Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer (R01-R01-94160 y 155086), IU Centro Oncológico Simon Wells y Centro de Investigación Pediátrica.

Este estudio ha sido aprobado por el Comité IACUC en la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana. 1. Generar ratones con genotipos correctos <ol><li> Establecer un modelo de ratón de las CEBs. Mate K14-créer ratones (Jackson laboratorio stock número 005107) con R26-SmoM2 YFP ratones (Jackson laboratorio stock número 005130) (18) para generar K14-CREER + y R26-SmoM2 YFP + ratones. </li><li> Realizar genotipado. Sumergir la cola muestras (0,5 cm de largo) en directPCR solución de lisis de la cola con 1 mg / ml de proteinasa K a 55 ° C durante la noche con agitación. El día siguiente, eliminar los restos de tejido por centrifugación a velocidad máxima en una microcentrífuga (para mantener el sobrenadante para la determinación del genotipo). Usar 1 l del sobrenadante para cada reacción de PCR con los cebadores y las condiciones recomendadas por el proveedor. Seleccione los ratones con los genotipos derecha (a la edad de 3-6 semanas, la buprenorfina en 0,05-0,1 mg / kg se aplicará a través ² cada 8-12 horas durante 2-3 días después de la cola snip) FOr paso 2. </li></ol> 2. Inducir la expresión de SmoM2 en queratinocitos de la piel Inducir SmoM2 expresión en los queratinocitos por la administración oral de tamoxifeno (5 mg / kg de peso corporal en 50 ml de aceite vegetal en cada comida) durante 5 días consecutivos a través de una sonda oral con una aguja de alimentación (curvada de calibre 20). 3. Preparación de muestras de piel En general, los fenotipos son más graves en la oreja y la cola en K14creER/R26SmoM2 GFP ratones. Para prepararse para el análisis de células, lo primero que cosechamos la piel del ratón tras el sacrificio de animales con un procedimiento institucional aprobado (CO 2 más dislocación cervical). 4. Aislar Epidermis <ol><li> Después de ratones sacrificio con un procedimiento aprobado (ver paso 3), retire la piel utilizando un condensador de ajuste. Muestras de piel Sumergir en solución de dispasa (5 mg / ml en DMEM con 10% de FBS) a 37 ° C durante 1-2 horas (1 hora para los ratones de menos de 8 semanas de edad y 2 hrpara los ratones viejos de 8 semanas). </li><li> Después del tratamiento con dispasa, la epidermis separada de la dermis por el fórceps. </li></ol> 5. Generar células individuales <ol><li> Para obtener la población de células única, carne picada epidermis por las tijeras y luego sumergir en solución de colagenasa IV (1 mg / ml en DMEM con 10% de FBS) durante 1-2 horas a 37 ° C en un tubo de 50 ml. Pruebe a girar suavemente los tubos cada 20 minutos para ayudar a la disociación celular. </li><li> Inspeccionar disociación celular bajo el microscopio. Cuando las células individuales se pueden detectar en el medio de la colagenasa, incubar la muestra durante 30 minutos adicionales para aumentar el rendimiento celular. En general, la epidermis de un ratón puede producir hasta 10 7 células. </li><li> Se filtra la mezcla de tejido a través de células colador (tamaño de poro de 70 micras), las células dejen de girar a 1.500 rpm a través de sobremesa centrifugación y lavar una vez el tiempo con PBS. </li></ol> 6. Las células Label y llevar a cabo análisis de citometría de flujo <ol><li> Resuspender las células en 10% de FBSen PBS a 2,5 x 10 6 células / ml para bloquear la unión no específica (en hielo durante 30 min) </li><li> Tomar una alícuota de células a cada uno de microtubos de 1,5 ml para el etiquetado de anticuerpo específico. Añadir diferentes anticuerpos a cada tubo a una concentración final de 2 mg / ml. Mezclar anticuerpos con células a través de un vértice suave durante varios segundos y dejar en hielo durante 30 min, a continuación se lava con 1 ml de PBS. Para las muestras de BCC, se utilizaron los siguientes anticuerpos para los biomarcadores: CD11b-PE plus Gr1-APC (células mieloides o células supresoras de origen mieloide), vimentina-FITC (fibroblastos) (ver reactivos para más detalles). </li><li> Para la tinción intracelular, se utiliza un kit y seguir el manual del fabricante (ver Reactivos para más detalles). Utilizamos células frescas para analizar marcadores de superficie celular. Después de la tinción marcador de superficie, lavar las células, y los resuspender en PBS. Añadir DAPI a la mezcla de células a una concentración final de 1 mg / ml. DAPI se mancha las células muertas que será cerrada a partir de nuevos análisis. </li><li> Analizar los datos con especificacionessoftware c. En primer lugar, seleccionamos las células individuales en base a la FSC frente a SSC trama, y ​​el uso de población negativa DAPI (células vivas) para su posterior análisis. </li></ol>

