מחקר זה נתמך על ידי NCI (R01-R01-94,160 ו155,086), מרכז IU סיימון הסרטן ומרכז למחקר רפואת ילדים וולס.

מחקר זה אושר על ידי ועדת IACUC באוניברסיטת אינדיאנה הספר לרפואה. 1. ליצור עכברים עם גנוטיפים נכון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסס מודל עכבר של BCCs. עכברי K14-Mate קואל (ג&#39;קסון המעבדה מספר מניות 005,107) עם R26-SmoM2 עכברי YFP (ג&#39;קסון המעבדה מספר מניות 005,130) (18) ליצירת K14-קואל + ו-R26 SmoM2 YFP + עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע genotyping. לטבול את זנב דגימות (עוד 0.5 ס&quot;מ) בפתרון תמוגה זנב directPCR עם 1 מ&quot;ג / מיליליטר proteinase K על 55 מעלות צלזיוס למשך לילה עם רעד. למחרת, להסיר שאריות רקמה על ידי צנטריפוגה במהירות שיא במייקרו צנטריפוגות (כדי לשמור את supernatant לgenotyping). השתמש μl 1 של supernatant לכל תגובת PCR עם פריימרים ותנאים שהומלצו על ידי הספק. בחר את העכברים עם גנוטיפים הנכונים (בגיל 3-6 שבועות, עצירות ב0.05-0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג ייושם באמצעות SQ כל 8-12 שעות במשך 2-3 ימים לאחר חיתוך זנב) for שלב 2. </li></ol> 2. לגרום ביטוי של SmoM2 בקרטינוציטים עור לגרום SmoM2 ביטוי בקרטינוציטים על ידי מתן פומי של טמוקסיפן (משקל גוף מיקרוגרם / ק&quot;ג 5 ב 50 מיליליטר שמן צמחי בכל האכלה של) במשך 5 ימים רצופים באמצעות gavage האוראלי עם מחט האכלה (מעוקל 20 מד). 3. הכנת דגימות עור באופן כללי, פנוטיפים חמורים יותר על האוזן ואת הזנב בK14creER/R26SmoM2 עכברי ה-GFP. כדי להתכונן לניתוחים סלולריים, אנחנו קוצרים ראשון עור העכבר לאחר הקרבת חיה עם נוהל שאושר מוסדי (CO 2 בתוספת נקע בצוואר רחם). 4. בידוד אפידרמיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקרבת עכברים עם נוהל שאושר (ראה שלב 3), להסיר פרווה באמצעות גוזם. דגימות עור לטבול בפתרון dispase (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DMEM עם 10% FBS) על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות (שעה 1 לעכברים פחות מ 8 שבועות ישנים ושעה 2לעכברים ישנים מ 8 שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בעקבות dispase, האפידרמיס נפרד מהדרמיס על ידי מלקחיים. </li></ol> 5. לייצר תאים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג אוכלוסיית תא בודד, בשר טחון האפידרמיס על ידי מספריים ולאחר מכן לטבול בcollagenase IV פתרון (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMEM עם 10% FBS) עבור 1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בצינור 50 מ&quot;ל. נסה בעדינות מערבולת את הצינורות בכל 20 דקות כדי לעזור להתנערות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק התנערות תא מתחת למיקרוסקופ. כאשר ניתן לאתר תאים בודדים במדיום collagenase, דגירה הדגימה עבור 30 דקות נוספות כדי להגדיל את תשואת התא. באופן כללי, האפידרמיס מעכבר אחד יכול להניב עד 10 7 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את תערובת הרקמות באמצעות מסננת תא (גודל נקבובית 70 מיקרומטר), ספין למטה תאים ב 1500 סל&quot;ד באמצעות צנטריפוגה הספסל העליונה, ולשטוף פעם זמן עם PBS. </li></ol> 6. תאי תווית ולבצע אנליזות זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי FBS 10%PBS ב 2.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל לחסום הלא ספציפי מחייב (על קרח למשך 30 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של תאים לכל אחד מ1.5 microtubes מ&quot;ל לתיוג נוגדן ספציפי. הוסף נוגדנים שונים לכל צינור בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. מערבבים עם תאים באמצעות נוגדני קודקוד עדין במשך כמה שניות ולהשאיר אותם על קרח למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם 1 מיליליטר PBS. לדגימות BCC, השתמשנו בנוגדנים לסמנים הבאים: CD11b-PE בתוספת GR1-APC (תאי מיאלואידית או תאי מדכאי מיאלואידית הנגזרות); vimentin-FITC (פיברובלסטים) (ראה ריאגנטים לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים תאי, אנו משתמשים בערכה ובצעו את הוראות של הספק (ראה ריאגנטים לפרטים נוספים). אנו משתמשים בתאים טריים לנתח סמנים פני תא. לאחר צביעת סמן פני השטח, לשטוף תאים, וresuspend אותם ב-PBS. הוסף DAPI לתערובת התא בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. DAPI יהיה כתם תאים מתים שיהיו מגודר החוצה מניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים ספציפיים עםתוכנת ג. אנחנו ראשון בחרו תאים בודדים המבוססים על FSC לעומת עלילת SSC, ולהשתמש באוכלוסייה שלילית DAPI (תאי חיים) לניתוח נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States.">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li><li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas:+attack+of+the+hedgehog.">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li><li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications.">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li><li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+homolog+of+patched,+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome.">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities.">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome.">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma.">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system.">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li><li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li><li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1.">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2:+deletion+of+an+NH(2)-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype.">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+PTCH,+SMOH,+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li><li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval,+but+questions+remain+for+wider+potential.">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li><li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma.">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li><li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome.">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li><li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice.">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).