이 작품은 NSF 교부금 IOB # 0,615,996에 의해 재정 지원되었다.

1 부 : 준비 선충류의 성장 미디어 (NGM) 페트리 접시 이러한 C. 엘레간스 및 P.으로 실험 nematodes pacificus은 일반적으로 선충류 성장 매체 (NGM) 1을 포함 6cm 페트리 접시에 연구실에 양식 있습니다. 웜 20 ° C에 보관하지만, 온도 범위 (° C 넷 사이 - 25 ° C)에서 incubated 수있는 선충류의 종류와 실험 설계에 따라. NGM와 접시를 준비하려면, 표준 살균 기술은 곰팡이와 세균 오염을 방지하는 데 사용해야합니다. 다음은 NGM 번호판을 준비하는 프로토콜입니다 : <ol><li> 15g의 한천, 2.4 g NaCl, 2g Tryptone, 그리고 2.72 g KH 2 PO 4 2 패 원뿔형 플라스크에 물, 압력솥 1 L에 볼륨을 만들어하고 60 물을 욕조에 몸을 ° C를 냉각 허용 무게. </li><li> 0.8 ML 1 M CaCl 2의 각 콜레스테롤 추가 (5 MG / 에탄올에 ML), 1 M MgSO 4. 곰팡이와 박테리아 오염 1 ML의 스트렙토 마이신 (100 MG / ML)과 1ml nystatin (10 MG / ML) 방지하기 위해 매체의 각 리터에 추가할 수 있습니다. </li><li> Unispense 기계를 사용하고 살균 조건을 유지, 원하는 접시에 미디어를 부어. 접시는 차 3분의 2에 대한 전체에 가득해야합니다. 표준 60mm 직경 판은 미디어의 약 10 ML이 필요합니다. 한천이 완전히 gelified 때까지 접시 움직이 지마, 그렇지 않으면 어려운 stereomicroscope에 벌레를 집중할 수 있도록, 한천의 고르지 않은 표면에있을 것입니다. </li><li> 일단 건조, 접시는 4 즉시 씨앗하거나 저장할 수 있습니다 ° C를 박테리아와 시딩까지. </li></ol> 2 부 : OP50 박테리아를 준비하고 시딩 NGM 페트리 접시 P. pacificus은 E.coli OP50 변형에 먹이로 실험실에서 배양해 있습니다. OP50되므로 벌레 1의 시각화를 용이 얇은 잔디를 형성, NGM의 접시에 제한된 성장을하고 있습니다. OP50의 문화를 성장, LB - 국물을 사용합니다 <ol><li> 500 ML 스크류 캡 병으로, 증류수 및 압력솥 500 ML에 볼륨을 만들어 5g bactotryptone, 2.5 g 효모 추출물 및 2.5 g NaCl을 추가합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 문화 판에서 OP50의 단일 식민지로 국물을 예방하고 37 밤새기를 ° C. </li><li> LB - OP50는 사용 준비가되고 불임이 유지하는 경우 4 ° C 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 접시가 씨앗을해야 때마다 작은 살균 비커에 국물의 작은 금액을 부어 이것은 주식 문화의 오염을 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 종자 접시하려면, 60mm 직경 NGM 페트리 접시 그것을 확산하기 위해 소용돌이에 OP50의 100-120 μl를 분배. </li><li> 성장 잔디에 대한 실온에서 하룻밤이 씨앗 번호판을 품어. 이러한 씨앗 플레이트는 이제 최대 3 주 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 거꾸로 위치에서 그들을 저장하면 빠른 건조를 방지하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 3 부 : 선택 만들기 이 섹션에서 우리는 벌레에 대한 선택을하는 방법에 대해 설명합니다. 선택 한 위치에서 다른 위치로 웜을 전송하는 데 사용됩니다. 일부 연구자들은 약간 다른 금속 성분을 선호하는 수도 있지만 선택은 30 게이지 90 % 백금 10 % 이리듐 와이어로 만들어진 것입니다 : <ol><li> 와이어 3~4센티미터에 대한 잘라내기, 장소는 다음 파스퇴르 피펫 (그의 팁 작은 길이로 고장 난 것)의 팁, 그리고 안에 0.5 cm은 알콜 램프를 통해 유리에 그것을 봉인. 