우리는 중요한 의견과 제안을위한 Wobus 연구소의 회원 감사드립니다. CEW의 실험실에서 일이 미시간 대학, 바이오 방어를위한 우수의 NIH / NIAID 지역 센터와 신흥 전염병 연구 (경찰과) 프로그램, 지역 V &#39;위대한에서 경력 개발 기금에서 시작 - 자금에 의해 추진하는 사업 호수 &#39;경찰과 (NIH 상 1-U54-AI-057153)와 NIH R01 AI080611. MBG-H. 미시간 대학에 실험 면역학 (NIH T32 A1007413-16)와 미생물 Pathogenesis에있는 분자 메커니즘 (NIH T32 A1007528) 교육 교부금의 지원을받는되었다. JBC는 Coordenação 드 Aperfeiçoamento 드 Pessoal 드 Nível 수 페리 어 (망토), 브라질리아, 브라질의 지원을받는되었다.

1. 264.7 RAW 대 식세포 셀 라인의 배양 <ol><li> 10 % (V / V) 낮은 내 독소 태아 소 혈청 (&lt;10 EU / ML)로 높은 혈당 DMEM으로 구성되어 DMEM-10 미디어 RAW 264.7 세포 (ATCC, 카탈로그 # 티비 - 71), 10 MM HEPES을 유지 , 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신, 1 MM 비 필수 아미노산, 2 MM L-글루타민. 세포는 일반적으로 병 당 미디어의 35 ML을 포함 175cm이 조직 문화 플라스크에 유지하고 37 incubated 아르 ° C 5 % 조직 문화 인큐베이터에서 CO 2. 그러나, 어떤 크기의 병은 병의 크기에 적합한 미디어의 볼륨와 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> 셀을 분할하려면 기존의 미디어를 대기음, 셀에 신선한 DMEM-10 미디어 10 ML을 추가 한 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크의 바닥에서 세포를 다 쳤어요. 다음, 10 ML의 피펫으로 세포를 그림으로써 동질적인 솔루션으로 세포를 resuspend하고 강제 피펫 팁 PR을 통해 세포를 쥐어술병의 바닥에 대한 essed. 최소 3 배 세포가 더 이상 덩어리 때문에 함께이 작업을 반복합니다. 하나의 세포 현탁액가 생성되었는지 빛 현미경으로 확인합니다. 새로운 175cm 두 플라스크에 세포 현탁액의 2 ML (1시 5분 희석 또는 ~ 2x10 7 세포), 미디어의 최종 볼륨을 최대 가지고 - 그리고 1 ML (1시 10분 희석 또는 ~ 1x10 7 세포)를 전송 35 ML. </li><li> 분할 세포가 (~ 1x10 8 셀 total/175 cm 2 플라스크)은 거의 합류 할 때 : 1시 5분 희석로 시작하는 경우 1시 10분 희석, 또는 모든 이일으로 시작하는 3 일 경우. 분할 세포하기 전에 세포 형태를 확인 빛 현미경을 사용하십시오. 세포의 대부분은 둥근 모양과 활성화해서는 안됩니다. 활성 세포는 가늘고 긴 형태 부속과 과립 및 / 또는 확장 수 있습니다. 이러한 세포는 일반적으로 액자를 형성하지 않는 셀 ...보다 빨리 자라다하게하지 마십시오. 통로 번호 추적 유지하고 자주 세포의 낮은 통로 나누어지는을 해동하여 다시 시작. (우리는 컷 - 오프로 통과 30 사용). </li></ol> 2. MNV Inoculum와 RAW 264.7 세포를 감염 <ol><li> 종자 RAW 264.7 1x10 6 가능한 셀 / DMEM-10 미디어 ML의 밀도에서 6 잘 플레이트 (3.5 cm 직경)로 세포, 각도이 정지 2 ML를 추가합니다. 그것은 손 적어도 10 번으로 판을 흔들거나 ~ 10 분에 흔들 장치를 사용하여 하나 고르게 우물에서 셀을 배포하는 것이 중요합니다. 소용돌이 접시를이 잘의 중심에 클러스터 셀의 원인이되므로하지 마십시오. 장소 플레이트 조직 문화 인큐베이터로 (37의 ° C 5 % CO 2). 세포가 37 ° C.에서 하루 아침에 적어도 4 시간에 첨부 할 수 있도록 허용 셀은 60해야 - 80 % 상패 분석​​을위한 합류하고 잘 걸쳐 균일하게 분포. </li><li> 다음 날, 조직 문화에 MNV에 감염된 세포에서 또는 MNV에 감염된 생쥐의 균질 조직 또는 배변 샘플에서 할 수있는 바이러스 inoculum을 준비합니다. 