وقد تم دعم هذا العمل بدعم جزئي من قبل مؤسسة العلوم الوطنية في إطار منحة رقم 0938047 EFRI، ومعهد تكنولوجيا فرجينيا للتكنولوجيا الحرجة والعلوم التطبيقية (ICTAS). فإن الكتاب أود أن أعرب عن تقديري للدكتور إيفا Schmelz والدكتور بول روبرتس لهديتهم نوع من الخلايا موسي-L. المؤلفين الاعتراف انجيلا اندرسون لمساعدتها مع خلية ثقافة، Caitlan Swaffar لها المساعدة في تحرير هذه الوثيقة وإعداد التجارب، وجميع أعضاء مختبر نظم Bioelectromechanical.

1. افتعال جهاز النموذج CDEP ميكروفلويديك: نظرة عامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإجراءات ذكرت سابقا 22 باستخدام مقاومة للضوء وديب رد الفعل ايون النقش (DRIE) لحفر قناة التصميم المطلوب (الشكل 1) في رقاقة السيليكون (الشكل 2). إيداع طبقة رقيقة من تفلون لتحسين الافراج عن microdevice من الرقاقة. </li></ol><img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي لتردد جهاز منخفض الفرز مستمرة. ترك أشواط قناة العينة إلى اليمين وعلى بعد 500 ميكرون واسع مع التشنج أسنان المنشار إلى 100 ​​ميكرومتر. أزواج اثنين من قنوات القطب فلويديك يؤلف الأقطاب المصدر والمصارف، على التوالي، ويتم فصلها عن قناة عينة من 20 ميكرون سميكة الجدار PDMS. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> الشكل 2. وFABRعملية ication من جهاز CDEP (أ) لمدة 60 ثانية، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية يتفاعل بشكل انتقائي مع مقاومة للضوء يتعرض من خلال نمط قناع للهندسة الجهاز CDEP. (ب) تتم إزالة الواقي الضوئي باستخدام المطور. (ج) رد الفعل العميق ايون النقش (DRIE) تستخدم لحفر 50 ميكرون ملامح عميق، و 5 دقائق من النقش الرطب من قبل هيدروكسيد رباعي ميثيل الأمونيوم (TMAH) 25٪ عند 70 درجة مئوية وتستخدم للحد من خشونة على الجدران الجانبية. (د) يتم إضافة طلاء تفلون لتحسين الإفراج الجهاز من الرقاقة. (ه) يتم سكب PDMS على إعادة استخدامها رقاقة ختم بعد إزالة الغازات ومملح لمدة 45 دقيقة في 100 ° F. (و) تتم إزالة PDMS من رقاقة. ويتعرض PDMS وشريحة زجاجية نظيفة لالبلازما الجوية لمدة 2 دقيقة والمستعبدين معا. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف رقاقة مع رقائق الألومنيوم لمنع امتداد. مزيج polydimethylsiloxane (PDMS) في 10:01 نسبة المطاط الصناعي لعلاج وكيل والغاز دي لحوالي 20 دقيقة، وتصب على الرقاقة. الحرارة لمدة 45 دقيقة في 100 درجة مئوية لتجنب إتلاف طلاء تفلون من الطوابع. ودع الجهاز حتى يبرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التبريد، وإزالة رقائق الألومنيوم، وتقليم PDMS باستخدام شفرة جراحية، ولكمة ثقوب في الوصول قناة مدخل / مخرج باستخدام الناخس حادة مناسبة لحجم الأنابيب. هنا، يتم استخدام 1.5 مم الناخس حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف شريحة المجهر والزجاج باستخدام شطف من الصابون والماء، والإيثانول والماء DI، والتجفيف بالهواء، على التوالي. تنظيف الجهاز PDMS باستخدام الشريط سكوتش ماجيك. فحص تحت المجهر للتأكد من قنوات نظيفة. تعرض الشريحة والجهاز PDMS البلازما الجوية لمدة 2 دقيقة. اضغط بحزم الجانب قناة الجهاز لشريحة زجاجية، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء بين الجهاز والشريحة (الشكل 3). </li></ol><img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> الرقم 3. </stرونغ&gt; (أ) تستخدم لقناع ضوئيه خلال ختم تصنيع رقاقة السيليكون، و (ب) الانتهاء الجهاز PDMS من الزجاج مع العينة وقنوات القطب السوائل مليئة الأخضر والأحمر تلوين الطعام، على التوالي. انظر الشكل 1 لأبعاد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . 2. إعداد تعليق خلية في DEP العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الموصلية المنخفضة (100 ميكروثانية / سم) العازلة، والتي سوف يتم الإشارة إليها باسم &quot;المخزن المؤقت DEP&quot; (8.5٪ سكروز [ث / ت]، 0.3٪ الجلوكوز [ث / ت]، 0.725٪ RPMI [ث / ت]) 16 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا في المخزن DEP في 3 × 10 6 خلية / مل. هنا، يتم استخدام سرطانية وقت متأخر من مرحلة الماوس سطح المبيض الظهاري (موسي-L) الخلايا. </li></ol> ملاحظة: تحليل الجدوى خلية من التريبان الأزرق الإقصاء طريقة صبغ أظهرت انخفاضا طفيفا في الجدوى(95،1-91،6٪) من المرحلة المبكرة موسي (موسي-E) الخلايا علقت في المخزن DEP في درجة حرارة الغرفة بعد 5 ساعة. ومن المتوقع أن انخفاضا طفيفا مماثلا في جدوى يحدث للخلايا موسي-L، مشيرا إلى أن الخلايا لا ينبغي خزنها في DEP العازلة على المدى الطويل. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صبغ الخلايا باستخدام غشاء نفاذية صبغة الفلورسنت، مثل تنشيط إنزيمي-Calcein AM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الموصلية من تعليق خلية مصبوغ. يجب أن تكون الموصلية حوالي 100 ميكروثانية / سم. إذا كان قياس الموصلية عالية جدا، وتدور العينة إلى أسفل، resuspend في المخزن المؤقت DEP في 3 × 10 6 خلية / مل وتكرار قياس الموصلية. </li></ol> 3. تحميل ميكروفلويديك رقاقة CDEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة ميكروفلويديك تحت فراغ لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، وقطع قطعة من أنابيب مرنة تمتد المسافة من ضخ حقنة لمرحلة المجهر حيث سيتم تقع رقاقة ميكروفلويديك. هنا، بطول 6 بوصة من الأنابيبهو مطلوب. أنابيب يصلح لإبرة طرف على حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويقدر طول المطلوبة لمنفذ أنابيب بقسمة حجم العينة المستهدفة التي تم جمعها من قبل منطقة مستعرضة من الأنبوب. تتطلب قطع طول الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم تعليق خلية في حقنة. تأكد من أن عدم وجود فقاعات تقع في أنابيب أو حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إزالة رقاقة من فراغ، إدراج أنابيب مخرج ورئيس قناة عينة بسرعة لتجنب فقاعات الهواء المحبوس في القنوات. بلطف اضغط على حقنة عندما فتيلة لتجنب تمزق رقيقة (20 ميكرون) حاجز العزل، على الرغم من فقد لوحظ أن الجدار يمكن أن تحمل إنتاجية عالية ثابتة بالقرب من 5 مل / ساعة دون تمزق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى رئيس قنوات القطب، ضع بسرعة نصائح ماصة فارغة في منفذ واحد من كل قناة القطب فلويديك. ماصة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على كمية صغيرة من رودامين B والاستفادة بلطف لإدخال السوائل في الطرف الآخر من القناة القطب. الحفاظ على ضغط لطيفحتى برنامج تلفزيوني مع رودامين B تقدم واضح حتى غيض من غيض ماصة فارغة. تكرار لكل قناة القطب. يستخدم رودامين B فقط لتصور fluorescently قنوات القطب فلويديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فتيلة، وملء الخزان كل طرف ماصة مع برنامج تلفزيوني مع رودامين B. تشكيل فقاعة تجنب في الخزانات ماصة الحافة، وإزالة أي فقاعة مرئية من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا. فصل الأنابيب منفذ وتجاهل بشكل مناسب، ثم تضاف خزان منفذ أنابيب جديدة لجمع وحدة التخزين الهدف. </li></ol> 4. تميز تردد كروس من الخلايا باستخدام رقاقة CDEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة على مرحلة مجهر مقلوب مجهزة الكاميرا الرقمية (الشكل 4). </li></ol><img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> الشكل 4. </stroنانوغرام&gt; (أ) الإعداد التجريبية عموما للتجارب CDEP. يقع رقاقة CDEP على منصة المجهر المقلوب. كاميرا ترسل الصور إلى الكمبيوتر للتسجيل. يحافظ على ضخ حقنة تدفق مدخل ثابتة. المولد وظيفة يولد إشارة التي صعدت من مكبر للصوت عالية الجهد ومتصلا رقاقة CDEP بواسطة أقطاب الأسلاك. الذبذبات تراقب إشارة إرسالها إلى رقاقة. (ب) عرض التفاصيل من الشريحة CDEP واتصالات فلويديك والإلكترونية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل على ضخ حقنة حقنة وإدراج الأقطاب الكهربائية الأسلاك في فلويديك الخزانات قناة القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ السوائل من خلال في 1 مل / ساعة لضمان اتصال جيد بين ضخ حقنة وحقنة. بصريا تفتيش طول القناة لضمان تدفق دون عوائق من الخلايا وعدم وجود فقاعات أو تسرب. أحمرمعدل التدفق فوسي إلى 0.005 مل / ساعة. ملاحظة: لقد تم تحقيق إنتاجية عالية تصل إلى 1 مل / ساعة 31،35 في الأجهزة وهندستها أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسلامة، اختبار للإلكترونيات بنسبة المحرك على مولد وظيفة، ومكبر للصوت عالية الجهد، والذبذبات، والتكيف مع الجهد المطلوب والتردد. هنا هذه المعايير هي 200 V و 20 كيلوهرتز. على التحقق من أداء مقبول، خارج السلطة. ربط الأقطاب إلى مكبر للصوت عالية الجهد. ملاحظة: لاحظ إجراءات ملائمة السلامة الكهربائية عند تشغيل الأجهزة الإلكترونية في الفولتية العالية المستخدمة في هذه التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على تحقيق تدفق مستمر، وتطبيق الجهد المطلوب في التردد المطلوب. في هذه التجربة، والجهد هو 200 V RMS على ترددات بين 5-60 كيلو هرتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل ملفات الفيديو من استجابة الخلية مع تقنيات معالجة الصور (خطوة 5) لتحديد توزيع خلية في القناة وتميز تردد كروس. للقيام بذلك،الحفاظ على الجهد المستمر وتختلف وتيرة منتظمة. في بداية ونهاية التجربة، وكذلك عشوائيا بين أشواط تجريبية، تسجيل توزيع الخلايا السيطرة، وتوزيع الخلايا دون تطبيق أي حقل كهربائي. تقدير كمية الوقت اللازم للخلايا في التدفق من المدخل إلى موقع رصد (هنا، 5 دقائق). بعد وضع تردد جديد، انتظر هذا المبلغ من الزمن، ثم يبدأ تسجيل (هنا، فيديو 2 دقيقة التوزيع الخلية). </li></ol> 5. تجهيز صورة لوصف كروس التردد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام برنامج نصي الحسابية، وتحليل كل إطار الفيديو الإطار لتحديد الوضع النسبي ص (حيث اتجاه زي هو عمق العمودي للقناة، ص الاتجاه هو عرض القناة، والأشعة الاتجاه هو طول قناة) كل خلية الاستشعاع أو الجسيمات في تحديد الإحداثي س المصب من منطقة القوة DEP عالية في القناة. إنشاء رسم بياني للديس النسبيةtribution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة الوسط للتوزيع في كل الجهد والتردد مع محور لتوزيع السيطرة. لجهد معين وترددات مختلفة، وتحديد تردد كروس، حيث يطابق محور ص موقف السيطرة. </li></ol> 6. متفاوتة التجربة لإجراء الفرز الخلية أو الإثراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخليط المطلوب في المخزن DEP بتركيز مجموعه 3 × 10 6 الجسيمات / مل. هنا، وهذا الخليط هو خلايا موسي-L مع 4 حبات ميكرون الاستشعاع في المخزن DEP. تنفيذ الخطوات المذكورة سابقا