</li><li>Pazzaglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+patched-associated+susceptibility+to+radiation+induced+tumorigenesis+by+genetic+background.">Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background.</a> Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).</li><li>Athar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+smoothened+signaling+prevents+ultraviolet+B-induced+basal+cell+carcinomas+through+regulation+of+Fas+expression+and+apoptosis.">Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis.</a> Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).</li><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinoma+and+its+development:+insights+from+radiation-induced+tumors+in+Ptch1-deficient+mice.">Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice.</a> Cancer Res. 64, 934-941 (2004).</li><li>Ellis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patched+1+conditional+null+allele+in+mice.">Patched 1 conditional null allele in mice.</a> Genesis. 36, 158-161 (2003).</li><li>Mao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+somatic+mouse+model+to+survey+tumorigenic+potential+applied+to+the+Hedgehog+pathway.">A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway.</a> Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).</li><li>Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1(+/-)+mice.">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li><li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations.">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li><li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes.">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li><li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma.">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li><li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model:+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression.">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).</li><li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes.">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש לנו תאר שיטה לניתוח אוכלוסיית תא בBCCs. רקמות גידול עקביות של סוגי תאים רבים, וכל אחד מסוגי התאים מתנהגים בצורה שונה בכל זמן נתון של הסרטן, וזה מאוד קשה לשחזר אפילו תחת תנאים הטובים ביותר במבחנה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו הראו כי פיתוח של קרצינומה של תאי בסיס מלווה בהתרחבות של תאי גזע אפידרמיס, כמו גם גיוס של תאי מיאלואידית. בהשוואה לאימונוהיסטוכימיה או ניתוחי Immunofluorescent, ניתוחי אוכלוסיית תא לתת הערכה כמותית יותר של שינויי אוכלוסיית תא שכן נוגדנים ספציפיים למגוון רחב של סוגי תאים זמינים כעת. לפרוטוקול זה, 10 שבועות יש צורך להשלים את המחקר, כי שינוי פנוטיפי מאינדוקצית הגן דורש זמן. זה כן חשוב לתכנן את הניסוי לפני זמן. לבידוד תא וניתוחים, שני ימים שלמים עשויים להיות נחוצים. כי תאי חיים משמשים לanalyses, חשוב להזמין FACSCalibur מבעוד מועד. יש לנו גם רשימת בעיות נפוצות בעת עבודה עם פרוטוקול זה (ראה להלן). מניסיוננו, להלן הן בעיות נפוצות שבן נתקלו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרדה לקויה של האפידרמיס: זו עלולה להיגרם על ידי טיפול dispase שלם (בבקשה להאריך את משך הזמן של טיפול diapase) או פתרון dispase מספיק (העור צריך להיות שקוע לגמרי בפתרון dispase). אנו משתמשים בלפחות 5 מ&quot;ל של תמיסת dispase לעכבר אחד. הנפח עשוי להשתנות בהתאם לגודלו של עור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשואה נמוכה של מספר תאים: מאי זה עקב עיכול לא שלם עם collagenase IV. אנא ריכוז collagenase סימון ראשון או תאריך תפוגה. זה יכול להיגרם גם על ידי כמות מספקת של האפידרמיס בשימוש. יתר על כן, יש לבצעו אנזים עיכול בעד 37 ° C עם הרעד (אנא התאם את הטמפרטורה לפני ביצוע עיכול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גושי תאים: זה נפוץ מאוד לתאי עור (תאי פיפטהכמה פעמים אחרי שעובר מסננת (לפני צנטריפוגה), או קיומו של Mg 2 + וCa 2 + בתמיסה (אנא השתמש Mg 2 + וCa 2 + ללא PBS עבור תא לשטוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מתים רבים מדי: זו עשויה להיות תוצאה של רקמות מושפלת (אנא השתמש רקמות טריות), או יתר מערכת העיכול (למנוע דגירה ממושכת עם dispase וcollagenase IV). </li></ol> פרוטוקול זה יכול להיות בשילוב עם השתלת מח עצם או השתלת רקמות כדי לבחון את מקור התא. לדוגמה, השתלה של ה-GFP-לבטא בתאי מח עצם לעכברים מוקרנים קטלני יאפשר לנו לבחון את התרומה של תאים במח עצם לfibroblasts הקשורים גידולים ותאי מיאלואידית. באופן דומה, ניתן להשתיל גידולי עור למארח עכבר חדש לבחון אינטראקציות גידול מארחות. בנוסף לבחינת שינויים באוכלוסיית תאי הסרטן, פרוטוקול זה גם יאפשר לחוקרים לבחוןהשפעות של טיפולים תרופתיים בתאים בסביבת הגידול. למרות שפרוטוקול זה מיועד לשימוש עבור ניתוחי אוכלוסיית תאים בעור שינויים קלים סרטן, יכולים להתבצע על סוגי סרטן אחרים. לסיכום, ניתוחי אוכלוסיית תאים במודלי עכבר של סרטן העור יכולים לתת לנו את השינויים הדינמיים סלולריים בעת היווצרות הסרטן, מה שמובילים להבנה טובה יותר של ביולוגיה של תא בהפיכת גידולים ואירועים סלולריים שונים בתהליך השינוי.