조직 샘플을 사용하여 완두콩 크기의 파이조직의 eces은 조직 균질를 (; 로슈 예 MagnaLyser)를 사용하여 DMEM-10의 1 ML에 무균 실리카 구슬을 포함하는 2 ML 나사 캡 튜브에 균질하고 있습니다. 배변 샘플의 경우, 더 이상의 3보다 배변 펠릿은 1 ML 미디어에서 균질해야합니다. 모든 샘플은 다음 냉동 (-80 ° C에서)과 상패 분석​​을 수행하기 전에 한 번 해동 있습니다. </li><li> DMEM / 높은 포도당, 5 % (V / V) 낮은 내 독소 태아 소 혈청 (&lt;10 EU / ML), 10 MM의 HEPES, 100로 구성되어 완벽한 DMEM-5 미디어에서 바이러스 inoculum의 10 배 dilutions을 준비 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 1 MM 비 필수 아미노산, 2 MM L-글루타민. </li><li> 열 배나 시리얼 dilutions가 24 잘 접시에 준비가되어 : A 중계 피펫은 여러 우물에 1.35 ML 미디어를 분배하는 데 사용됩니다, 10 -1 희석는 미디어의 1.35 ML 및 바이러스 함유 시료의 0.15 ML을 혼합하여 만든되고 그런 다음 10 -1 희석의 0.15 ML은 10 -2 dilutio를 만들기 위해 미디어 1.35 ML에 추가됩니다N 등. 이 팁 당신이 새로운 희석 할 때마다 변경하는 것이 중요합니다. 멀티 채널 피펫은 당 잘 0.15 ML의 총 볼륨을 (그림 3A 참조) 전송 24 잘 접시의 잘 하나에이 팁 피팅을 한 번에 여러 개의 샘플의 dilutions를 만들기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 조직 homogenates 및 배변 내용에 대한 일반적인 희석 범위는 10 -1 10 -3입니다. 그러나 이러한 샘플에서 액자는 조직 배양 샘플에서 해당에 비해 작은 경향이 있습니다. 또한, 일부 경우에 배변 샘플 1:100 희석 따라서 액자를 계산 할 수있는 능력을 방해, 충분히 세포 monolayer가 중단 될 수 있습니다 대소변의 독성 구성 요소를 희석하기 위해 필요합니다. 조직 문화 lysates의 희석 범위는 바이러스 수명주기 동안 관심의 시점에 따라 달라집니다. 10 -9까지 가서 Dilutions은 감염의 정상에 필요할 수 있습니다. </li><li> 시리얼 dilutions가 준비되고 나면, 6 잘 판에 레이블을s는 샘플 이름과 도금되는 dilutions와 RAW 264.7 monolayers을 (섹션 2.1에서) 포함. 한 번에 한 판, 이거 flicking하거나 aspirating하여 모든 미디어를 제거합니다. 바로 다음에 희석 샘플의 0.5 ML를 추가합니다, 그럼 다음 희석로 이동하기 전에, 중복도를 반복합니다. 모든 3 dilutions는 모든 셀이 적용되었습니다 보장하기 위해 손으로 앞뒤로 한 판, 틸트 판에 추가됩니다되면. 세포 밖으로 건조하지 않도록하기 위해 한 번에 하나의 판을 처리합니다. </li><li> 각도에 dilutions의 0.5 ML를 추가 한 후에 수직 플레이트를 스택과 실온에서 1 시간 사람들을 품다. 볼륨은 각 잘에 추가 완전히 monolayer를 커버하기에 충분하지 않으므로, 접시 부드럽게 손으로 모든 10-15 분에서 앞뒤로 기울거나 흔들 장치 (분 당 ~ 18 진동)에 배치해야합니다. 이 말리는의 세포를 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 낮은 녹는 점 아가로 오스 (SeaPlaque) 오버레이 준비 <ol><li> 1 시간에 부화가 완료되기 전에 플레이트의 총 볼륨에 필요한 오버레이의 양을 계산할 수 있습니다. 필요한 볼륨 / 잘 또는 12 ml/6-well 판 2 ML 있습니다. 아가로 오스 (섹션 3.2 참조) 별도의 미디어를 (섹션 3.3 참조) 준비합니다. </li><li> 아가로 오스를 준비하려면 유리 병에 증류수 (3 % w / V)의 100 ML의 총 볼륨에 SeaPlaque 아가로 오스의 3 G를 일시 중지합니다. 20-30 분 동안 압력솥. (아가로 오스는 이미, 전자 레인지에 재 용해 아가로 오스 손 전에 준비 된 경우.)은 아가로 오스가 너무 뜨거운 경우 ° C 사용하기 전에 물을 욕조에이 세포를 죽일 것이기 때문에 42 SeaPlaque 아가로 오스를 평형하는 것이 중요합니다. 