لإعداد جهاز CDEP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفرز أو إثراء خلايا من خليط، وتحديد الترددات كروس من الخلايا المستهدفة والجسيمات الخلفية كما هو موضح سابقا. تعمل التجربة على تردد بين اثنين من ترددات كروس من الخلايا المستهدفة والجسيمات الخلفية بحيث أن السكان اثنين من جزيئات تواجه القوات DEP في د المعاكسirections. لفرز الخلايا موسي-L و 4 ميكرومتر الخرز، وتعمل على microdevice أعلاه 11.90 ± 0.63 كيلو هرتز. تردد كروس الأولى من الخلايا موسي-L ذكرت مؤخرا من قبل Salmanzadeh وآخرون 33 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع محتويات عينة فرزها، وإزالة الأنابيب منفذ على جمع وحدة التخزين الهدف، من خلال وضع الإصبع القفازات خلال افتتاح منفذ وبلطف الجر على الأنبوب. صب حجم المستهدف جمعها في خزان لمزيد من التحليل لاحظ: يمكن أن تشمل أساليب استرداد عينة أخرى ربط خزان دائم للرقاقة وإزالة عينة بسيطة من قبل pipetting. </li></ol>

<ol>
	<li>Butler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell culture and upstream processing. , (2007).</li><li>Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+Cell+Capture+in+Microfluidic+Devices.">Rare Cell Capture in Microfluidic Devices.</a> Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+cells+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature.</a> Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).</li><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+activated+cell+sorting.">Fluorescence activated cell sorting.</a> The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).</li><li>Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitarget+magnetic+activated+cell+sorter.">Multitarget magnetic activated cell sorter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).</li><li>Chabert, M., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+high-throughput+encapsulation+and+hydrodynamic+self-sorting+of+single+cells.">Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).</li><li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+inertial+focusing,+ordering,+and+separation+of+particles+in+microchannels.">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).</li><li>Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidics.">Inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).</li><li>Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+single-cell+sorting+system+based+on+optical+trapping.">Automated single-cell sorting system based on optical trapping.</a> J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).</li><li>Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+(SAW)+acoustophoresis:+now+and+beyond.">Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond.</a> Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).</li><li>Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Article-Dielectrophoresis:+Status+of+the+theory,+technology,+and+applications.">Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications.</a> Biomicrofluidics. 4, (2010).</li><li>Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+separation+of+cancer+cells+from+blood.">Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood.</a> Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).</li><li>Pohl, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , (1978).</li><li>Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+cells+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature.</a> Journal of Membrane Science. , (2012).</li><li>Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Viable+and+Nonviable+Yeast+Using+Dielectrophoresis.">Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis.</a> J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).</li><li>Flanagan, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+dielectric+properties+distinguish+stem+cells+and+their+differentiated+progeny.">Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny.</a> Stem Cells. 26, 656-665 (2008).</li><li>Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+multidrug+resistance+reversal+using+dielectrophoresis+and+flow+cytometry.">Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry.</a> Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).</li><li>Hoettges, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis-activated+multiwell+plate+for+label-free+high-throughput+drug+assessment.">Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment.</a> Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).</li><li>Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulator-based+dielectrophoresis+for+the+selective+concentration+and+separation+of+live+bacteria+in+water.">Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water.