유리에서 튀어나온 철사의 길이는 약 3-3.5 cm이지만, 개인의 선호에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 망치 또는 펜치를 사용하여 튀어나와 철사의 끝을 평평하게. 그렇다면 특종을 형성하기 위해 평평 부분 위쪽 구부 러. </li><li> 웜 또는 한천 손상을 방지하기 위해 모래 종이 선택의 날카로운 가장자리를 Smoothen. </li></ol> 부 4 : 피킹 웜 <ol><li> , 웜을 선택 불꽃에 백금 와이어를 소독하고 주사 또는 손상 한천 표면에 치료하지 복용, 코팅 두께 스티커 박테리아와 팁을에 세균성 잔디밭을 따라 선택의 평평 팁을 드래그하십시오. </li><li> stereomicroscope를 사용하여 매우 가볍게 웜이 선택에있는 박테리아에 스틱까지 뽑힐 수있는 웜 / 웜으로부터 쓰는 팁을 브러시. </li><li> 벌레가 선택의 끝에되면, 만지거나 새 접시의 세균성 잔디에 대한 선택의 팁을 슬라이딩하여 새 접시에 즉시 전송하고, 웜은에서 크롤 링해야합니다. 케어는 다른 벌레가 어려운 이들을 검색할 수 있도록 구멍으로 기어 접시에 한천의 표면을 손상하지 않도록해야합니다. 벌레가 너무 오래를위한 선택 좋다면, 그것은 마르다 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : EMS 돌연변이 유발 에틸 메탄 설 폰 산염 (EMS)는 게놈 2에 돌연변이의 광범위한 스펙트럼을 유도. 돌연변이 달걀 부설, 근육의 결함과 같은 결함에 의해 확인할 수 있습니다S, 섹스 결정, dauer 형성, 행동, 및 생식선 형성. EMS 돌연변이 유발에 대한 프로토콜은 C.에 대한 묘사와 비슷합니다 엘레간스 1. <ol><li> 1N NaOH 500 ML (또는 이상) 준비합니다. </li><li> , 웜 가득 6cm 직경 페트리 접시를 4-5을 가지고 세 번째 애벌레 청소년 (J3) 단계에서 몇 백 벌레가 포함된 플레이트마다 멸균 M9로부터 2-3 ML을 사용하여 해제 벌레를 씻으십시오. </li><li> 멸균, 일회용 15 ML의 원심 분리기 튜브의 모든 벌레를 수집합니다. 벌레가 펠렛을 형성 때까지 5~7분 또는 1,500 XG에 원심 분리기. </li><li> 액체를 대기음 다시 중단 웜을 M9 2 ML을 사용합니다. M9의 2ml를 포함하는 튜브 20 μl EMS를 추가하고 그것을 해산하는 흔들. 그런 다음 부드럽게 웜 서스펜션과 소용돌이의 2ml이 EMS 솔루션을 추가합니다. EMS의 최종 농도 47 MM 것입니다. 주의 : EMS는 아주 강한 mutagen이며 퓸 후드에서 처리되어야합니다. 이 mutagen 접촉 모든 자료 (장갑, pipettes, 도움말) 비활성 EMS에 1N NaOH로 치료해야합니다. 전체 EMS의 돌연변이 유발 절차 중에 이중 장갑을 착용한다. 귀하의 기관의 지침에 따라 유해 폐기물을 배출. </li><li> 원심 분리기 튜브를 삽입하고 parafilm으로 뚜껑을 커버하며 퓸 후드의 수평을 장소 및 3.5 시간 동안 품어 벌레를 보자. 튜브 또한 저속 락커에 둘 수 있습니다. </li><li> 튜브를 켜고 parafilm으로 뚜껑 커버, 벌레 싱크까지 수직 위치 및 부화에서 개최합니다. </li><li> 뜨는을 대기음하고 1N NaOH를 포함하는 비커 / 플라스크에 폐기하십시오. 이것은 EMS를 inactivate 것입니다. </li><li> 웜 5 ML M9를 추가 웜은 펠렛을 형성 때까지 5-7 분 또는 1500 XG에서 웜, 원심을 씻어 관에게 25-30 번 반전. 뜨는을 대기음하고 1N NaOH의 비커에 폐기합니다. </li><li> 세척 단계 적어도 3 회 반복합니다. </li><li> 최종 세척 후, M9의 최소한의 금액 (~ 500 μl)에 벌레 펠렛을 다시 정지 및 OP50 박테리아의 잔디를 포함 NGM 접시에 그들을 피펫. 이 시점에서 당신은 더 이상 화학 후드에서 일할 필요가 없습니다. </li><li> 몇 분 동안 액체가 건조 해하고 선택하고 신선한 씨앗 판으로 건강 찾고 J4 애벌레를 전송할 수 있습니다. 귀하의 기관의 유해 폐기물의 지침에 따라 원래의 번호판을 폐기하십시오. </li><li> mutagenized 벌레 자체가 비옥하자. stereomicroscope를 사용하여 관심있는 열성 돌연변이에 대한 F2 세대 phenotypes를 화면. </li></ol> 6 부 : Psoralen 돌연변이 유발 이 섹션에서 우리는 긴 파장의 자외선 (UV)과 함께 TMP를 사용하여 돌연변이 유발에 대한 절차를 설명합니다. 