수위 원치 않는 응고를 방지 할 수있는 아가로 오스의 수준 이상 동일해야합니다. </li><li> 미디어를 준비하려면 구성되어 배 가상 미디어, 100 ML을배 가상, 10 % (V / V) 낮은 내 독소 태아 소 혈청 (&lt;10 EU / ML), 10 MM의 HEPES, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 4 MM L-글루타민. ° C 물 목욕 37에 미디어를 평형. </li><li> 감염된 세포 monolayers을 오버레이 바로 앞에 1:1 비율로 SeaPlaque 아가로 오스와 멸균 병에 함께 배 가상 미디어를 모두 섞는다. 200 개 이상의 ML 오버레이가 필요한 경우 분할 다중 병에 볼륨 37에 유의 ° C 물 목욕 사용할 준비가 될 때까지. </li><li> 1 시간의 부화 (섹션 2.7 참조​​)의 끝 부분에 각도의 inoculum을 대기음. 천천히 각 우물의 벽을 피펫 팁을 배치하여 각 우물의 가장자리에 오버레이 2 ML를 추가합니다. 최대 5 개의 접시에이 세포 밖으로 건조하지 않고 동시에 처리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 오버레이 조직 문화 인큐베이터에 수직 플레이트를 걸기 전에 실온에서 약 10 분 동안 더욱 강화 할 수 있습니다. 5% CO 2에서 37 ° C에서 48 시간에 대한 번호판을 품다. </li><li> 후부화 기간이, 액자는 육안으로 희미하게 볼 수 있으므로, 액자의 존재에 대한 흠없는 접시를 확인합니다. 더 액자가 표시되지 않는 경우, 추가 4 시간에 품다 다시 확인합니다. 그러나, 최대 부화 시간은 72​​ 시간을 초과 할 수 없습니다. </li></ol> 4. 중립 레드 염색에 의한 액자의 시각화 <ol><li> - 1X PBS의 모든 97 ML (조직 배양 등급, MG 2 +로, 액자를 시각화하기 위해 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션은 중성 붉은 색의 3 ML (시그마, 카탈로그 # N2889 DPBS에서 0.33 % w / V)를 추가하여 준비가되어 있습니다 칼슘 2 + - 무료, Gibco는 카탈로그 # 10010). 12 ML 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션이 각 6 잘 판에 필요한 : 실험에 필요한 중립적 인 붉은 색 얼룩 솔루션의 볼륨을 계산합니다. 그런 다음 각 잘에 2 ML를 추가합니다. 일부 상패 분석​​ 프로토콜은 아가로 오스 플러그는 우물에서 제거 할 필요가 있지만,이 프로토콜에 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션은 오버레이에 직접 추가됩니다. </li><li> 에서 한 시간 후액자가 여전히 우물의 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션으로 표시되는 경우 37 ° C에서 cubation가 확인합니다. 액자는 쉽게 명백하지 않은 경우, 착색 다른 시간 동안 지속 할 수 있습니다. 액자가 표시 될 때까지 잠복기가 계속합니다. (참고 :. 이상 3 시간에 착색이 최적 아니며, 어떤 액자가 착색의 3 시간 후 긍정적 인 제어 예제에서 볼 수없는 경우, 상패 분석​​이 제대로 작동하지) 착색가 완료되면 중립 붉은 얼룩 솔루션을 기음 , 아가로 오스 플러그를 보장하는 것은 방해 한 다음 액자를 계산으로 진행되지 않습니다. </li><li> 가벼운 상자를 거꾸로 판을 배치하고 중복 카운트를 방지하기 위해 계산 액자에 점을 표시하여 액자를 계산합니다. (함께 액자의 융합 대한 시각적 증거를 즉 없음) 액자가 명확하게 구분되어 우물에 액자를 계산하기 위해 희석을 선택합니다. 가능하면, 두 dilutions에 액자를 계산합니다. 그렇게 상패 크기 MNV의 변종 바이러스 inoculum 사이에 다를 수 있습니다하는 것이 중요합니다, 그리고에 따라 달라집니다상패 분석​​ 중에 RAW 264.7 세포의 상태. </li><li> 더 액자는 잘에서 볼 수 없습니다, 각 샘플에 바이러스 존재 또는 바이러스의 양 상패 분석​​의 검출의 제한 속도를 넘지이 없었다합니다. 이 경우 우물은 다른 상패 함유 우물과 비슷한 색으로 붉은 색을 얼룩. 