</a> Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).</li><li>Davalos, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+impact+of+dynamic+surface+coatings+on+polymeric+insulator-based+dielectrophoretic+particle+separators.">Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).</li><li>Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+manipulation+by+means+of+insulator-based+dielectrophoresis+employing+direct+current+electric+fields.">DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields.</a> Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).</li><li>Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contactless+dielectrophoresis:+a+new+technique+for+cell+manipulation.">Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation.</a> Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).</li><li>Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis-based+cell+manipulation+using+electrodes+on+a+reusable+printed+circuit+board.">Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board.</a> Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).</li><li>Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+focusing+in+a+contactless+dielectrophoretic+microfluidic+chip+with+insulating+structures.">Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures.</a> Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).</li><li>Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC+electrokinetics:+applications+for+nanotechnology.">AC electrokinetics: applications for nanotechnology.</a> Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).</li><li>Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis:+Status+of+the+theory,+technology,+and+applications.">Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications.</a> Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).</li><li>Pethig, R., Ferrari, M. a. u. r. o., Ozkan, M. i. h. r. i. m. a. h., Heller, M. i. c. h. a. e. l. . J. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.">Ch. 4.</a> BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. 4, 103-126 (2007).</li><li>Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+isolation+of+live/dead+cells+using+contactless+dielectrophoresis+(cDEP).">Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP).</a> Lab Chip. 10, 438-445 (2010).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+differentiation+of+mouse+ovarian+surface+epithelial+cells,+macrophages,+and+fibroblasts+using+contactless+dielectrophoresis.">Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis.</a> Biomicrofluidics. 6, (2012).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+prostate+tumor+initiating+cells+(TICs)+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature.</a> Lab Chip. 12, 182-189 (2012).</li><li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Blood+Cells+Using+Dielectrophoresis.">Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis.</a> , (2012).</li><li>Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+development+of+a+low+frequency+contactless+dielectrophoresis+(cDEP)+platform+to+sort+cancer+cells+from+dilute+whole+blood+samples.">Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples.</a> Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Dielectric+Properties+of+Different+Stages+of+Syngeneic+Murine+Ovarian+Cancer+Cells.">Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells.</a> Biomicrofluidics. , (2013).</li><li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , 590-593 (2012).</li><li>Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+contactless+dielectrophoresis:+Theoretical+considerations.">Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations.</a> Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).</li><li>Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+beads+and+cells+in+multi-channel+microfluidic+devices+using+dielectrophoresis+and+laminar.">Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar.</a> J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).</li><li>Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis.">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis.">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li></ol>

الدكتور رافائيل دافالوس لديه براءات الاختراع في انتظار لتماس dielectrophoresis.

