Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF concedere IOB # 0615996.

Parte 1: Preparazione di terreni di crescita nematode (NGM) piastre Petri Nematodi sperimentali come C. elegans e P. pacificus sono tipicamente coltivate in laboratorio su 6 centimetri piastre Petri contenenti crescita media dei nematodi (NGM) 1. I worm sono mantenuti a 20 ° C, ma può essere incubate a una gamma di temperature (tra i 4 ° C - 25 ° C), a seconda della specie di nematodi e il disegno sperimentale. Per preparare piatti con NGM, tecniche standard di sterili devono essere utilizzati per prevenire la contaminazione da funghi e batteri. In seguito è il protocollo di preparare piatti NGM: <ol><li> Pesare 15 g di agar, 2,4 g NaCl, 2 g Triptone, e 2,72 g di KH 2 PO 4 in 2 beuta conica L, rendono il volume fino a 1 L con acqua, autoclave e lasciarlo raffreddare a 60 ° C a bagnomaria. </li><li> Aggiungere 0,8 ml ciascuna di 1 M CaCl 2, colesterolo (5 mg / ml in etanolo), e 1 M MgSO 4. Per prevenire la contaminazione da funghi e batteri, 1 ml di streptomicina (100 mg / ml) e nistatina 1 ml (10 mg / ml) può essere aggiunto ad ogni litro di terreno. </li><li> Utilizzando una macchina Unispense e il mantenimento di condizioni sterili, versare i media nei piatti desiderato. Le piastre devono essere riempite di circa 2 / 3 ° pieno. Un piatto standard 60 mm di diametro sono necessari circa 10 ml di media. Non spostare le piastre fino a quando l&#39;agar è completamente gelified, altrimenti ci sarà una superficie irregolare di agar, il che rende difficile mettere a fuoco i vermi sul stereomicroscopio. </li><li> Una volta essiccate, le piastre possono essere seminati immediatamente o conservato a 4 ° C fino alla semina con i batteri. </li></ol> Parte 2: Preparazione OP50 batteri e semina NGM piastre Petri P. Pacifico è coltivate in laboratorio per l&#39;alimentazione del ceppo E.coli OP50. OP50 ha una crescita limitata su piastre NGM, formando così un prato sottile che facilita la visualizzazione dei worm 1. Per crescere una cultura di OP50, utilizzare LB-brodo: <ol><li> Aggiungere 5 g bactotryptone, 2,5 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl ad una bottiglia da 500 ml con tappo a vite, portare al volume di 500 ml con acqua distillata e autoclave. </li><li> Inoculare il brodo con una singola colonia di OP50 dalla piastra di coltura in condizioni di sterilità e lasciarlo crescere overnight a 37 ° C. </li><li> LB-OP50 è pronto per essere utilizzato e può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi se la sterilità è mantenuta. Ogni volta che le piastre devono essere testa di serie, versare una piccola quantità di brodo in un bicchiere piccolo sterile e questo aiuterà a prevenire la contaminazione della coltura madre. </li><li> A piastre semi, dispensare 100-120 microlitri della OP50 sul diametro 60 mm NGM Petri e scuotere per diffonderla. </li><li> Incubare le piastre seminate durante la notte a temperatura ambiente per il prato a crescere. Queste piastre seminate ora può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 3 settimane. Memorizzandoli in una posizione invertita aiuta a prevenire la rapida essiccazione. </li></ol> Parte 3: Esecuzione di un pick In questa sezione viene descritto come fare un pick per i vermi. Il prelievo è utilizzato per trasferire i vermi da una posizione all&#39;altra. Il prelievo è composto da 30 calibro 90% filo di platino iridio 10%, anche se alcuni ricercatori potrebbero preferire composizioni di metallo leggermente diversa: <ol><li> Tagliare circa 3-4 cm di filo, posto 0,5 cm dentro la punta di una pipetta Pasteur (la cui punta era rotto a una lunghezza più piccola), e poi sigillare nel bicchiere sopra un becco Bunsen. La lunghezza del filo che sporge dal vetro è di circa 3-3,5 cm, ma può variare a seconda delle preferenze individuali. </li><li> Appiattire la fine del filo che è sporgente con un martello o una pinza. Poi piegare verso l&#39;alto parte appiattito a formare uno scoop. </li><li> Levigare gli spigoli del pick con una carta vetrata per evitare di danneggiare il verme o l&#39;agar. </li></ol> Parte 4: vermi Picking <ol><li> Per scegliere i vermi, sterilizzare il filo di platino a fuoco e trascinare la punta appiattita del pick lungo il prato batterica a cappotto con la punta spessa batteri appiccicoso, facendo attenzione a non forare o danneggiare la superficie agar. </li><li> Utilizzando lo stereomicroscopio, molto leggermente pennello la punta appiccicosa contro i vermi verme / essere ritirati fino al worm attacca al batteri sulla scelta. </li><li> Una volta che il worm è sulla punta del plettro, trasferirlo immediatamente alla nuova piastra toccando o scorrere la punta del plettro contro il prato batterica della nuova piastra, e il worm dovrebbe strisciare fuori. Bisogna fare attenzione a non danneggiare la superficie di agar sul piatto altrimenti i vermi strisciare nei fori rendendo difficile recuperarli. Se il worm rimane sul prendere per troppo tempo, potrebbe essiccare. </li></ol> Parte 5: EMS mutagenesi Solfonato metano etile (EMS) induce un ampio spettro di mutazioni nel genoma del 2. Mutanti possono essere identificati da difetti, come la deposizione delle uova, dei difetti muscolaris, la determinazione del sesso, la formazione dauer, il comportamento e la formazione delle gonadi. Il protocollo per EMS mutagenesi è simile a quello descritto per C. elegans 1. <ol><li> Preparare 500 ml (o più) di NaOH 1N. </li><li> Prendere 4-5, 6 cm di diametro piastre Petri pieno di vermi, contenente poche centinaia di vermi al terzo larvale giovanile (J3) stadio e lavare via i vermi utilizzando 2-3 ml di M9 sterile per piastra. </li><li> Raccogliere tutti i vermi in un contenitore sterile, monouso 15 ml di tubo di centrifuga. Centrifugare a 1500 xg per 5-7 minuti o fino a quando i vermi forma una pallina. </li><li> Aspirare il liquido e l&#39;uso 2 ml di M9 per risospendere i vermi. Aggiungere 20 l EMS in una provetta contenente 2 ml di M9 e agitare per dissolverlo. Aggiungere questa soluzione EMS al 2 ml di sospensione a vite senza fine