Este estudo foi apoiado pelo NCI (R01-R01-94160 e 155086), IU Simon Cancer Center e Wells Centro de Investigação Pediátrica.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê IACUC na Indiana University School of Medicine. 1. Gerar Ratos com genótipos Corrigir <ol><li> Estabelecer um modelo de mouse CBCs. Companheiro camundongos K14-Creer (Jackson laboratório estoque número 005107) com R26-SmoM2 camundongos YFP (Jackson laboratório estoque número 005.130) (18) para gerar K14-creer + e R26-SmoM2 YFP + camundongos. </li><li> Realizar genotipagem. Imergir cauda espécimes (0.5 cm de comprimento) em solução de lise directPCR cauda com 1 mg / ml de proteinase K a 55 ° C durante a noite com agitação. No dia seguinte, remover os detritos do tecido por meio de centrifugação à velocidade máxima numa micro-centrifuga (para manter o sobrenadante para determinação do genótipo). Use 1 ul do sobrenadante de cada reacção de PCR com os iniciadores e as condições recomendadas pelo fornecedor. Selecione os ratos com os genótipos direita (na idade de 3-6 semanas, a buprenorfina em 0,05-0,1 mg / kg serão aplicados via SQ cada 8-12 horas por 2-3 dias depois de cauda snip) for passo 2. </li></ol> 2. Induzem a expressão de queratinócitos da pele em SmoM2 Induzir SmoM2 expressão em queratinócitos por administração oral de tamoxifeno (5 ug / kg de peso corporal em 50 ml de óleo vegetal em cada mamada) durante 5 dias consecutivos por meio de sonda oral com uma agulha de alimentação (curva de calibre 20). 3. Preparando-se amostras de pele Em geral, os fenótipos são mais graves na orelha e da cauda em ratinhos K14creER/R26SmoM2 GFP. Para se preparar para análises celulares, primeiro colher a pele do rato após o sacrifício animal com um procedimento aprovado institucional (CO 2 mais deslocamento cervical). 4. Isolando Epiderme <ol><li> Depois de camundongos sacrifício com um procedimento aprovado (ver passo 3), retire pele usando um aparador. Amostras de pele imerso em solução de dispase (5 mg / mL em DMEM com FBS a 10%) a 37 ° C durante 1-2 horas (1 hora para ratinhos menos de 8 semanas de idade e 2 hrem ratinhos de 8 semanas de idade). </li><li> Após o tratamento com dispase, a epiderme separada da derme por meio de fórceps. </li></ol> 5. Gerar células individuais <ol><li> Para a obtenção de população celular única, tritura a epiderme com a tesoura e em seguida imerso em solução de colagenase IV (1 mg / mL em DMEM com FBS a 10%) durante 1-2 horas a 37 ° C em um tubo de 50 ml. Tente rode suavemente os tubos a cada 20 minutos para ajudar a dissociação celular. </li><li> Inspecione dissociação celular sob microscópio. Quando as células individuais podem ser detectados no meio de colagenase, incubar a amostra durante um adicional de 30 minutos para aumentar o rendimento das células. Em geral, a epiderme de um ratinho pode produzir até 10 7 células. </li><li> Filtrar a mistura de tecidos através de filtro de células (tamanho dos poros de 70 mm), as células de spin para baixo a 1.500 rpm via bancada centrifugação, e lavar uma vez o tempo com PBS. </li></ol> 6. Células rótulo e realizar análises Citometria de Fluxo <ol><li> Ressuspender as células em 10% de FBSem PBS a 2,5 x 10 6 células / ml para bloquear a ligação não específica (em gelo durante 30 min) </li><li> Tomar uma aliquota de células para cada um dos microtubos de 1,5 ml para a rotulagem de anticorpos específicos. Adicionar anticorpos diferentes para cada tubo para uma concentração final de 2 ug / ml. Misturar as células com anticorpos através de um vértice suave durante vários segundos e deixar em gelo durante 30 minutos, depois lava-se com 1 ml de PBS. Para amostras de CBC, foram utilizados os seguintes anticorpos para biomarcadores: CD11b-PE mais Gr1-APC (células mielóides ou células supressoras derivadas de mielóide), vimentina-FITC (fibroblastos) (ver reagentes para detalhes). </li><li> Para a coloração intracelular, usamos um kit e siga o manual do fornecedor (ver Reagentes para detalhes). Usamos as células frescas de analisar marcadores de superfície celular. Após a coloração do marcador de superfície, lavar as células e ressuspender-los em PBS. Adicionar DAPI à mistura de células, a uma concentração final de 1 ug / ml. DAPI vai manchar as células mortas, que será fechado a partir de análises posteriores. </li><li> Analisar os dados com especificaçõessoftware c. Primeiro, escolha uma única célula com base na FSC vs SSC enredo e usar DAPI populacional negativo (células vivas), para posterior análise. </li></ol>