DEP هي تقنية قوية لتحديد خصائص عازلة من الجزيئات والجسيمات توجيه الحركة نحو فرز الطلبات، والعزلة، أو التخصيب. ويرجع ذلك إلى تأثير ضار للاتصال المباشر مع القطب عينة، اتخذت الآخرين نهج مماثلة لطريقة عرض في وقت سابق لتجنب الاتصال. على سبيل المثال، البشير وآخرون. وضعت الأجهزة DEP خالية من الاتصال باستخدام جهاز PDMS ميكروفلويديك فصلها عن المطبوعة أقطاب لوحات الدارات الكهربائية بواسطة ساترة الزجاج رقيقة، ويتم إجراء هذه التقنية متوفرة أيضا في شكل شريط فيديو. 23،36 هنا، لقد أظهرنا تصنيع رقاقة CDEP وأقطاب فلويديك باستخدام الركيزة PDMS واحد، وبروتوكول تجريبي لفصل خلايا سرطان المبيض من خليط من الخلايا والخرز الفلورسنت. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح لعرض مجموعة متنوعة من التطبيقات الأكثر تعقيدا وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، بما في ذلك فرز ليفالخلايا الإلكترونية والأموات، 28 ورم الخلايا بدء من خلايا سرطان البروستاتا، 30 الخلايا السرطانية من الخلايا تمييع الدم الحمراء، والتفريق بين 31،32 مراحل سرطان الثدي وسرطان المبيض 37 29 CDEP كما تم استخدامها لخلط الجسيمات. هذه 38 وتشير التطبيقات التي باستخدام تقنية بسيطة قدمت، وأغراض متنوعة يمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق تغيير تصميم هندسة القناة. . DEP مفيد على الميكروسكيل للتلاعب من الجزيئات 13 للجسيمات كروية، وقوة dielectrophoretic متعدية يعتمد على حجم والكهربائية خصائص الجسيمات والمتوسطة تعليق لها، فضلا عن التدرج الحقل الكهربائي التربيعية: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> حيث ε م هو السماحية للتعليق المتوسطة، r هو نصف قطرهامن الجسيمات، والصليب الأحمر [ك (ω)] هو الجزء الحقيقي للعامل كلوسيوس-Mossotti (CM). عامل CM هو مقياس من الاستقطاب النسبية للجسيمات مقارنة المتوسطة بتوقيف ويحدد اتجاه القوة dielectrophoretic. ما توصف بأنها <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> حيث <img alt="المعادلة 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> و <img alt="المعادلة 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> هي permittivities معقدة من الجسيمات والمتوسطة، على التوالي. السماحية معقدة، <img alt="المعادلة 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> ، يعتمد على (σ) الموصلية و(ω) تردد. عامل CM من جسيمات كروية ونظريا ملزمة بين -0.5 و 1. إذا كان عامل CM هو سلبي، والجزيئات تجربة NDEP لأن المتوسط ​​هو أكثر قطوب من الجسيمات، لذلك جسيمات تتحرك بعيدا عن مناطقالتدرجات الحقل الكهربائي عالية. إذا كان عامل CM هو إيجابي، والجزيئات هي أكثر قطوب من المتوسط ​​وكانت تجربة pDEP التي تتحرك نحو مناطق التدرجات الحقل الكهربائي عالية. للجزيئات البيولوجية التي هي nonhomogeneous في الهيكل، مثل الخلايا، يمكن تحديد عامل كلوسيوس-Mossotti من القيمة الفعالة للالسماحية الجسيمات: <img alt="المعادلة 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> حيث <img alt="المعادلة 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> و <img alt="المعادلة 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> هي السماحية المعقدة للالسماحية المعقدة فعالة الداخلية للخلية، مثل السيتوبلازم، وغشاء البلازما، على التوالي؛ r هو نصف قطر الخلية، ود هو سمك غشاء البلازما 26 عندما يحدث DEP مع الجسيمات العالقة فيالسوائل، فإن حركة الجسيمات المتعلقة السائل توليد قوة جر على الجسيمات. يجب النظر في هذا قوة السحب عند تحديد القوة الشاملة تعمل على الجسيمات. لحالات من الاهتمام هنا، قوى اللزوجة الهيمنة ويفترض جسيمات كروية، والصغيرة، وتتحرك مع سرعة منخفضة نسبيا، لذلك ينص القانون السحب ستوكس تقريب جيد لقوة السحب: <img alt="المعادلة 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> حيث η هو اللزوجة من السوائل، ش ع هي سرعة الجسيم، وو ش هي سرعة السائل، والتي يمكن أيضا أن تتحرك. نظرا لقوة dielectrophoretic، المعروف السوائل وخصائص الجسيمات، وسرعة تدفق معروفة، يمكن حلها التوازن بين قوة السحب وقوة dielectrophoretic لتقدير سرعة الجسيمات. معدل القص التي ينبغي أن تكون تجربة الخلايا تحت العتبة التي جيمكن أن يحدث الذراع lysing. توصيف الخصائص الكهربائية للجزيئات من الضروري التنبؤ والسيطرة على الكيفية التي سيستجيب تحت DEP لهم. في هذا العمل، ونحن تستخدم خصيصا منخفضة التردد CDEP مع الخلايا موسي-L للتدليل على بروتوكول لتحديد تردد كروس أول من الخلايا، ثم أظهر الفرز مستمرة من الخرز البوليسترين والخلايا موسي-L على أساس معارضة ردودهم DEP. تغيير وهندسة الجهاز CDEP تغيير التدرجات المكانية للمجال الكهربائي، مما يسمح لأجهزة مصممة لتكون ذات تردد عال أو منخفضة التردد العملية، وانتقائية عالية وكفاءة الفرز لنوع من الخلايا المحددة. بالإضافة إلى ذلك، وأجهزة إنتاجية عالية يمكن تطويرها عن طريق افتعال قنوات أوسع، 30 قناة في موازاة ذلك، 30 أو عن طريق تلفيق متعدد الطبقات 35، والتي هي مكدسة قنوات القطب عموديا فوق وتحت عميق نسبياقناة العينة. أغشية رقيقة تشكل حاجزا بين الطبقات. اختبار مبدئي مع الأجهزة ملفقة في ميثاأكريلات (PMMA) والبولي أظهرت (PC) أفلام رقيقة من الخلايا استجابة DEP موسي-L. تجري الجهود الحالية لتحسين متعدد الطبقات الأجهزة عالية الإنتاجية وتحسين نظام الطرفية في نهاية المطاف نحو منصة التوصيل واللعب. لتوسيع من تقنية تجريبية الأساسية المقدمة، التطبيقات ومواصفات الجهاز يمكن أن تكون مصممة لتناسب مطالب معينة، مثل الفرز مقابل التوصيف، أو إضافة خزانات نموذج ونظام شبه الآلي إلى الجهاز.

