Gostaríamos de agradecer ao Dr. David Olivieri para revisão crítica deste manuscrito, Dr. Nuno Moreno pela ajuda logística para construir o nosso titular animal e almofadas de aquecimento e Dr. Vijay K. Kuchroo para o tipo de doação Foxp3-KI gfp / gfp camundongos. Este trabalho é apoiado pela &quot;Fundação para Ciência e Tecnologia&quot; (FCT, Portugal), conceder # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. Preparação de animais Notas importantes: suspensões de células do timo BM e transplantes foram realizados em condições assépticas. As suspensões foram preparadas BM no interior do capuz da nossa sala de cultura de células, enquanto que o transplante de timo foi realizada na sala cirúrgica localizada dentro de nossas instalações para animais. A fim de manter e garantir essas condições assépticas, que não foram autorizados a gravar nosso vídeo nesses lugares. No entanto, todos os materiais cirúrgicos foram autoclavados e da bancada cirúrgica foi previamente limpa com Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) e etanol 70%. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e eles estavam de acordo com a Federação das Associações Laboratório Europeu de Ciência Animal (FELASA) directivas. O número de identificação de aprovação é AO10/2010. Todos os experimentos foram imagem de procedimentos terminal e os animais foram sacrificados imediatamente após o fim da imagemaquisição. O procedimento detalhado é o seguinte: <ol><li> Irradiar (com um irradiador γ) 8 semanas de idade camundongos Nude com 900 rads para destruir os precursores endógenos hematopoiéticas dentro da medula óssea (BM). Após a irradiação, o retorno dos animais ao seu gaiolas até que você prepare as células do doador BM para injecção intravenosa e reconstituição BM ainda mais. Esta transferência foi realizada BM 1 h após a irradiação. </li><li> Separar os animais dadores BM. Tíbias e fêmures de membros posteriores de um animal são geralmente suficientes para reconstituir até 3 animais destinatário. Após eutanásia com CO 2, retire a membros posteriores e, em seguida, retire a pele e os músculos dos ossos. </li><li> Corte a extremidade fechada de cada osso e lave-o com PBS (ou RPMI) ou esmagá-los todos em um almofariz, usando um pilão, com 2 ml de PBS (ou RPMI) para remover o BM. </li><li> Romper a estrutura BM em uma suspensão de uma única célula por repetições de vigorosa aspiração using uma pipeta P1000. Alternativamente, você também pode passar o BM através de uma agulha da seringa 21G várias vezes. Centrifugação (400g, 5 min, RT), re-suspender as células em PBS, e injectar por via intravenosa em sua nude-irradiados destinatários. Em nossos experimentos usamos BM de Foxp3-KI gfp / mice gfp, onde todas as células T reguladoras (Tregs) vai expressar GFP 1. </li><li> Aceitação da BM doador ocorre nos primeiros dias após a transferência, uma vez que não BM-reconstituída animais não podem sobreviver mais de 14 dias. No entanto, deve-se esperar por 4 a 6 semanas para permitir a recuperação completa de todos os compartimentos BM. Bactrim (Roche) foi adicionado à água (2 mg / ml) durante a primeira semana após a irradiação para diminuir o risco de infecções bacterianas. </li><li> Embrionárias timo transplante já foi descrito 2. Brevemente, começar a criação de pares de camundongos isogênicos e verifique se há entupimento (evidência de coito) todos os dias. Fêmeas em separado conectado e CO 2-sacrificá-los no dia 15 de pregnAncy (observação de plug é dia 1 de gravidez). Remoção dos embriões eo timo. Coloque o timo embrionárias no frio PBS até a transferência. </li><li> Para realizar o transplante timo, anestesiar BM-destinatário camundongos Nude com cetamina (120 mg / g de peso do rato) / xilazina (16 mg / g de peso do rato) e mantê-los em cima de uma almofada de aquecimento a 37 ° C até se obter inconsciente. </li><li> Cirurgicamente expor o rim para realizar o transplante do timo. Primeiro esfregue a pele com ChloraPrep (CareFusion Inc.) e etanol 70%. Então, faça um corte um centímetro na pele da parte do corpo volta-lateral do animal, 2 mm abaixo da última costela torácica. </li><li> Corte a cavidade peritoneal e puxe o rim desta cavidade. Faça um pequeno corte superficial na cápsula renal com uma lâmina de bisturi. Utilizando uma pinça com uma ponta muito fina fazer uma bolsa debaixo da cápsula renal do rato do destinatário e adicione até 4 lobos do timo nessa bolsa. </li><li> Coloque o b renal<html> ack ao seu lugar, sutura da cavidade peritoneal com um ou dois pontos, e feche a pele do rato usando o método de sutura mesmo. Alternativamente, suturas pode ser feito usando cola cirúrgica. </li><li> Injetam analgésicos (butorfanol a 5 mg / kg) por