<ol>
	<li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States.">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li><li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas:+attack+of+the+hedgehog.">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li><li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications.">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li><li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+homolog+of+patched,+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome.">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities.">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome.">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma.">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system.">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li><li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li><li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1.">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2:+deletion+of+an+NH(2)-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype.">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+PTCH,+SMOH,+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li><li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval,+but+questions+remain+for+wider+potential.">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li><li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma.">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li><li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome.">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li><li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice.">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).</li><li>Pazzaglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+patched-associated+susceptibility+to+radiation+induced+tumorigenesis+by+genetic+background.">Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background.</a> Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).</li><li>Athar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+smoothened+signaling+prevents+ultraviolet+B-induced+basal+cell+carcinomas+through+regulation+of+Fas+expression+and+apoptosis.">Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis.</a> Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).</li><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinoma+and+its+development:+insights+from+radiation-induced+tumors+in+Ptch1-deficient+mice.">Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice.</a> Cancer Res. 64, 934-941 (2004).</li><li>Ellis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patched+1+conditional+null+allele+in+mice.">Patched 1 conditional null allele in mice.</a> Genesis. 36, 158-161 (2003).</li><li>Mao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+somatic+mouse+model+to+survey+tumorigenic+potential+applied+to+the+Hedgehog+pathway.">A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway.</a> Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).</li><li>Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1(+/-)+mice.">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li><li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations.">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li><li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes.">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li><li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma.">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li><li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model:+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression.">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).</li><li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes.">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos um método para a análise da população de células em CBCs. Tecidos tumorais são consistentes de muitos tipos de células, e cada tipo de célula comporta-se de forma diferente a um determinado momento da carcinogénese, o qual é muito difícil de recuperar, mesmo sob as melhores condições in vitro. Usando este protocolo, que mostrou que o desenvolvimento do carcinoma basocelular é acompanhado pela expansão das células-tronco epidérmicas, bem como o recrutamento de células mielóides. Em comparação com a imuno-histoquímica ou análises de imunofluorescência, análise da população de células apresentam uma avaliação quantitativa das alterações mais populações de células uma vez que os anticorpos específicos para uma variedade de tipos de células estão agora disponíveis. Para este protocolo, são necessárias 10 semanas para completar o estudo porque a mudança fenotípica da indução de genes requer tempo. Assim, é importante para planejar o experimento antes do tempo. Para o isolamento e análise de células, podem ser necessários dois dias inteiros. Como as células vivas são usadas para analyses, é importante para reservar um FACSCalibur antes do tempo. Temos também listado problemas comuns quando se trabalha com este protocolo (ver abaixo). Em nossa experiência, a seguir são problemas comuns que encontramos: <ol><li> Separação da epiderme Pobre: ​​Isto pode ser causado por tratamento com dispase incompleta (por favor, aumentar o tempo de tratamento diapase) ou solução de dispase insuficiente (A pele necessita de ser totalmente imerso na solução de dispase). O uso de pelo menos 5 ml de solução de dispase para um rato. O volume pode variar com base no tamanho da pele. </li><li> Baixo rendimento do número de células: Isto pode, devido à digestão incompleta com colagenase IV. Por favor, primeira concentração de colagenase cheque ou data de validade. Isto também pode ser causada por uma quantidade insuficiente de epiderme utilizado. Além disso, a digestão enzimática deve ser realizada a até 37 ° C com agitação (por favor, ajustar a temperatura antes de realizar a digestão). </li><li> Aglomerados de células: Isso é muito comum para as células da pele (células de pipetaalgumas vezes, depois de passar pelo filtro (antes da centrifugação), ou a existência de Mg 2 + e Ca 2 + em solução (utilize o Mg 2 + e Ca 2 + livre de PBS por lavagem celular). </li><li> Muitas células mortas: Este pode ser um resultado de tecidos degradados (por favor, use tecidos frescos), ou over-digestão (evitar incubação prolongada com dispase e colagenase IV). </li></ol> Este protocolo pode ser combinado com o transplante de medula óssea ou transplante de tecidos para examinar a célula de origem. Por exemplo, o transplante de células que expressam a GFP de medula óssea em ratinhos letalmente irradiados irá permitir-nos a examinar a contribuição das células da medula óssea para os fibroblastos associados a tumores e células mielóides. Da mesma forma, os tumores da pele podem ser transplantadas para um novo hospedeiro rato para examinar interacções tumor-hospedeiro. Além de examinar as mudanças população de células durante a carcinogênese, este protocolo também permitirá aos investigadores examinarEfeitos do tratamento com drogas para as células no ambiente tumoral. Embora este protocolo foi projetado para usar para análises população de células da pele durante a carcinogênese e pequenas modificações podem ser feitas para outros tipos de câncer. Em resumo, as análises da população de células em modelos de ratos de câncer de pele pode dar-nos as mudanças dinâmicas celulares durante a carcinogênese, levando a uma melhor compreensão da biologia celular na transformação neoplásica e diferentes eventos celulares no processo de transformação.