כסוג הנפוץ ביותר של סרטן בבני אדם, קרצינומה של תאי בסיס (BCC) משפיעה על כ -2 מיליון אמריקאים בשנה 1. צבירת ראיות מצביעות על כך שההפעלה תקינה של קיפוד איתות (HH) הוא כוח המניע שבבסיס פיתוח BCC (נבדקו ב2,3). שינויים של Hh איתות בBCCs כוללים מוטציות inactivating של PTCH1 4-6, מוטציות רווח של פונקציה של SMO 7-9, וביטוי חריג של hh גורמי שעתוק מסלול GLI1 10 וGLI2 11 או מומתות מוטציות נדירות של סו רגולטור השלילית (פו &#39;) 12. דרך כל מחקרים אלה ואחרים, פדרלי תרופות אמריקניות (FDA) אישר לאחרונה את השימוש בHh איתות מעכב Vismodegib לטיפול גרורתי ומתקדם מקומי BCCs 13-15. למרות כל ההישגים האלה 16, אנחנו עדיין לא מבינים את מנגנונים המולקולריים ותאיים שבאמצעותו Hh האיתות מניעה קרקinogenesis. הקמת מודלים של בעלי חיים באמצעות הפעלת רקמות ספציפית של Hh איתות עדיין חשובה למחקרים אלה ועל ההבנה של עמידות לתרופות שלנו. בעכברים, wild-type עכברים אינם מפתחים BCCs, גם במינונים גבוהים של קרינת UV או מייננת מסרטנים,. לעומת זאת, Ptch1 + / - עכברים רגישים להתפתחות BCC 17,18. Penetrance של התפתחות BCC בPtch1 + / - עכברים היא מעל 50% 18,19 למרות Ptch1 + / - עכברים לעתים רחוקות לפתח BCCs מגודלים אם כל הזמן בתנאים רגילים. בשל הקטלניות העוברית של Ptch1 - / -, נוקאאוט רקמות ספציפי של PTCH1 משמש בדרך כלל למחקר 20. בנוסף, ביטוי עור ספציפי מותנה שהעור SmoM2 YFP (Krt14-קואל: R26-SmoM2 YFP או Krt14-cre: R26-SmoM2 YFP) מביא להיווצרות של BCCs מיקרוסקופי מרובים בגיל צעיר מאוד, מתן assay גנטי קל לי איתות HH לעשותwnstream של SMO 21. ישנן שלוש סוגיות מרכזיות בידע של הביולוגיה BCC שלנו. ראשית, המקור התאי של BCCs הוא לא לגמרי ברור. בעוד מחקרים מסוימים תומכים לזוז של זקיק שיער כאתר תא גזע 22-24, יוסף ואח&#39;. מקומי 25 תא העכברי המוצא של גידולי HH-מונעים עורית להיות באזור האפידרמיס בין הזקיקים-, לא בזקיק השיער , על ידי שימוש בתא ספציפי Cre להפעיל ביטוי של מהונדס ROSA26 מונע מוטציה SMO. אינטראקציות שנייה, סלולריות במהלך התפתחות BCC אינן מובנהית היטב. זה ידוע כי קרטינוציטים עם Hh הופעל איתות יכולים להוביל להיווצרות של BCCs, אבל שינויים תאיים אחרים לא הבינו היטב. יתר על כן, טיפול בנוגדי SMO בעכברים יכולים להוביל לעמידות לתרופת 26-28. מטרות כך חדשניות לBCC דרושות עד מאוד. הבנה בשלוש סוגיות אלה מחייב ניתוח של שינויים תאיים בעכברים במהלך carcinogenesis. בעוד כמה שיטות שפורסמו לתרבות keratinocyte, cytometry הזרימה ובידוד תאי גזע עור 29-31, כרגע אין נהלים מקיפים לניתוחים סלולריים בBCCs העכבר. על ידי שילוב של שיטות למודל עכבר של BCCs, הפרדה של האפידרמיס, דור של תאים בודדים מרקמות וניתוחים סלולריים, נספק לקוראים עם סט של נהלים ללמוד איתות סלולרי, סלולרית ואינטראקציות מולקולריות במהלך התפתחות BCC. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יאפשר לקוראים לראות איך כל הליך נעשה. בנוסף, סיפקנו כמה נתונים כדי להמחיש מה התוצאות אמורות להיראות, ופתרון בעיות כדי לעזור לקוראים להתגבר על קשיים במהלך ביצוע הליכים אלה.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