via subcutânea imediatamente após o término da operação para evitar a dor dos animais e manter os animais em uma almofada de aquecimento até que começar a se recuperar da anestesia. Os ratos são gaiolas individualmente para os 3 primeiros dias após o transplante para prevenir companheiros de gaiola de remover os pontos. Remove pontos após 1 semana. </li><li> Camundongos nude não têm células T. Portanto, você pode avaliar a aceitação do enxerto timo, monitorando a percentagem de CD4 + ou CD8 + T no sangue. Uma vez por semana, duas semanas após o transplante timo, sangrar os animais e manchar o sangue com anti-CD4 e anti-CD8 anticorpos monoclonais (MAbs). Quando o CD4: CD8 é de aproximadamente 2:1, o timo transplantado é totalmente funcional (Figura 1). </li></ol>&quot;&gt; 2. Intravital aquisição de imagem Prepare todos os materiais que você vai precisar de antecedência e colocá-los de lado. <ol><li> Anestesiar animais com cetamina / xilazina (mesmas doses descritas no item 1.5) e colocá-los em cima de uma almofada de aquecimento a 37 ° C. Injetar 100 ml de Rodamina B isotiocianato-Dextran (20 mg / ml em PBS) por via intravenosa para permitir a visualização futuro do fluxo sanguíneo. </li><li> Expor o rim transplantado que contém o timo de acordo com o protocolo previamente descrito no item 1.6. </li><li> Para evitar que o rim de volta à sua posição original, feche as laterais da incisão na pele com pontos. </li><li> Coloque um pedaço de algodão embebido PBS-na parte superior do órgão para mantê-lo úmido. </li><li> Coloque a almofada de aquecimento em cima do palco titular animal (Figura 2A). </li><li> Colocar o animal em cima da almofada de aquecimento no porta-animal, até de órgãos (Figura 2B). </li><li> Pitada o órgão em ambos os lados com uma braçadeira made de papel de alumínio fino (Figura 2C). </li><li> Feche o suporte do animal e colocar a sonda aquecedor superior o mais próximo possível de seu tecido (Figura 2D). Esta sonda aquecedor constantemente mede a temperatura de órgãos e envia essa informação para o aquecedor para ajustar a corrente elétrica, mantendo-o a 37 ° C. </li><li> Remover o algodão embebido PBS e adicionar ponto de fusão baixo agarose (2% em PBS) a 30 ° C no topo de sua preparação. </li><li> Cobrir toda a preparação com o aquecedor superior (Figura 2E). Na abertura deste aquecedor há uma lamela isolar a agarose do objetivo (Figura 2F). Monitorar a anestesia do mouse e injetar um impulso meia dose a cada 40 min. Após a aquisição da imagem, eutanásia do animal com CO 2. </li></ol> Nota: imagens do clipe de papel-alumínio e do aquecedor superior são apresentados na Figura 3. 3. Dois fótons de aquisição de imagem Usamos uma posição vertical &quot;Prairie Ultima XY&quot; microscópio de dois fótons. Nosso sistema é equipado com uma Ti: Sapphire laser, quatro PMTs superior para simultânea de até 4 aquisições do canal e um 20x objetivo imersão em água. <ol><li> Ligue a Ti: Sapphire laser eo sistema de microscópio todo. </li><li> Adicionar espelhos dicróicos e conjuntos de filtros de acordo com os comprimentos de onda desejados. No nosso caso, usamos um titular Olympus-BX2 Chroma contendo um espelho nm 565 dicróicas, um filtro 525/50 nm (para Foxp3 GFP-sinal), e um filtro 595/50 nm (para Dextran-rodamina-B do sinal dentro dos vasos sanguíneos ). A faixa de comprimento de onda do laser utilizado foi entre 880-900 nm. </li><li> Adicione o detentor de animais ao microscópio, conectar e ligar todos os aquecedores, adicione água sobre a abertura do aquecedor superior, inferior cuidadosamente o objectivo para a água, e se concentrar em um vaso ou algum GFP-Tregs. </li><li> Com o microscópio x, y, z controle externo, de forma rápida pesquisa no tecido para localizar uma região<html> de interesse. </li><li> Ajustar o ganho no PMTs para otimizar a separação de cores e minimizar a quantidade de laser necessária para conseguir sinal suficiente sobre o fundo. Tente usar a quantidade mínima de laser para evitar a foto-dano do seu tecido. </li><li> Uma vez que a região de interesse está localizado, comece lapso de tempo de imagem. No nosso caso, uma 5D típico (x, y, z, t, e cor) protocolo de aquisição consiste em adquirir imagens sequenciais de um volume de tecido 50 mm profundidade, dividido em 4,0 mM z-passos, x e y comprimento de 140 mM cada um. Cada volume tem cerca de 30 segundos a serem adquiridos. Portanto, 60 aquisições irão realizar cerca de 30 min de aquisição de imagem. </li><li> Transferir os dados para o servidor institucional e uso ImageJ, Imaris, ou software Volocity para executar multi-dimensional de processamento e monitoramento celular. </li></ol> 4. Resultados representante <html> g1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. . Embrionárias aceitação timo e função BM Após se recuperar, timo embrionárias foram transplantadas para animais BM reconstituída; duas semanas após o transplante de timo, esses ratos foram sangrados uma vez por semana para monitorar o percentual de subtipos de células T através da coloração com anti-CD4 e anti-CD8 MAbs. Consideramos o timo foi aceito com sucesso em animais com um CD4: CD8 em torno 1.5-2.0:1 (A). Para confirmar a sua funcionalidade, sacrificamos alguns animais timo-transplantados e comparou o percentual de diferentes subpopulações timócito com camundongos WT (B). As porcentagens de dupla negativa (DN; CD4 - CD8 - timócitos) subpopulações (por coloração com anticorpos anti-CD25 e anti-CD44 MAbs), duplo-positivos (DP; CD4 + CD8 + timócitos) e single-positivo (SP) CD4 + ou CD8 + timócitos foram semelhantes entre esses animais. ig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Conjunto do suporte de animais. Depois profundamente anestesiado, o animal é colocado em cima de uma almofada de aquecimento, anteriormente montado em cima do palco titular animal (A). O rim transplantado que contém o timo é voltada para cima (B). Um prendedor de folhas de alumínio delicadamente aperta o rim inteiro (C) para mantê-lo no lugar. Fig. 1C inserir mostra em detalhes do grampo. A parte superior do porta-animal é posto em prática (D). O algodão embebido PBS é removido do topo do órgão, substituído pelo quentes ponto de fusão baixo agarose, eo aquecedor superior é adicionado (E). Finalmente, toda a assembléia é transferido para o microscópio, aqui representado pelo objetivo (F). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> Figura 3. Detalhes das peças titular. Essas imagens mostram o prendedor de folhas de alumínio (A) segurando o rim (B). Note também a região onde o timo transplantado é localizado. Esta aproximadamente indica a regiãopara cortar a cápsula do timo e fazer o bolso para colocar o timo embrionárias. A lamela aquecedor superior (C) foi fixado com cola de silicone para a sua parte inferior (D). Movie 1. Intravital imagem de timócitos + Foxp3-GFP dentro do timo, onde os níveis fisiológicos de oxigenação e temperatura (37 ° C) foram mantidos durante todo o processo. Observe o fluxo sanguíneo e do movimento de Tregs. Estas velocidades podem ser medido e comparado com os dados publicados. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Clique aqui para ver o filme.</a> Filme 2. Intravital imagem de Tregs no interior de um timo onde as imagens foram adquiridas menos 30 ° C. Note a ausência de movimento e a forma redonda das células, apesar da manutenção do fluxo sanguíneo. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Clique aqui para ver o filme.</a>

<ol>
	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Neste trabalho, demonstrou os procedimentos para dois fótons de imagem de timócitos dentro de um animal vivo. Nós também descreveu alguns parâmetros que se deve controlar cuidadosamente, como a continuação do fluxo sanguíneo e à manutenção da temperatura do órgão durante os procedimentos de imagem. No entanto, apesar dos esforços o cuidado de manter o órgão estável, artefatos de movimento, como &quot;órgão drifting&quot; pode ocorrer. Correção de imagem posterior pode ser realizado através do desenvolvimento de algoritmos projetados especificamente para esta finalidade. Análise de imagem mais também poderia ser a fonte do desenvolvimento de novos protocolos que visa a minimizar os erros. O timo é o órgão onde todas as células T são produzidos e, portanto, é o órgão onde imunologistas interessados ​​em compreender a geração de γδ, CD4 ou células T CD8 irá centrar a sua atenção. A maioria dos estudos sobre as células T são baseadas em diferenças de números e / ou estabilidade destas cells após diferentes in vitro / in vivo manipulações. No entanto, somente após a visualização in vivo pudemos observar a interação entre as células do sistema imune envolvidos na manutenção da homeostase 3-7. Portanto, a observação em vivo dos timócitos é provavelmente uma das informações mais importantes em falta para compreender melhor a biologia das células T. Intravital TPM fornece um retrato detalhado dos movimentos de células T e as interações e demonstramos aqui como ele pode ser usado para estudos detalhados de timócito. No entanto, cada técnica tem suas limitações. Embora a aquisição de imagens intravital é o sistema mais acurado para refletir o comportamento de células dentro do corpo, também é verdade que a aquisição da imagem explantado de órgãos é menos trabalhoso e tem sido utilizado para coletar informações importantes sobre o sistema imunológico 8,9. Além disso, não