주어진 희석에있는 너무 많은 바이러스 입자가 될 때 액자의 부재도 관찰된다. 이 전체 monolayer의 용해에 이르게하고 우물은 색 노란색 / 주황색 표시됩니다. </li><li> 바이러스 titers을 계산합니다. 하나의 희석에 우물 모두에서 액자의 수를 추가하고 희석 요소 (예 : 1 ML이 우물은 0.5 ML에 감염되는 경우)에 의해 곱합니다. 이 1 ML의 inoculum 볼륨에서 플라크 형성 단위의 양 (PFU)를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 10 -2 희석의 그림 4에, 잘 하나 ( &quot;II&quot;로 표시) 14 액자을 가지고 있으며 다른 우물 ( &quot;V&quot;표시) 17 액자 있습니다. 따라서, 바이러스 titer는 14됩니다X10 2 + 17x10 2 = 3100 (3.1x10 3) PFU / ML. </li></ol> 5. 대표 결과 전염성 MNV-1 입자는 그림 1에 개략적으로 설명한대로 상패 분석을 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 그림 2A 방금 전에 감염에 대한 RAW 264.7 세포 monolayer로 잘 보여주고, 그림 2B는 I, II는 로마 숫자로 표시 셋 보이는 액자를 보여줍니다 동안 잘와 III. 분석의 각 단계는 그림에 묘사 된 아르 F. 그림 3A를 통해 3A는 바이러스 함유 시료의 10 배 희석 시리즈의 준비를 보여줍니다. 그림 3B는 6 잘 접시의 우물을 복제 할 수 dilutions의 전송을 보여줍니다. 그림 3C는 1 시간 동안 실온에서 inoculum와 RAW 264.7 세포를 배양하는 데 사용되는 흔들 장치를 보여줍니다 그림 3D는 세포가 SeaPlaque과 중첩되고 보여줍니다. 가상그림 3 층이 세포는 나중에 0.01 % 중립적 인 붉은 색 솔루션을 48 시간 물들하는 장면이 동시에 혼합. 그림 3E는 오버레이 더욱 강화 할 수 있도록 실온에서 판을 보여줍니다. 1-3 시간에 세포를 얼룩과 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션을 aspirating 후, 액자가 표시되어 있으며 (그림 4) 계산 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> 그림 1. MNV 상패 분석 프로토콜의 도식. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> 그림 2. 감염 이전과 액자 형성 후 monolayer의 잘 대표 이미지. A) RAW 264.7 세포는 20x 배율에서 가벼운 현미경으로 야간 및 이미징 배양 하였다. B) 셀은 48 H 후 0.01 % 중성 붉은 색 솔루션을 물들되었습니다감염 연구하고 4X 배율에서 가벼운 현미경으로 시각화. 로마 숫자 I, II, 및 III 세 보이는 액자를 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> 그림 3. 다른 상패 분석 단계의 대표 이미지. A) MNV-1 inoculum는 10 배 dilutions에 준비가되어 있습니다. B) Inoculum는 중복 우물의 세포 monolayers에 추가됩니다. C) 셀 및 inoculum은 실온에서 1 시간에 락 음악으로 incubated 수 있습니다. D) 셀 SeaPlaque 아가로 오스와 배 가상 미디어의 1:1 혼합물 중첩되어 있습니다. E) 플레이트는 오버레이가 더욱 강화 할 수 있도록 실온에서 10 분 동안 incubated 수 있습니다. 중립 붉은 얼룩 솔루션 48 시간이 후 감염 세포의 F) 얼룩. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> 셀 monol의 그림 4. MNV-1 양식 액자에어. 여기에 표시하면 부화의 1 시간 후 중성 붉은 얼룩 솔루션 물들 액자를 보여, 48 시간 게시물 감염 대표 상패 분석​​ 판입니다. 판은 세 10 배 dilutions의 중복 우물을 보여줍니다. I와 IV가 10-1 희석에 해당하는 로마 숫자로 표시 웰스, II와 V는 10-2 희석에 해당하는, III와 VI가 10-3 희석에 해당합니다. 샘플의 바이러스 titer는 (계산에 대한 자세한 내용은 4.5 절 참조) 아래 표시됩니다.