cell population analyses during skin carcinogenesis

התפתחות הסרטן היא תהליך רב שלבים הכוללים הרבה סוגי תאים, כולל תאים סרטניים, תאים חיסוניים מבשר, fibroblasts ותאי האנדותל. כל סוג של תאים עובר איתות ופונקציונלית שינויים במהלך היווצרות הסרטן. האתגר הנוכחי לחוקרי סרטן רבים הוא לנתח שינויים אלה בכל אחד מסוגי התאים בתהליך מרובה שלבי in vivo. בשנים האחרונות, החוקרים פיתחו מערכת של נהלים לבודד אוכלוסיות תאים שונים במהלך התפתחות סרטן העור באמצעות K14creER/R26-SmoM2 עכברי YFP. ההליך מחולק 6 חלקים: 1) לייצר עכברים מתאימים למחקר (K14creER + YFP + עכברים בפרוטוקול זה) וR26-SmoM2, 2) ביטוי התרמה SmoM2 YFP בעור עכבר; 3) נערכים ביופסיות עור עכבר; 4) בידוד האפידרמיס מעור; 5) הכנת תאים בודדות מהאפידרמיס; 6) תיוג אוכלוסיות תא בודדות לניתוח cytometry זרימה.הדור של מספר המספיק של עכברים עם גנוטיפ הנכון הוא הצעד המגביל בפרוטוקול זה, אשר עשוי להימשך עד חודשים. שאר צעדים לקחת כמה שעות לכמה ימים. בתוך פרוטוקול זה, אנו כוללים גם סעיף לפתרון בעיות. למרות שאנו נתמקד בסרטן העור, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להגיש בקשה למודלים של בעלי חיים אחרים של מחלות בבני אדם.