Como o tipo mais comum de câncer humano, carcinoma basocelular (CBC) afeta cerca de 2 milhões de americanos por ano 1. Evidências indicam que a ativação anormal de hedgehog (hh) de sinalização é a força motriz subjacente desenvolvimento BCC (Avaliado em 2,3). Alterações de sinalização Hh em CBCs incluem mutações inativadoras de PTCH1 4-6, mutações de função ganho de SMO 7-9 e expressão aberrante de Hh via fatores de transcrição Gli1 10 e Gli2 11 ou raras mutações inativados do Su regulador negativo (Fu ) 12. Através de todos estes e outros estudos, a Federal Drug Administration (FDA) aprovou recentemente o uso de inibidor de sinalização Hh Vismodegib para tratar localmente avançado e metastático CBCs 13-15. Apesar de todas essas conquistas de 16, nós ainda não entendemos os mecanismos celulares e moleculares pelos quais Hh sinalização dirige carcinogenesis. Estabelecer modelos animais usando a ativação de tecidos específicos de sinalização Hh ainda é importante para os estudos e para a nossa compreensão da resistência às drogas. Em ratos, camundongos selvagens não desenvolvem CBCs, mesmo sob altas doses de substâncias cancerígenas, a radiação UV ou ionizante. Em contraste, Ptch1 + / - murganhos são susceptíveis ao desenvolvimento de BCC 17,18. A penetrância de desenvolvimento BCC em Ptch1 + / - ratos é superior a 50%, embora Ptch1 18,19 + / - camundongos raramente desenvolvem CBCs adultas se mantido em condições normais. Devido à letalidade embrionária de Ptch1 - / -, ko específica de tecido de PTCH1 é geralmente utilizada para o estudo de 20. Além disso, condicional expressão específica de pele de oncogênico SmoM2 YFP (KRT14-creer: R26-SmoM2 YFP ou KRT14-cre: R26-SmoM2 YFP) leva à formação de múltiplos CBCs microscópicas em uma idade muito precoce, proporcionando uma análise genética fácil para hh sinalização fazerwnstream de SMO 21. Há três questões importantes em nosso conhecimento da biologia BCC. Primeiro, a origem celular dos CBCs não está totalmente claro. Embora alguns estudos suportam a ceder do folículo de cabelo como o local de célula estaminal 22-24, Youssef et al. 25 localizada na célula de origem murina de tumores cutâneos Hh orientadas para a epiderme na região inter-folicular, e não no folículo piloso , utilizando Cre específica de células para activar a expressão de um Rosa26 orientada transgénico mutante SMO. Em segundo lugar, as interacções celulares durante o desenvolvimento BCC não são bem compreendidos. Sabe-se que os queratinócitos activada com Hh sinalização podem levar à formação de BCC, mas outras alterações celulares não são bem compreendidos. Além disso, o tratamento de antagonistas de Smo em ratinhos pode conduzir a resistência aos fármacos 26-28. São bastante necessárias, assim, novos alvos para BCC. Entender essas três questões requer análises de alterações celulares em camundongos durante carcinogenesis. Embora vários métodos têm sido publicados para a cultura de queratinócitos, citometria de fluxo e isolamento de células-tronco da pele 29-31, atualmente não há procedimentos completos para análise de células em CBCs do mouse. Através da combinação de métodos para o modelo do rato de CBCs, a separação da epiderme, a geração de células isoladas do tecido e análises celulares, vamos proporcionar aos leitores um conjunto de procedimentos para estudar a sinalização celular, celular e interações moleculares durante o desenvolvimento do BCC. Nós acreditamos que este protocolo vai permitir que os leitores para ver como cada procedimento é realizado. Além disso, nós fornecemos alguns dados para ilustrar o que o resultado deve ser semelhante, e solução de problemas para ajudar os leitores a superar as dificuldades durante a realização desses procedimentos.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