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	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 MNV-1에 대한 상패 분석​​ 방법은 전염성 MNV 입자를 정량화하는 방법이다. 그림 3에 도시 된 검정 단계를 수행하여 하나는 재현 바이러스 titers를 얻을 수 있습니다. 분석의 검출의 제한은 사용 시작 희석에 따라 달라집니다. 위의 설명에 따라 샘플의 1시 10분 희석로 시작하면, 상패 분석의 검출 한계는 10 PFU (즉, 10 -1 희석에 표시 한 명판)입니다. 각 플라크가 하나의 바이러스를 대표하기 때문에, 상패 분석은 절연 액자를 선택하고 그들에게 이전 한 기술 전파에 의해 MNV의 clonal 인구를 정화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 상패의 purifications는 혼합 바이러스 집단에서 개별 바이러스 인구를 구분하는 데 사용할 수 있습니다. MNV 감염의 검출을위한 상패 분석을 사용의 한계는 모든 MNV의 변종이 액자 4 대를 형성한다는 것입니다. 그러나, inabili을 극복 할 수도 있습니다직렬 조직 배양 7이 바이러스를 passaging하여 액자를 형성하는 동물로부터 분리 일부 MNV의 변종의 타이. 상패 분석에 대한 대안은 TCID 50 기술 3, 4를 통해 전염성 입자를 측정하는 것입니다. 이 분석은 엔드 포인트 dilutions와 MNV 4 완료 일주 소요에 따라 주사 조직 배양 세포의 50 %에 CPE를 생산하는 데 필요한 바이러스의 양을 단정 지을. 상패 분석보다 느린 것뿐만 아니라, TCID 50 검정는 또한 문자를 구분하지 않습니다 (감지 한계 = 200 TCID 50 / ML) RAW 264.7 세포 4 조직 샘플의 독성으로 인해. 프로토콜에서 중요한 단계 프로토콜을 통해 설명되어 있지만, 다음 절 문제 해결을 촉진 할 수있는 요약을 제공합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 RAW 264.7 세포가 바이러스 복제를 지원하는 분석을 통해 가능한 상태로 유지하는 것입니다. 이 수빛 현미경을 통해 분석의 각 단계에서 모니터링 할 수. 세포 생존 능력은 두 가지 방법으로 보장되어 있습니다. 첫째, 치료가 접시를 처리하는 동안 셀 아웃 리곤하지 않도록해야합니다. 따라서, 접시는 한 번에 하나씩 주사 감염 기간 동안 뻔하며, 처리되지 않습니다 때마다 유지 폐쇄해야합니다. 둘째, 솔루션은 세포에 추가하면 ~ 37 ° C.에 equilibrated해야 또한, 세포의 활성화를 제한하는 낮은 독소 혈청 (&lt;10 EU / ML)가 포함 된 미디어를 유지하는 RAW 264.7 세포의 전반적인 건강에 중요합니다. 통로 30 이상 세포를 사용하는 경우 또한, 우리는 상패 분석​​의 높은 실패율을 관찰했습니다. 이 가능성이 실험실에서 실험실에 따라 다를 수 있지만, 더 높은 통로 RAW 264.7 세포를 사용하여 특히, 재현 titers을 보장하기 위해 (예를 들어, 알려진 바이러스 titer와 샘플) 긍정적 인 제어를 포함하는 것이 중요합니다. 높은 통로 세포의 사용을 제한하기 위해, 일찍 무슨 일이야? 병을 고정 할 것이 좋습니다RAW 264.7 세포의 수령과 자주 얼어 붙은 병에서 새로운 문화가 시작시 GE 세포. 셀 변경 등, 세포 형태의 변화를 준수 (예 : 원형에서 가늘고 긴과 분산)를 위해 실패와 같은 특성, 또는 mycoplasma 오염이 감지되었습니다 전시 때 낮은 통로 세포 문화와 다시 시작하면 도움이 될 것입니다. 에주의를 지불 할 또 다른 중요한 점은 피펫 팁이 샘플 사이의 dilutions 동안 변경되어 있는지 확인하는 것입니다. 이 정확한 시리얼 dilutions을 보장 함과 샘플 사이의 교차 오염을 방지 할 수 있습니다. 동일한 샘플의 시리얼 dilutions가 우물에 추가 할 때 같은 피펫 팁을 다시 사용할 수있는 프로토콜의 한 단계입니다. 이 경우, 하나는 가장 희석 inoculum에서 최소로 시작하고 새로운 희석을 그릴 때 힘차게 아래로 피펫과해야합니다. 상패 분석​​ 프로토콜은 몇 가지 수정으로 수정할 수있는 것입니다. t 변경 할 수있는 하나 수정여기에 중복에 우물을 inoculating 충분한 세포가 아닌 각 희석 만 한 우물을 예방하는 것입니다. inoculum 볼륨이 0.5 ML이기 때문에 그러나, 액자의 수는 PFU / ML에 정상화하기 위해 2 인자를 곱한해야합니다. 상패 분석도 MNV의 복제를 지원 할 수 있습니다 다른 자기편 세포 라인에 사용하기 위해 구성 될 수 있으며, 이것은 손쥐 microglial BV-2 세포주 8 설명되어 있습니다. 구현 될 수있는 다른 수정은 다른 바이러스 개발 상패 분석​​ 프로토콜에 대해 설명 된 적응합니다. MNV의 경우, 다음과 같은 수정은 이미 성공적으로 구현 된, 메틸 대신 바다 플라크의 셀룰로오스 아가로 오스 9, 크리스탈 바이올렛 또는 그 대신 중립적 인 빨간색 10, 11의 푸른 메틸렌과 세포의 착색의 사용. 기타 상패 - 성형 바이러스를 수량화하기 위해 필요한 또는 oth에 사용으로 전반적으로,이 프로토콜을 쉽게 적용 할 수 있습니다그 일반적으로 전염성 바이러스 입자를 수량화 할 수있는 유용한 도구 만들기, RAW 264.7 세포에서 lytic 감염을 일으킬 응급실 바이러스.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM / 높은 포도당 </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2X 가상 </td><td> Gibco </td><td> 11,935 </td></tr><tr><td> 100x 페니실린과 스트렙토 마이신 </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 MM 비 필수 아미노산 </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 100 HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 MM (100x) L-글루타민 </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> 바다 플라크 아가로 오스 </td><td> Lonza </td><td> 50,100 </td></tr><tr><td> 중립 레드 0.33 % </td><td> 시그마 </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 10,010 </td></tr><tr><td> 1.0 mm의 지르코니아 / 실리카 비즈 </td><td> BioSpec 제품 </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> 모델 35 속도 로커 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> 마그나 Lyser 악기 </td><td> 로슈 </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> 원시 264.7 세포주 </td><td> ATCC </td><td> 티비-71 </td></tr><tr><td> 조직 문화 인큐베이터 </td><td> 산요 </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