e miscelare delicatamente. La concentrazione finale di EMS sarà 47 mm. Attenzione: EMS è un agente mutageno molto forte e devono essere trattati in una cappa aspirante. Tutto il materiale (guanti, pipette, puntali) che entrano in contatto con questo mutagene devono essere trattati con NaOH 1N a inattivo SME. Indossare i guanti doppio durante l&#39;intera procedura di mutagenesi EMS. Smaltire i rifiuti pericolosi secondo le direttive del tuo istituto. </li><li> Posizionare la provetta e coprire il tappo con parafilm; posto orizzontalmente nella cappa e lasciare che il worm incubare per 3,5 ore. Il tubo può essere posizionato su una sedia a dondolo a bassa velocità. </li><li> Ruotare il tubo e coprire il tappo con parafilm, posto in posizione verticale e incubare fino al lavandino vermi. </li><li> Aspirare il supernatante ed eliminarlo in un bicchiere / pallone contenente NaOH 1N. Questo inattivare la SME. </li><li> Aggiungere 5 ml M9 per i vermi, invertire il tubo di 25-30 volte per lavare i vermi, centrifugare a 1500 xg per 5-7 minuti o fino a quando i vermi forma una pallina. Aspirare il supernatante ed eliminarlo nel becher NaOH 1N. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio almeno 3 volte. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere il worm pellet in quantità minima (~ 500 microlitri) di M9 e pipetta fuori su piastre NGM contenente un prato di OP50 batteri. A questo punto non hai più bisogno di lavorare nella cappa chimica. </li><li> Lasciate asciugare il liquido per qualche minuto e poi raccogliere e trasferire sano cercando J4 larve di nuove piastre seminato. Scartare la piastra originale secondo le linee guida rifiuti pericolosi del tuo istituto. </li><li> Lasciate l&#39;auto mutagenizzate vermi fertilizzare. Utilizzando uno stereomicroscopio, schermo i fenotipi generazione F2 per mutanti recessivi di interesse. </li></ol> Parte 6: Psoralen mutagenesi In questa sezione sono descritte le procedure per mutagenesi utilizzando TMP in collaborazione con lunghezza d&#39;onda ultraviolette (UV). TMP / UV metodo di mutagenesi è ampiamente usato per indurre mutazioni per delezione all&#39;interno di un genoma 3. <ol><li> Raccogliere i vermi 4-5, 6 piastre di Petri cm di diametro in una provetta da 15 ml per centrifuga, come descritto nella procedura precedente. </li><li> Aggiungere 10 ml di M9, capovolgere 20 volte per lavare i vermi, e centrifugare a 1500 xg per 5 minuti. Eliminare il surnatante e ripetere il lavaggio per un totale di 3 volte. Aspirare il liquido e risospendere i vermi in circa 10 volte il loro volume di M9 contenente 30 mg / ml di TMP. Pipettare 20 ml di TMP (3 mg / ml) in 2 ml di M9. Come lo SME, TMP è un potente cancerogeno e devono essere trattati adottando misure di sicurezza adeguate. Per prevenire dal rischio potenziale della giusta luce UV occhio indossa dovrebbe essere usato. Il monouso devono essere eliminati in sacchetti di corretta rischio biologico. </li><li> Incubare la provetta al buio per 15 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo a bassa velocità (40 UPM). La camera d&#39;aria verticalmente coperto per 10 minuti per consentire tutte le lavandino vermi. </li><li> Togliere i vermi dal fondo della provetta con una pipetta Pasteur e trasferirli su un piatto NGM testa di serie. Scartare il sopranatante seguenti linee guida chimici pericolosi del tuo istituto. </li><li> Mantenere la piastra nel buio fino a quando la TMP in eccesso viene assorbito nel piatto. </li><li> Utilizzando un misuratore di raggi UV di intensità, impostare la distanza tra la sorgente di raggi UV onda lunga e la piastra in modo tale che l&#39;intensità sul piatto è di 500 μW / cm 2 4. Togliere il coperchio in alluminio e il coperchio e coprire ed esporre la piastra contenente i vermi TMP trattati per le radiazioni UV a onda lunga per 50 secondi. </li><li> Coprire e lasciare i vermi al buio per 5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere e trasferire sano cercando J4 larve di nuove piastre seminato. Scartare la piastra originale seguenti linee guida chimici pericolosi del tuo istituto. </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, schermo i fenotipi generazione F2 per la mutazione di interesse. </li></ol> Parte 7: Risultati Rappresentante Alcuni dei P. pacificus fenotipi mutanti derivanti dalla mutagenesi (sia da EMS o TMP / UV) sono mostrati in figura 1. Ogni mutante ha un fenotipo caratteristica che è facilmente distinguibile dal tipo di animale selvatico. Dal wormche sono stati trattati con il mutageno, 30 J3/J4 larve della generazione dei genitori (P0) sono stati collocati in piatti separati e il permesso di deporre le uova, che sono la generazione F1. Dalle piastre che ha mostrato sana progenie F1, per un totale di 1000 F1S sono stati trasferiti su piatti individuali e la progenie F2 è stato proiettato per i fenotipi. Gli animali con Dumpy 5,6, 6 e non coordinate trasformatore 7 fenotipi sono stati trovati. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pristionchus tipo pacificus selvatici e animali mutanti. A. wt ermafrodita B. peso maschile C. DPY mutante D. unc mutante E. TRA mutante. Prime due pannelli che mostrano selvatici tipo ermafrodita (a sinistra) e maschile (a destra) gli animali da confrontare con i mutanti differenti nei pannelli rimanenti.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li><li>Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-1 (2005).</li><li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li><li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li><li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mutagenesi è una tecnica ampiamente utilizzata per gli studi genetici in diversi organismi modello sperimentale. Esperimenti di mutagenesi sono spesso utilizzati per identificare la funzione di un gene 2. Le procedure di mutagenesi qui descritto può essere utilizzato non solo per P. Pacifico, ma anche per la C. elegans ed altre specie di nematodi correlati. Qui si descrivono due metodi, EMS e TMP / UV mutagenesi. EMS è una sostanza chimica che induce mutazioni...

an introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis

Questo protocollo descrive le procedure per mantenere nematodi in laboratorio e come mutagenize utilizzando due metodi alternativi: metano solfonato etilico (EMS) e 4, 5 &#39;, 8-trimethylpsoralen combinata con la luce ultravioletta (TMP / UV). I nematodi sono potenti sistemi biologici per gli studi di genetica a causa del loro piano di corpo semplice e il sistema di accoppiamento, che è composto di auto-fertilizzazione ermafroditi e maschi in grado di generare centinaia di progenie per animale. I nematodi sono mantenuti in piastre di agar contenente un prato di batteri e può essere facilmente trasferito da un piatto all&#39;altro con un plettro. EMS è un agente alchilante comunemente usato per indurre mutazioni puntiformi e piccole delezioni, mentre TMP / UV induce soprattutto le eliminazioni. A seconda della specie di nematode usato, le concentrazioni di EMS e TMP dovrà essere ottimizzato. Per isolare mutazioni recessive del pacificus nematode Pristionchus, gli animali della generazione F2 erano visivamente sottoposti a screening per fenotipi. Per illustrare questi metodi, abbiamo mutagenizzate worm e cercato non coordinate (Unc), Dumpy (DPY) e trasformatore (Tra) mutanti.

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An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Screening per mutanti con difetti fenotipici è un metodo semplice per identificare i geni che funzionano in un dato processo biologico. In questo articolo descrivono come i vermi che vivono la cultura libera (ad esempio,<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) In laboratorio e mostrano due differenti metodi di mutagenesi, EMS e TMP / UV.

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

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JoVE Journal

Biology

34.1K Views.  University of Texas at Arlington. Screening per mutanti con difetti fenotipici è un metodo semplice per identificare i geni che funzionano in un dato processo biologico. In questo articolo descrivono come i vermi che vivono la cultura libera (ad esempio, Pristionchus pacificus) In laboratorio e mostrano due differenti metodi di mutagenesi, EMS e TMP / UV.

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Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesi sito fatto in casa Regia di Plasmidi Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Ricerca

Biologia

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Introduzione alla membrana supportata Solid Sulla Elettrofisiologia

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Culturing<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Utilizzando il mouse cellule tumorali mammarie per insegnare concetti di biologia di base: un modulo di laboratorio semplice

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Misurazione dell'attività enzimatica della lattasi in laboratorio

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...