تخصيب عينة بيولوجية والجسيمات الفرز غالبا ما يكون ضروريا لتحليلها لاحقا. 1 على سبيل المثال، عزل الخلايا نادرة من سوائل الجسم لها تطبيقات مهمة في الكشف عن السرطان والطب فردية. 2،3 وتقنيات تخصيب الأكثر شيوعا هي فلوري خلية تنشيط الفرز (FACS ) 4 وتنشيط الخلايا الفرز المغناطيسي (MACS)، 5 والتي تعتمد على علامات سطح أعرب لتمييز الخلايا. وتشمل الاستراتيجيات الأخرى الهيدروديناميكية 6 أو بالقصور الذاتي 7،8 الفرز، ملاقط بصرية، 9 acoustophoresis و 10 و dielectrophoresis. 11،12 Dielectrophoresis هو حركة الجسيمات الاستقطاب في وجود حقل كهربائي غير موحدة. وقد استخدم 13 DEP ل مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك الخلايا 2،14 الفرز على أساس الجدوى، 15 تميز خصائص bioelectrical من الخلايا، ونوع 16<html> جي على التغيرات المستحثة في الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا. يستخدم 17،18 DEP التقليدية أقطاب مستو منقوشة داخل قناة ميكروفلويديك لتطبيق الجهد وإحداث 13 غير موحدة الحقل الكهربائي. في حين أن هذا هو أسلوب قوية، يمكن أن تنشأ التحديات، مثل التبطين والقطب الكهربائي. dielectrophoresis مقرها عازل (المعهد) 19 وقد تناولت تحديات قاذورات، القطب التبطين، والتدهور المكاني للمجال الكهربائي من خلال تنميط هياكل العازلة التي تحفز على عدم الإتساق في حقل كهربائي DC. وقد استخدم المعهد لفصل انتقائي خلايا البكتيريا الحية والميتة، 19 عزل الجراثيم البكتيرية و 20 و التلاعب الحمض النووي، و21 بين التطبيقات الأخرى. التدفئة الجول يمكن أن يشكل تحديا لأنه يمكن أن يحدث نتيجة لارتفاع الفولتية DC المطلوبة في كثير من الأحيان. لتحسين هذه التحديات، وضعت الأجهزة بالغة الصغر خالية من الاتصال DEP. 22-24 ق = &quot;jove_content&quot;&gt; هذه التقنية المعروضة هنا يستخدم تماس dielectrophoresis (CDEP)، سميت بذلك لعدم وجود اتصال مباشر بين الأقطاب المعدنية والقناة العينة. 22 فريدة من نوعها لهذه الاستراتيجية هو استبدال الأقطاب المعدنية مع قنوات القطب السوائل مليئة حل موصل للغاية. تقترن هذه الأقطاب السوائل سعويا عبر الحاجز رقيقة عازلة للقناة عينة عن طريق الجهد AC. القضاء على عينة اتصال مع أقطاب يقلل من القضايا المرتبطة على أساس أساليب DEP مثل التحليل الكهربائي وتشكيل فقاعة، وتلوث العينة، والقطب التبطين. ونتيجة لذلك، CDEP مفيد وخاصة بالنسبة للعينات البيولوجية لأنها تدعم بقاء الخلايا في العينة. الأهم من ذلك، يمكن CDEP الحفاظ على عينة العقم. رقاقة يمكن أن تكون على استعداد في غطاء خلية ثقافة ويمكن أن تجرى التجربة دون الحاجة إلى الاتصال عينة أقطاب معدنية أو التي تتطلب أن تكون العينة مفتوحة للenvironmeالإقليم الشمالي. خزان بسيطة يمكن ان تكون ثابتة إلى منفذ رقاقة لتسهيل الانتعاش العقيمة العينة. بالإضافة إلى ذلك، تلفيق أقطاب السائل من نفس مادة البوليمر حيويا (PDMS) كقناة عينة يقلل من التكلفة الباهظة التي تتكبدها مع الزخرفة المخصصة من الأقطاب الكهربائية المعدنية، والوقت اللازم لتصنيع، ويحد من الحاجة إلى معدات غرف الأبحاث المتخصصة إلى الزخرفة الأولية من الطوابع قابلة لإعادة الاستخدام رقاقة السيليكون. حركة الجسيمات نتيجة لDEP يعتمد على خصائص الجسيمات والمتوسطة، فضلا عن التدرجات المكانية للمجال الكهربائي. وهناك عامل الجسيمات والتي تعتمد على التردد، ودعا عامل كلوسيوس-Mossotti (CM)، ويأخذ قيمة في نطاق -0.5 إلى 1، ويحدد اتجاه القوة DEP. ويسمى التردد الذي عامل CM هو بالضبط الصفر تردد كروس. هذه هي النقطة التي يمارس أي قوة dielectrophoretic على الجسيمات وعلامة التغييرات عامل CM. A قإنجل تردد كروس لالمجهرية الصلبة الخاملة يحدث عندما يتغير عامل CM من السلبية إلى الإيجابية 25 لخلايا الثدييات في البلدان المنخفضة عازلة الموصلية بناء على أمر من 0.01 S / م، وتردد كروس الأولى مما يدل على الانتقال من NDEP لpDEP موجود بالقرب من 10 - 100 كيلو هرتز، ويتأثر حجم والشكل والهيكل الخلوي، وخصائص غشاء الخلية. 