cell population analyses during skin carcinogenesis

O cancro é o desenvolvimento de um processo de múltiplas etapas, envolvendo vários tipos de células, incluindo células cancerosas precursoras, células imunes, fibroblastos e células endoteliais. Cada tipo de células sofre de sinalização e alterações funcionais durante a carcinogénese. O desafio atual para muitos pesquisadores de câncer é dissecar essas mudanças em cada tipo de célula durante o processo de várias etapas in vivo. Nos últimos anos, os autores desenvolveram um conjunto de procedimentos para isolar populações diferentes de células durante o desenvolvimento do câncer de pele usando K14creER/R26-SmoM2 camundongos YFP. O procedimento é dividido em seis partes: 1) gerar ratos adequados para o estudo (K14creER + e R26-SmoM2 YFP + camundongos neste protocolo), 2) indução SmoM2 expressão YFP na pele do rato, 3) preparando biópsias da pele do rato; 4) isolar epiderme da pele; 5) preparar uma única célula de epiderme; 6) rotulagem populações de células individuais para análise de citometria de fluxo.Geração de número suficiente de ratos com o genótipo direito é o passo limitante neste protocolo, o que pode levar até dois meses. O restante das etapas demorar algumas horas até alguns dias. Dentro deste protocolo, que também incluem uma seção para solucionar problemas. Apesar de se concentrar sobre o câncer de pele, este protocolo pode ser modificado para se candidatar a outros modelos animais de doenças humanas.