돌연변이 유발의 TMP / UV 방법은 널리 게놈 세 이내에 삭제 변이를 유도하는 데 사용됩니다. <ol><li> 로 이전 절차에서 설명한 15 ML의 원심 관에 4-5, 6cm 직경 페트리 접시에서 벌레를 수집합니다. </li><li> 5 분 1,500 XG에서 웜 및 원심 분리기를 씻어 20 회 반전, 10 ML M9을 추가합니다. 뜨는을 취소하고 3 회 총 세탁을 반복합니다. 액체를 기음과 M9 자신의 부피가 30 μg / TMP의 ML을 포함하는 약 10 배에서 벌레를 다시 일시 중지합니다. M9 2 ML로 TMP의 피펫 20 μl (3 MG / ML). EMS와 마찬가지로, TMP는 강력한 발암 물질이고 적절한 안전 대책을 복용 처리되어야합니다. 자외선 적절한 눈 착용의 잠재적인 위험으로부터 방지하기 위해 사용해야합니다. disposables은 적절한 생물 학적 가방에 폐기해야합니다. </li><li> 저속 로커 (40 UPM)에 실온에서 15 분 어둠 속에서 튜브를 품어. 모든 벌레 싱크를 수 있도록 10 분 동안 수직으로 적용 튜브를 설정합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 튜브의 바닥에서 벌레를 제거하고 unseeded NGM 판에 그들을 전송합니다. 귀하의 기관의 유해 화학 물질 지침에 따라 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 초과 TMP가 접시에 흡수 될 때까지 어두운 접시 보관하십시오. </li><li> 자외선 강도 측정기를 사용하여 접시에 강도가 500 μW / cm 2 4되는 긴 웨이브 UV 소스와 같은 접시 사이의 거리를 설정합니다. 알루미늄 커버와 덮개를 제거 50 초 동안 긴 웨이브 UV 방사선에 TMP 처리 벌레가 들어있는 접시를 커버하고 노출. </li><li> 커버 및 실온에서 5 시간 동안 어둠 속에서 벌레를 두십시오. </li><li> 선택 신선한 씨앗 접시에 건강 찾는 J4 애벌레를 전송할 수 있습니다. 귀하의 기관의 유해 화학 물질 지침에 따라 원래 번호판을 폐기하십시오. </li><li> stereomicroscope를 사용하여 관심의 돌연변이에 대한 F2 세대 phenotypes를 화면. </li></ol> 7 부 : 대표 결과 P. 일부 돌연변이 유발 (중 EMS 또는 TMP / UV에 의해)으로 인한 pacificus 돌연변이 phenotypes는 그림 1에 표시됩니다. 각 돌연변이가 야생 동물 종류에서 쉽게 구별되는 특성 표현형 있습니다. 벌레에서mutagen, 부모 세대 (P0)에서 30 J3/J4 애벌레 별도의 접시에 배치하고 F1 생성 아르 달걀을 낳기 위해 허용되었다 취급다고. 건강 F1 자손을 보여주 접시에서 1000 F1s의 총 개인 접시에 양도되었고 F2 자손은 phenotypes에 대한 검사를했습니다. 덤피 5,6, Uncoordinated 6 변압기 7 phenotypes과 동물이 발견되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Pristionchus pacificus 야생 유형 및 돌연변이 동물. A. WT 남녀 추니 B. WT 남성 C. dpy 돌연변이 디 UNC 돌연변 E. 트라 돌연변이. 나머지 패널에있는 여러 돌연변이와 비교 야생 유형 남녀 추니 (왼쪽)와 수컷 (오른쪽) 동물을 보여주는 상위 2 패널.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li><li>Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-1 (2005).</li><li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li><li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li><li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