26،27 وتردد كروس الثاني في التحول من نظام إلى pDEP NDEP هو بناء على أمر من 10 ميغاهرتز، ويتأثر نسبة النواة السيتوبلازم، السيتوبلازم الموصلية، والشبكة الإندوبلازمية. يمكن تطبيق 27 قوة DEP دون وجود تدفق السوائل، ولكن هنا نحن الاستفادة من السوائل المتدفقة لتحقيق الفرز مستمر من الجسيمات العالقة. التأثير المشترك لقوة dielectrophoretic وقوة السحب وستوكس تملي حركة متعدية من الجسيمات. قمنا بتطوير أجهزة للعمل في نطاقين تردد. التردد العاليوقد عملت الأجهزة ذ (100-600 كيلو هرتز) باستخدام pDEP وحققت الفرز دفعة من الخلايا، مثل الخلايا السرطانية في البروستاتا بدء (التشنجات اللاإرادية)، الظهارية سطح المبيض (موسي) خلايا الفئران، MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي، أو العيش THP -1 الخلايا بشكل انتقائي من خلال محاصرة خلايا الفائدة على العزل المشاركات التي تقع في القناة العينة. 28-31 تردد السفلى (5-100 كيلو هرتز) الأجهزة تعمل بشكل مستمر، وعندما كانت تعمل على تردد واحد الذي يواجه السكان pDEP في حين أن الخبرات السكان الخلفية NDEP، يمكن إعادة توجيه مسارات الجسيمات لتحقيق الفرز. وقد استخدمت هذه الأجهزة 32-34 التردد المنخفض لفرز الخلايا السرطانية من خلايا الدم الحمراء، وتحديد التغيرات في خصائص عازلة من موسي خط الخلية تقدمية، وإلى إلقاء الضوء على آثار غير العلاجات الشحميات السفينغولية سامة على عكس خصائص عدوانية من الخلايا موسي العدوانية. بالإضافة إلى ذلك، الأجهزة بالغة الصغر CDEP يمكن تصميمها لتعمل على زيادة الإنتاجية، حاليا ما يصل إلى 1 مل / ساعةص. 31،35 كما هو موضح، والمرونة والتكلفة المنخفضة لعملية تلفيق تمكن هندستها جهاز مصمم خصيصا، والتي تسمح للإجراء التجريبي تقديمها لتكون ذات الصلة لمجموعة واسعة من التطبيقات. الهدف على المدى الطويل هو أن ندرك CDEP خالية من التسمية الفرز الخلية والتخصيب على مستوى السريرية، مع انتعاش عينة للثقافة أو معالجة لاحقة. تقنية المعروضة هنا هي طريقة بسيطة وغير مكلفة، من تلفيق لإجراء التجارب، مما يزيد من إمكانية الوصول إلى DEP. ونحن لشرح إعداد شريحة CDEP والبروتوكول التجريبي لتحقيق توصيف وإثراء خلايا سرطان المبيض من المجهرية الفلورسنت.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) هي الظاهرة التي الاستقطاب الجزيئات في مجال كهربائي غير موحدة تخضع حركة متعدية، ويمكن استخدامها لتوجيه حركة المجهرية الدقيقة في سطح علامة مستقلة الطريقة. تقليديا، وتشمل الأجهزة DEP الأقطاب المعدنية مستو منقوشة في القناة العينة. هذا النهج يمكن أن تكون مكلفة وتتطلب بيئة غرف الأبحاث المتخصصة. مؤخرا، تم تطوير نهج خالية من الاتصال يسمى dielectrophoresis تماس (CDEP). يستخدم هذا الأسلوب مبدأ الكلاسيكي DEP مع تجنب الاتصال المباشر بين الأقطاب وعينة من الزخرفة أقطاب فلويديك وقناة عينة من polydimethylsiloxane واحد (PDMS) الركيزة، ويحتوي التطبيق كاستراتيجية ميكروفلويديك السريع المصممة لفرز وإثراء المجهرية الدقيقة. فريدة من نوعها لهذا الأسلوب هو أن يتم إنشاء الحقل الكهربائي عبر قنوات القطب فلويديك تحتوي على السائل موصل للغاية، والتي يتم فصلها عنقناة عينة من حاجز رقيقة عازلة. لأن أقطاب معدنية عدم الاتصال مباشرة العينة، وتجنب التحليل الكهربائي، القطب التبطين، وتلوث العينة. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يتيح عملية تلفيق غير مكلفة وبسيطة. CDEP وبالتالي مناسبة تماما لمعالجة الجزيئات البيولوجية الحساسة. قوة dielectrophoretic بناء على الجزيئات لا يتوقف فقط على التدرجات المكانية للحقل الكهربائية المولدة حسب التصميم للتخصيص للهندسة الجهاز، ولكن الخصائص الفيزيائية الحيوية الجوهرية للخلية. على هذا النحو، CDEP هي تقنية خالية من التسمية التي يتجنب تبعا المؤشرات الحيوية، وأعرب سطح الجزيئية التي يمكن التعبير بنسب مختلفة ضمن مجموعة من السكان، في حين لا يزال يسمح توصيف، والإثراء، وفرز bioparticles. هنا، ونحن لشرح أساسيات تصنيع والتجريب باستخدام CDEP. نفسر إعداد بسيطة من شريحة CDEP باستخدام الطباعة الحجرية الناعمةتقنيات ذ. نناقش الإجراء التجريبي لوصف تردد كروس من الجسيمات أو الخلية، والتردد الذي القوة dielectrophoretic هو صفر. أخيرا، علينا أن نظهر استخدام هذه التقنية لفرز خليط من خلايا سرطان المبيض والاستشعاع المجهرية (الخرز).