손쥐 노로 바이러스 (MNV)는 효율적으로 조직 배양 1, 2에서 자랍니다 노로 바이러스의 종류의 유일한 회원입니다. 세포 용해 및 cytopathic 효과 (CPE) 손쥐 수지상 세포 나 대 식세포 1 MNV-1 감염 동안 관찰합니다. MNV-1이 속성은 상패 분석 1 수행하여 주어진 예제에서 전염성 입자의 수를 수량화하는 데 사용할 수 있습니다. 플라크 분석은 세포를 lyse하고 액자 3이라고 합류 셀 monolayer에 구멍을 형성 MNV-1의 능력에 의존합니다. 여러 개의 기술은 조직 배양, 수확 조직, 임상, 환경 샘플에서 바이러스 감염을 감지하는 데 사용하지만, 모든 측정 전염성 입자의 수 (예 : qRT-PCR). 할 수 있습니다 전염성 바이러스 입자를 수량화 할 수있는 방법 중 하나는 아래에 상세하게 설명 될 것이다 상패 분석 3을 수행하는 것입니다. MNV 플라크 분석에 변형 형석입니다MNV 항원이 세포 monolayers 4 immunostained되어 escent 초점을 분석. 바이러스 항원 표현이 플라크 형성을 앞에 때문에이 분석은 빠르게 할 수 있습니다. 또한 액자를 형성 할 수없는 바이러스를 titrating하는 데 유용합니다. 그러나, 형광 초점 분석은 항체과 집중 - 성형 단위를 계산하는 현미경으로 상패 분석​​의 이외의 추가 리소스를 필요로합니다. 전염성 MNV도 50 % 조직 문화 Infective 선량 (TCID 50) 3 결정하여 정량화 할 수 있습니다. 이 분석은 엔드 포인트 적정 (5)에 의해 주사 조직 배양 세포의 50 %에 CPE를 생산하는 데 필요한 바이러스의 양을 측정합니다. 그러나, 감지의 제한이 상패 분석 (4)에 비해 높다. 이 문서에서는, 우리는 효과적으로 생물학적 또는 환경 샘플 1, 4, 6 제시 전염성 MNV 입자의 수를 결정하는 데 사용할 수있는 상패 분석 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 바 있습니다허용 세포 (RAW 264.7 대 식세포 손쥐 세포)의 monolayer의 예방하​​기 위해 사용됩니다 MNV 함유 샘플의 10 배 시리얼 dilutions의 준비에 SED. 바이러스는 주어진 기간 동안 세포 monolayer에 연결하도록 허용하고 아가로 오스와 세포 배양 매체의 혼합과 셀을 포함하기 전에 흡입합니다. 먼에 위치한 셀에 확산을 제한하는 동안 한천은 주변 세포에 바이러스 자손의 확산을 수 있습니다. 따라서, 감염된 세포 lysed과 monolayer에서 양식 구멍 액자로 알려져 있습니다. 바이러스의 충분한 보급되면, 액자는 중립적 인 빨강, 메틸렌 블루, 또는 크리스탈 바이올렛과 ​​같은 염료와 셀의 표시 다음 착색된다. 낮은 dilutions에서 각 상패는 이웃 세포로 확산 한 전염성 바이러스 입자와 자손에서 유래 된 것입니다. 따라서, 액자의 수를 계산하는 것은 하나가 undiluted 샘플 3 현재 상패 - 성형 단위 (PFU)를 계산 할 수 있습니다.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