<ol>
	<li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States.">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li><li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas:+attack+of+the+hedgehog.">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li><li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications.">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li><li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+homolog+of+patched,+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome.">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities.">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome.">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma.">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system.">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li><li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li><li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1.">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li><li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval,+but+questions+remain+for+wider+potential.">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li><li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma.">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li><li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome.">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li><li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice.">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. 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Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1(+/-)+mice.">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li><li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations.">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li><li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes.">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li><li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma.">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li><li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model:+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression.">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).</li><li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes.">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hemos descrito un método para el análisis de población de células en los CCB. Los tejidos tumorales son consistentes de muchos tipos de células, y cada tipo de célula se comporta de manera diferente en un momento dado de la carcinogénesis, que es muy difícil de recuperar incluso en las mejores condiciones in vitro. El uso de este protocolo, se puso de manifiesto que el desarrollo de carcinoma de células basales es acompañada por la expansión de las células madre epidérmicas, así como el reclutamiento de células mieloides. En comparación con los análisis de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia, análisis de la población de células dan una evaluación más cuantitativa de los cambios en la población de células ya que los anticuerpos específicos para una variedad de tipos de células están ahora disponibles. En este protocolo, se necesitan 10 semanas para completar el estudio porque el cambio fenotípico de la inducción de genes requiere tiempo. Por lo tanto, es importante para planificar el experimento antes de tiempo. Para el aislamiento de células y análisis, pueden ser necesarias dos días enteros. Dado que las células vivas se utilizan para analysES, es importante reservar un FACSCalibur antes de tiempo. También hemos hecho una lista de los problemas más comunes cuando se trabaja con este protocolo (véase más adelante). En nuestra experiencia, a continuación son los problemas comunes que nos encontramos: <ol><li> Malo separación de la epidermis: Esto puede ser causado por el tratamiento dispasa incompleta (Por favor, aumentar el tiempo de tratamiento diapase) o una solución de dispasa insuficiente (La piel necesita ser totalmente sumergido en una solución de dispasa). Utilizamos por lo menos 5 ml de solución de dispasa para un ratón. El volumen puede variar en función del tamaño de la piel. </li><li> Bajo rendimiento del número de células: Puede ocurrir debido a la digestión incompleta con colagenasa IV. Por primera concentración de colagenasa cheque o fecha de caducidad. Esto también puede ser causada por la cantidad insuficiente de la epidermis utilizado. Además, digestión con enzimas se debe realizar a a 37 ° C con agitación (por favor, ajuste de temperatura antes de realizar la digestión). </li><li> Grupos celulares: Esto es muy común para las células de la piel (células de pipetaun par de veces después de pasar a través del filtro (antes de la centrifugación), o la existencia de Mg 2 + y Ca 2 + en la solución (por favor, utilice Mg 2 + y Ca 2 + libre de PBS para lavado de células). </li><li> Demasiados células muertas: Esto puede ser el resultado de los tejidos degradados (por favor utilice tejidos frescos), o sobre-digestión (evitar la incubación prolongada con dispasa y colagenasa IV). </li></ol> Este protocolo se puede combinar con el trasplante de médula ósea o trasplante de tejido para examinar el origen de célula. Por ejemplo, el trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresan las células de médula ósea en ratones irradiados letalmente nos permitirá examinar la contribución de las células de la médula ósea de los fibroblastos asociados al tumor y las células mieloides. Del mismo modo, los tumores de la piel pueden ser trasplantados a un nuevo huésped ratón para examinar las interacciones tumor-huésped. Además de examinar los cambios en la población de células durante la carcinogénesis, este protocolo también permitirá a los investigadores examinarefectos de los tratamientos con fármacos a las células en el ambiente del tumor. Aunque este protocolo está diseñado para utilizar para el análisis de la población de células durante la carcinogénesis de piel, ligeras modificaciones se pueden hacer para otros tipos de cáncer. En resumen, el análisis de la población de células en modelos de ratón de cáncer de piel nos pueden dar los cambios dinámicos durante la carcinogénesis celulares, lo que lleva a una mejor comprensión de la biología celular en la transformación neoplásica y diferentes eventos celulares en el proceso de transformación.