se pode negar métodos de imagem intravital requerem cirurgia para expor os tecidos e vasos sanguíneos em animais anestesiados,que por si só pode causar uma alteração no órgão toda a fisiologia 10. No entanto, existem métodos não-invasiva que abolir a artefatos causados ​​pelo procedimento cirúrgico 11 e novos métodos estão sendo desenvolvidos que melhor se preparar com antecedência os animais a serem utilizados 12. Portanto, novos procedimentos cirúrgicos e portagens irá minimizar ou ignorar as limitações reais de aquisição de imagens intravital e se tornar mais e mais acessível à comunidade científica. Nós demonstramos que o método que descrevemos é viável e que relata todas as manipulações in vivo sistêmica, a administração dessas drogas, que temos usado. Assim, sugerimos o uso deste método em conjunto com técnicas ex vivo já disponíveis, a fim de complementar e reforçar mais estudos sobre o desenvolvimento timócitos.

<table border="1"><thead><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rodamina B ishothiocyanate-Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> preparar estoque em 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Microscópio de dois fótons </td><td> Prairie Technologies Inc. </td><td> Prairie Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> Ti: Sapphire a laser </td><td> Coerente, Inc. </td><td> Chameleon Família Ultra </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 objetiva de imersão NA </td><td> Olympus Inc. </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> Titular (Filtros / Dichroic) </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nm dichroic </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris software </td><td> Bitplane AG Inc. </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer Inc. </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, EUA </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

Dois fótons-Microscopia (TPM) fornece a aquisição de imagens em áreas mais profundas dentro tecidos e órgãos. Em combinação com o desenvolvimento de ferramentas estereotáxica novo e procedimentos cirúrgicos, TPM se torna uma poderosa técnica para identificar &quot;nichos&quot; dentro de órgãos e ao documento celular &quot;comportamentos&quot; de animais vivos. Enquanto imagem intravital fornece informações que melhor se assemelha ao comportamento real celulares dentro do órgão, é tanto mais trabalhoso e tecnicamente exigentes em termos de equipamentos necessários / procedimentos alternativos que ex aquisição de imagem in vivo. Assim, nós descrevemos um procedimento cirúrgico e da novela titular do órgão &quot;estereotaxia&quot; que nos permite acompanhar os movimentos de Foxp3 + células dentro do timo. Foxp3 é o regulador mestre para a geração de células T reguladoras (Tregs). Além disso, essas células podem ser classificadas de acordo com sua origem: ou seja. timo diferenciadas Tregs são chamados de &quot;ocorrência natural Tregs&quot; (nTregs), como opposed para perifericamente convertida Tregs (pTregs). Apesar de quantidade significativa de pesquisas tem sido relatado na literatura sobre o fenótipo e fisiologia destas células T, muito pouco se sabe sobre suas interações em vivo com outras células. Esta deficiência pode ser devido à ausência de técnicas que permitissem tais observações. O protocolo descrito neste artigo fornece um remédio para esta situação. Nosso protocolo consiste na utilização de camundongos nude que falta um timo endógena, uma vez que têm uma mutação pontual na seqüência do DNA que compromete a diferenciação de algumas células epiteliais, incluindo células epiteliais tímicas. Camundongos nude foram gama-irradiados e reconstituídos com abobrinhas óssea (MO) de camundongos GFP / gfp Foxp3-KI. Depois BM recuperação (seis semanas), cada animal recebeu transplante embrionário timo dentro da cápsula renal. Após a aceitação do timo (6 semanas), os animais foram anestesiados, o rim que contém otimo transplantado foi exposto, fixo em nosso titular do órgão, e mantidos sob condições fisiológicas para in vivo de imagens por TPM. Temos vindo a utilizar essa abordagem para estudar a influência de drogas na geração de células T reguladoras.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy at JoVE.com

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de &quot;nichos&quot; dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K visualizações.  Instituto Gulbenkian de Ciência. Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de "nichos" dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Vídeo: Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Imunologia e Infecção

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...