMSおよびTMP / UVを示しています。

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Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

生物学

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

電気生理学基づき固体支持された膜の概要

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

アン in vivoで</emからのタンパク質複合体を分離するために>架橋アプローチショウジョウバエ胚

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

培養<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em &gt;微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

コア生物学の概念を教えるために、マウス乳腺腫瘍細胞を用いた：簡単なラボ·モジュール

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

教育実習でラクターゼ酵素活性の測定

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...