돌연변이 유발 다양한 실험 모델 생물의 유전자 연구 널리 고용 기법입니다. 돌연변이 유발 실험은 종종 유전자 2의 기능을 식별하는 데 사용됩니다. 여기에 설명된 돌연변이 유발 절차 P.을 위해뿐만 아니라 사용할 수 있습니다 pacificus뿐만 아니라, C.위한 엘레간스 및 기타 관련 선충류 종. 여기서 우리는 두 가지 방법, EMS 및 TMP / UV 돌연변이 유발을 설명합니다. <p c...

an introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis

자외선 (TMP / UV)와 함께 에틸 메탄 설 폰 산염 (EMS)와 4, 5 &#39;, 8 trimethylpsoralen :이 프로토콜은 실험실과 방법이 다른 방법을 사용하여 mutagenize에 nematodes을 유지하기 위해 절차를 설명합니다. Nematodes 때문에 자기 비옥하게하는 나온것과 동물마다 자손의 수백을 생성할 수 있습니다 남성 구성되어 있습니다들의 간단한 신체 계획 및 짝짓기 시스템의 유전학 연구에 대한 강력한 생물 학적 시스템입니다. Nematodes는 박테리아의 잔디를 포함하는 한천 플레이트에 유지되며 쉽게 한 접시에서 선택을 사용하여 다른 전송할 수 있습니다. TMP / UV 주로 삭제를 유도하면서 EMS는 일반적으로 포인트 돌연변이와 작은 삭제를 유도하는 데 사용 alkylating 요원입니다. 사용중인 선충류의 종류에 따라, EMS 및 TMP의 농도 최적화해야합니다. 선충류 Pristionchus의 pacificus의 열성 변이를 분리하려면 F2 세대의 동물은 시각 phenotypes에 대한 상영되었다. 이러한 방법을 설명하기 위해, 우리는 벌레를 mutagenized 및 Uncoordinated (UNC), 덤피 (Dpy)와 변압기 (트라) 돌연변이에 대한 보았다.

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An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

phenotypic 결함과 돌연변이에 대한 심사는 특정 생물 학적 과정에서 기능 유전자를 확인하는 간단한 방법입니다. 이 문서에서 우리는 어떻게 문화 무료 생활 웜 (예에 대한 설명<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) 실험실에서 두 개의 다른 돌연변이 유발 방법, EMS 및 TMP / UV을 보여줍니다.

웜 실험실 소개 : Culturing 웜에서 돌연변이 유발하는

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.1K 조회수.  University of Texas at Arlington. phenotypic 결함과 돌연변이에 대한 심사는 특정 생물 학적 과정에서 기능 유전자를 확인하는 간단한 방법입니다. 이 문서에서 우리는 어떻게 문화 무료 생활 웜 (예에 대한 설명 Pristionchus pacificus) 실험실에서 두 개의 다른 돌연변이 유발 방법, EMS 및 TMP / UV을 보여줍니다.

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Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

연구

생물학

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

배양<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em &gt; 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

핵심 생물학 개념을 가르치는 마우스 유방 종양 세포를 사용 : 간단한 랩 모듈

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...