זה ידוע כי עכברים אינם מפתחים קרצינומה של תאי הבסיס, אלא בהפעלת איתות Hh. איור 1 מציג את הפנוטיפ העור בעקבות ביטוי מושרה של שהעור החליק, SmoM2 YFP. תרשים 2 מציג ניתוח של תאי מיאלואידית בעכברים נורמלים ונושא גידול. CD11b + + תאי GR1 נגזרים מתאי מיאלואידית, וכמה מהם מיאלואידית תאי מדכאי נגזרים. במצב נורמלי, CD11b + + GR1 אוכלוסיית תא היא כמעט לא מורגש, אך תגדיל בתגובה לדלקת או להתפתחות גידול. אנחנו הראו כי ביטוי מושרה של SmoM2YFP בתוצאות בעור גידול בCD11b + GR1 + תאים. נכון לעכשיו, את המנגנונים המולקולריים שבבסיס שינוי זה בBCCs אינם ברורים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> איור 1. Morphological שינויים לאחר האינדוקציה SmoM2YFP בעור עכבר. העליון מראה תרשים של גנוטיפים עכבר. הפנל התיכון: + K14creER וR26-SmoM2 YFP + העכבר שטופל בטמוקסיפן הראה בעליל חריגות בעור (מימין), כמו גם גידולי עור בחלק H &amp; E (משמאל). הפנל התחתון: העכבר ללא אינדוקציה SmoM2YFP הראה עור רגיל מחפש (מימין) ולא מורפולוגיה חריגה בסעיף H &amp; E (משמאל). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> איור 2. ניתוח תזרים של CD11b + GR1 + תאים. כדי לבחון את השינוי של CD11b + GR1 + תאים במהלך התפתחות סרטן העור, אנחנו מבודדים תאים בודדים ומוכתמים בנוגדני הקרינה שכותרתו ולCD11b GR1. לאחר ניתוח עם FlowJo, הבחנו בעלייה של אוכלוסיית תא זו ברקמות עור מעכברים שטופלו בטמוקסיפן.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis at JoVE.com

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

הסרטן הוא תהליך כרוך אינטראקציות בין תאים סרטניים וmicroenvironment הסרטן. כדי לנתח את האירועים המולקולריים, צריך לבודד את אוכלוסיות תאים שונות בשלבים שונים במהלך התפתחות הסרטן. שימוש במודל עכבר לקרצינומה של תאי בסיס, אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוחי תא במהלך היווצרות הסרטן.

ניתוח אוכלוסיית תאים בעור Carcinogenesis

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

cell-population-analyses-during-skin-carcinogenesis

Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K Views.  Indiana University. הסרטן הוא תהליך כרוך אינטראקציות בין תאים סרטניים וmicroenvironment הסרטן. כדי לנתח את האירועים המולקולריים, צריך לבודד את אוכלוסיות תאים שונות בשלבים שונים במהלך התפתחות הסרטן. שימוש במודל עכבר לקרצינומה של תאי בסיס, אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוחי תא במהלך היווצרות ?...

Video: Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

כליות קפסולת Xenografting ותת עור מכבישי השרשה להערכת הערמונית Carcinogenesis והיפרפלזיה שפירה של הערמונית

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

יבש של אוסף דם ספוט בריאות סמנים למקסם את ההשתתפות בלימודי אוכלוסייה

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

העכברי אנדוסקופיה ל<em&gt; בVivo</em&gt; ריפוי Multimodal הדמיה של היווצרות הסרטן וההערכה של מעיים פצע ודלקת

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

דגם עור עכבר עוברי של תיקון פצע צלקות

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and unrelieved pressure due to immobility. Animal models have been developed that attempt to mimic these conditions for the purpose of furthering our understanding of the complexity of chronic wounds. The model described herein is a rat ischemic skin flap model that permits a prolonged reduction of blood flow resulting in wounds that become ischemic and resemble a chronic wound phenotype (reduced vascularization, increased inflammation and delayed wound closure). It consists of a bipedicled dorsal flap with 2 ischemic wounds placed centrally and 2 non-ischemic wounds lateral to the flap as controls. A novel addition to this ischemic skin flap model is the placement of a silicone sheet beneath the flap that functions as a barrier and a splint to prevent revascularization and reduce contraction as the wounds heal. Despite the debate of using rats for wound healing studies due to their quite distinct anatomic and physiologic differences compared to humans (i.e., the presence of a panniculus carnosus muscle, short life-span, increased number of hair follicles, and their ability to heal infected wounds) the modifications employed in this model make it a valuable alternative to previously developed ischemic skin flap models.

The rat, due to its size, availability, and rather docile behavior, has been utilized as a research model for many years. The goal of this protocol is to utilize the rat as an ischemic skin wound healing model to provide valuable insight into the pathophysiology of chronic wounds.

הפגנה של דגם פצע עור העכברוש איסכמי

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

שיטה של ​​טריגונומטריות מידול של וריאציה עונתית הפגין עם טרשת נפוצה Relapse נתונים

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...