여기 효율적으로 세포 배양에 복제 유일한 노로 바이러스입니다 손쥐 노로 바이러스 (MNV)의 전염성 입자를 정량화하는 방법을 설명합니다. 플라크 분석은 손쥐 대 식세포에 대한 MNV의 tropism을 활용하고 MNV를 포함하는 생물이나 환경 샘플에서 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.

손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.5K 조회수.  University of Michigan, Ann Arbor. 여기 효율적으로 세포 배양에 복제 유일한 노로 바이러스입니다 손쥐 노로 바이러스 (MNV)의 전염성 입자를 정량화하는 방법을 설명합니다. 플라크 분석은 손쥐 대 식세포에 대한 MNV의 tropism을 활용하고 MNV를 포함하는 생물이나 환경 샘플에서 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.

비디오: Plaque Assay for Murine Norovirus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

연구

환경과학

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

면역학 및 감염병학

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

특정 성장 속도로 타 바이러스의 세포 바인딩 기능에 대 한 분석

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

플라크 분석: 플라크 형성 단위(PFU)로서 바이러스 역가를 결정하는 방법

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

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심화생물학

미생물학

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

Source: Madrigal, J. L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61048">Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates an assay for quantifying human norovirus virus-like particles (VLPs) binding to human intestinal bacteria. The bacterial suspensions are mixed with the VLPs and incubated to allow the formation of VLP-bacteria complexes. The complexes are then labeled with fluorophore-tagged VLP-specific antibodies, followed by flow cytometry-based visualization and quantification to identify the percentage of VLP-bound bacteria.

인간 노로바이러스 VLP와 장내 세균의 결합을 정량화하기 위한 분석

1. VLP-bacteria Attachment Assay
CAUTION: Human norovirus VLPs are a biosafety level (BSL)-2 hazard, and all work involving VLPs should be performed in a ...