Como el tipo más común de cáncer humano, carcinoma de células basales (BCC) afecta a unos 2 millones de estadounidenses al año 1. La evidencia acumulada indica que la activación anormal de hedgehog (Hh) de señalización es la fuerza motriz que subyace el desarrollo BCC (Revisado en 2,3). Alteraciones de la señalización Hh en CBC incluyen inactivación de las mutaciones de PTCH1 4-6, mutaciones con ganancia de función de SMO 7-9, y la expresión aberrante de la vía Hh factores de transcripción Gli1 10 y GLI2 11 o mutaciones inactivadas raros de regulador negativo Do (Fu ) 12. A través de todos estos y otros estudios, la Administración Federal de Drogas (FDA) ha aprobado recientemente el uso de señalización Hh inhibidor Vismodegib para tratar metastásico y localmente avanzado CB 13-15. A pesar de todos estos logros 16, todavía no entendemos los mecanismos moleculares y celulares mediante los cuales la señalización Hh impulsa carcinogenesis. El establecimiento de modelos animales que utilizan la activación específica de tejido de señalización Hh sigue siendo importante para estos estudios y para nuestra comprensión de la resistencia a los medicamentos. En los ratones, los ratones de tipo salvaje no se desarrollan las CEBs, incluso bajo fuertes dosis de carcinógenos, la radiación ultravioleta o ionizante. En contraste, Ptch1 + / - ratones son susceptibles al desarrollo BCC 17,18. La penetrancia de desarrollo BCC en Ptch1 + / - ratones es más de 50%, aunque Ptch1 18,19 + / - ratones rara vez se desarrollan los CCB crecidos si se mantienen en condiciones normales. Debido a la letalidad embrionaria de Ptch1 - / -, nocaut específica de tejido de PTCH1 se utiliza generalmente para el estudio 20. Además, la expresión condicional específico para la piel de oncogénico SmoM2 YFP (KRT14-Creer: R26-SmoM2 YFP o KRT14-cre: R26-SmoM2 YFP) conduce a la formación de múltiples CCB microscópicas a una edad muy temprana, proporcionando un análisis genético fácil para señalización Hh hacerwnstream de SMO 21. Hay tres cuestiones importantes en nuestro conocimiento de la biología del BCC. En primer lugar, el origen celular de los CCB no está del todo claro. Mientras que algunos estudios apoyan la bullir de folículo piloso como el sitio de células madre 22-24, Youssef y col. 25 localiza el celular murina de origen de los tumores cutáneos Hh-impulsados ​​a estar en la región de la epidermis inter-folicular, no en el folículo piloso , mediante el uso de Cre específico de las células para activar la expresión de un ROSA26 impulsada transgénico mutante SMO. En segundo lugar, las interacciones celulares durante el desarrollo BCC no se entienden bien. Se sabe que los queratinocitos activados con Hh señalización puede conducir a la formación de las CEBs, pero otros cambios celulares no están bien entendidas. Además, el tratamiento de los antagonistas de Smo en ratones puede provocar resistencia al medicamento 26-28. Son muy necesarios nuevos objetivos tanto para BCC. La comprensión de estas tres cuestiones requiere un análisis de los cambios celulares en ratones durante carcinogENESIS. Mientras varios métodos han sido publicados para cultivo de queratinocitos, citometría de flujo y la piel de aislamiento de células del tallo 29-31, actualmente no hay procedimientos integrales para los análisis de células en los CCB ratón. Mediante la combinación de métodos para el modelo de ratón de los CCB, la separación de la epidermis, la generación de células individuales a partir de tejido y análisis de células, vamos a ofrecer a los lectores con un conjunto de procedimientos para estudiar la señalización celular, celular y de las interacciones moleculares durante el desarrollo BCC. Creemos que este protocolo permitirá a los lectores a ver cómo se lleva a cabo cada procedimiento. Además, proporcionamos algunos datos para ilustrar lo que los resultados deben ser similar, y solución de problemas para ayudar a los lectores a superar las dificultades en la realización de estos procedimientos.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
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cell population analyses during skin carcinogenesis

El desarrollo del cáncer es un proceso de múltiples etapas que implica muchos tipos celulares, incluyendo células precursoras de cáncer, las células inmunes, fibroblastos y células endoteliales. Cada tipo de células se somete a cambios de señalización y funcionales durante la carcinogénesis. El desafío actual de muchos investigadores del cáncer es diseccionar estos cambios en cada tipo de célula durante el proceso de múltiples pasos in vivo. En los últimos años, los autores han desarrollado un conjunto de procedimientos para aislar diferentes poblaciones de células durante el desarrollo del cáncer de piel con K14creER/R26-SmoM2 YFP ratones. El procedimiento se divide en 6 partes: 1) la generación de ratones apropiados para el estudio (K14creER + y R26-SmoM2 YFP + ratones de este protocolo), 2) que induce SmoM2 YFP expresión en la piel del ratón, y 3) la preparación de las biopsias de piel de ratón, y 4) el aislamiento epidermis de la piel; 5) la preparación de las células individuales de la epidermis; 6) marcar poblaciones de células individuales para el análisis de citometría de flujo.Generación de un número suficiente de ratones con el genotipo adecuado es el paso limitante en este protocolo, que puede tardar hasta dos meses. El resto de pasos tomar unas pocas horas hasta varios días. Dentro de este protocolo, también incluimos una sección de solución de problemas. Aunque nos centramos en el cáncer de piel, este protocolo puede ser modificado para solicitar otros modelos animales de enfermedades humanas.