Sabe-se que os ratos que não desenvolvem carcinomas basocelulares, excepto com a activação de sinalização Hh. Figura 1 mostra o fenótipo da pele após indução da expressão oncogénica smoothened, SmoM2 YFP. Figura 2 mostra a análise de células mielóides em ratinhos normais e portadores de tumor. Células CD11b + Gr1 + são derivadas de células mielóides, e alguns deles estão mielóide células supressoras derivadas. Em situação normal, o CD11b + Gr1 + população de células é dificilmente detectável, mas vai aumentar em resposta a inflamação ou o desenvolvimento do tumor. Nós mostramos que a expressão induzida de SmoM2YFP na pele resulta num aumento nas células CD11b + Gr1 +. Atualmente, os mecanismos moleculares subjacentes a esta mudança na CBCs não são claras. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Figura 1. Morphological alterações após a indução SmoM2YFP na pele do rato. parte superior mostra um diagrama de genótipos do mouse. O painel do meio: a + K14creER e R26-SmoM2 YFP + ratinho tratado com tamoxifeno mostraram grosseiramente anormalidade na pele (à direita), bem como tumores de pele na secção H &amp; E (esquerda). O painel inferior: o mouse sem indução SmoM2YFP mostrou pele com aspecto normal (à direita) e sem alterações morfológicas na secção H &amp; E (esquerda). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Figura 2. Análise de fluxo de células CD11b + Gr1 +. Para examinar a mudança de células CD11b + Gr1 + durante o desenvolvimento do câncer de pele, foram isoladas células individuais e coradas com anticorpos marcados com fluorescência para CD11b e Gr1. Após a análise com FlowJo, notamos um aumento desta população de células em tecidos da pele de ratos tratadas com tamoxifeno.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis at JoVE.com

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Carcinogênese é um processo que envolve as interações entre células cancerosas e microambiente do câncer. Para dissecar os eventos moleculares, é necessário para isolar populações de células diferentes em diferentes estágios durante o desenvolvimento do cancro. Usando um modelo de rato para o carcinoma basocelular, nós descrevemos um protocolo para análises celulares durante a carcinogênese.

Análises população de células da pele Durante Carcinogênese

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

cell-population-analyses-during-skin-carcinogenesis

Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K visualizações.  Indiana University. Carcinogênese é um processo que envolve as interações entre células cancerosas e microambiente do câncer. Para dissecar os eventos moleculares, é necessário para isolar populações de células diferentes em diferentes estágios durante o desenvolvimento do cancro. Usando um modelo de rato para o carcinoma basocelular, nós descrevemos um protocolo para análises celulares durante a carcinogênese.

Vídeo: Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Medicina

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Renal Capsule xeno e subcutânea Pellet Implantação de Avaliação de próstata Carcinogênese e hiperplasia benigna da próstata

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Secas Coleta de Sangue Mancha de Biomarcadores de saúde para maximizar a participação em Estudos Populacionais

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murino Endoscopia para<em&gt; In Vivo</em&gt; Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Um modelo de pele Rato Fetal de reparação de feridas Scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and unrelieved pressure due to immobility. Animal models have been developed that attempt to mimic these conditions for the purpose of furthering our understanding of the complexity of chronic wounds. The model described herein is a rat ischemic skin flap model that permits a prolonged reduction of blood flow resulting in wounds that become ischemic and resemble a chronic wound phenotype (reduced vascularization, increased inflammation and delayed wound closure). It consists of a bipedicled dorsal flap with 2 ischemic wounds placed centrally and 2 non-ischemic wounds lateral to the flap as controls. A novel addition to this ischemic skin flap model is the placement of a silicone sheet beneath the flap that functions as a barrier and a splint to prevent revascularization and reduce contraction as the wounds heal. Despite the debate of using rats for wound healing studies due to their quite distinct anatomic and physiologic differences compared to humans (i.e., the presence of a panniculus carnosus muscle, short life-span, increased number of hair follicles, and their ability to heal infected wounds) the modifications employed in this model make it a valuable alternative to previously developed ischemic skin flap models.

The rat, due to its size, availability, and rather docile behavior, has been utilized as a research model for many years. The goal of this protocol is to utilize the rat as an ischemic skin wound healing model to provide valuable insight into the pathophysiology of chronic wounds.

Demonstração da Wound modelo de pele de rato Isquêmico

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

Um Método de Trigonometria Modelagem da Variação Sazonal demonstrado com esclerose múltipla Relapse Dados

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

A desnervação cirúrgica cutânea: um método para testar o requisito para os nervos no mouse modelos de doença de pele

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...