Se sabe que los ratones no desarrollan carcinomas de células basales, excepto con la activación de la señalización Hh. Figura 1 muestra el fenotipo de la piel después de la expresión inducida de oncogénico smoothened, SmoM2 YFP. Figura 2 muestra el análisis de las células mieloides en ratones normales y portadores de tumores. Células CD11b + Gr1 + se derivan de las células mieloides, y algunos de ellos son células mieloides supresoras derivadas. En situación normal, el CD11b + Gr1 + población de células es difícilmente detectable, pero aumentará en respuesta a la inflamación o el desarrollo de tumores. Hemos demostrado que la expresión inducida de SmoM2YFP en los resultados de la piel en un aumento en las células CD11b + Gr1 +. En la actualidad, los mecanismos moleculares que subyacen a este cambio en los CCB no son claras. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Figura 1. Morphological cambios después de la inducción SmoM2YFP en la piel del ratón. La parte superior muestra un diagrama de los genotipos del ratón. El panel central: la K14creER + y R26-SmoM2 YFP + ratón tratado con tamoxifeno mostró sumamente anormalidad en la piel (a la derecha), así como los tumores de piel en la sección H &amp; E (izquierda). El panel inferior: el ratón sin SmoM2YFP inducción mostró la piel de aspecto normal (derecha) y sin morfología anormal en la sección H &amp; E (izquierda). <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Figura 2. Análisis de flujo de células CD11b + Gr1 +. Para examinar el cambio de las células CD11b + Gr1 + durante el desarrollo del cáncer de piel, que aísla las células individuales y se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia a CD11b y Gr1. Tras el análisis de FlowJo, notamos un aumento de esta población de células en los tejidos de la piel de los ratones tratados con tamoxifeno.

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Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

La carcinogénesis es un proceso que implica interacciones entre las células cancerosas y el microambiente del cáncer. Para diseccionar los eventos moleculares, uno necesita para aislar poblaciones de células diferentes en diferentes etapas durante el desarrollo del cáncer. Utilizando un modelo de ratón para el carcinoma de células basales, se describe un protocolo para el análisis de células durante la carcinogénesis.

Los análisis de población celular durante la carcinogénesis de piel

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K vistas.  Indiana University. La carcinogénesis es un proceso que implica interacciones entre las células cancerosas y el microambiente del cáncer. Para diseccionar los eventos moleculares, uno necesita para aislar poblaciones de células diferentes en diferentes etapas durante el desarrollo del cáncer. Utilizando un modelo de ratón para el carcinoma de células basales, se describe un protocolo para el análisis de células durante la carcinogénesis.

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Investigación

Medicina

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Renal Cápsula xenotrasplante y subcutánea Pellet Implantación para la Evaluación de la próstata Carcinogénesis y la hiperplasia prostática benigna

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Sangre Seca Colección de Biomarcadores de salud para maximizar la participación en estudios de población

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murino Endoscopia para<em&gt; En Vivo</em&gt; Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Un ratón fetal Modelo de la piel de la reparación de heridas sin cicatrices

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

Un método de trigonométricas Modelización de Variación Estacional demostrada con Esclerosis Múltiple La recaída de datos

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

La denervación quirúrgica cutánea: Un método para probar el requisito de nervios en el ratón modelos de enfermedad de la piel

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Assessment of Child Anthropometry in a Large Epidemiologic Study

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to understand health effects of child growth and adiposity. Gold standard methods of measuring adiposity, such as dual X-ray absorptiometry (DXA), may not be feasible in large field studies. Research staff can, however, complete anthropometric measurements, such as body circumferences and skinfold measurements, using inexpensive portable equipment. In this protocol we detail how to obtain manual anthropometric measurements from children, including standing and sitting height, weight, waist circumference, hip circumference, mid-upper arm circumference, triceps skinfold thickness, and subscapular skinfold thickness, and procedures to assess the quality of these measurements. To demonstrate accuracy of these measurements, among 1,110 school-aged children in the pre-birth cohort Project Viva we calculated Spearman correlation coefficients comparing manual anthropometric measurements with a gold standard measure of body fat, DXA fat mass1. To address reliability, we evaluate intra-rater technical error of measurement at a quality control session conducted on adult female volunteers.

In epidemiologic studies of children, well-trained research staff can accurately and precisely assess weight, height, sitting height, skinfold thicknesses, and body circumferences.

Evaluación de la antropometría del niño en un Estudio Epidemiológico grande

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to ...