DEP ينبغي مراعاة النوعية في القناة عينة لتأكيد الجهاز جاهز للعمل عندما يكون الحقل الكهربائي موجودا. أسلوب واحد لاختبار وجود DEP هو لضبط التردد لقيم بعيدة عن تردد كروس حيث من المتوقع pDEP قوية وNDEP (تقريبا&gt; 40 كيلو هرتز لمراقبة pDEP و&lt;10 كيلو هرتز لمراقبة NDEP لمعظم الخلايا السرطانية الثديية في العازلة مع الموصلية من 100 ميكروثانية / سم). تجدر الإشارة إلى أن المجهرية الخاملة يحمل pDEP أدناه تردد كروس وNDEP أعلاه تردد كروس بهم. للهندسة ميزة أسنان المنشار المعروضة هنا، ينبغي أن ينظر pDEP للخلايا في ارتفاع وتيرة الاختبار، يتبين من وقوع اللؤلؤ تسلسل وتركيز الخلايا أو الجزيئات على حافة مسننة ميزة للقناة، بينما في انخفاض وتيرة الاختبار، NDEP يجب أن يكون واضحا كما يتم تقييد الخلايا إلى المنطقة أقرب إلى حافة مستقيمة للقناة. في هذه الترددات المنخفضة، قد خلايا ليزقد تظهر بسبب ه التثقيب الكهربائي، وبالتالي فإن العينة تحتوي على خلايا أقل، وتلك التي قد تظهر واضحة أو ضبابية الموسع إذا باستخدام صبغة الاستشعاع تنشيط إنزيمي. التحقق من الترددات التي pDEP وNDEP تحدث يسمح للتحديد وتيرة التبادل كما هو موضح في البروتوكول. عن الخلايا السرطانية الثديية، مثل موسي-L المستخدمة هنا، لاحظنا NDEP في 5 كيلو هرتز (الشكل 5A) وpDEP قوية عند 60 كيلو هرتز (الشكل 5B). كان الخلايا موسي-L يبلغ قطرها 17.7 ± 3.3 ميكرومتر (ن = 268 الخلايا) والخرز ويبلغ قطرها الاسمي 4 ميكرون. تحليل كامل من خصائص عازلة للخلايا موسي-L مقارنة مع الخلايا موسي في المراحل المبكرة من تطور يمكن العثور عليها في الأعمال الأخيرة التي كتبها Salmanzadeh وآخرون 33 إن لم يكن لوحظ pDEP وNDEP في هذين النقيضين، مختلف المشاكل يمكن الحدوث. قد يكون عينة الموصلية عالية جدا وذلك بسبب الملوثات أو lysing الخلية. Insufficieقد يتم إنشاء الحقل الكهربائي الإقليم الشمالي بسبب فقاعات المحاصرين في قنوات القطب السوائل، والتي تمنع توصيل التيار إلى الجزء من القنوات المطلة على قناة العينة. قد يكون سبب تدفق متقلب بواسطة فقاعة المحاصرين في حقنة أو مدخل أنابيب، فقاعات الناتجة عن عدم حفظ الجهاز تحت فراغ لفترة كافية أم لا بسرعة ملء الجهاز على إزالة من فراغ، والتسرب بسبب التبطين من PDMS سيئة المستعبدين ل شريحة زجاجية، بذلت الدموع في الغشاء الحاجز بسبب القوة المفرطة عند ملء القنوات، أو معدلات التدفق في اقصى نطاق التشغيل المضخة. بالإضافة إلى تحديد وتيرة انتقال من الخلايا، هذه التقنية يمكن استخدامها لفرز خليط، ويتضح هنا من خلال مزيج من الخلايا موسي-L والخرز. هذا المثال يستفيد من dielectrophoresis السلبية (NDEP) التي أظهرتها 4 ميكرومتر الخرز على ترددات الخلايا حيث تواجه موسي-L dielectrophoresis إيجابية (pDEP). نحن سperated الجهاز على 200 V RMS و 10 كيلو هرتز (الشكل 6A)، ولاحظ أن كلا من الخلايا والخرز كانت مختلطة كما شهدت NDEP. في 50 كيلوهرتز لاحظنا حركة الخلايا موسي-L إلى قمة القناة، في حين اقتصرت الخرز إلى الجزء السفلي من القناة، وتمكين فصل الخليط في مكونين (الشكل 6B). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> الرقم 5. يتم التلاعب موقف الخلايا موسي-L عن طريق تغيير وتيرة تطبيق الحقل الكهربائي. تؤخذ الصور في ميزة أسنان المنشار النهائية في القناة عينة وتقع الأقطاب فلويديك في زوايا على الجانب الأيمن. أنها مليئة PBS تحتوي رودامين B، والتي تتفلور لتصور القنوات. (أ) الخلايا موسي-L تجربة NDEP في 200 V RMS<html> و5 كيلو هرتز (ب) الخلايا موسي-L تجربة تسلسل اللؤلؤ وpDEP في 200 V RMS و 60 كيلوهرتز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الرقم 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> الرقم 6. مزيج من الخلايا موسي-L (الخضراء) و 4 ميكرومتر الخرز (الحمراء) تتدفق من خلال ميزة أسنان المنشار النهائية في القناة عينة من جهاز منخفض CDEP التردد. (أ) في 200 V ويتم خلط 10 كيلو هرتز الخلايا والخرز. تشير الأسهم إلى الظهور بضعف الخلايا التي يحتمل لقوا حتفهم بسبب الظروف التردد المنخفض. (ب) في 200 V و 50 كيلو هرتز الخلايا تجربة pDEP والانتقال إلى حافة ميزة للقناة، في حين حبات تجربة NDEP وتبقى محصورة في المنطقة أقرب حافة مستقيمة.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

Watch this Scientific Journal Video about Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis at JoVE.com

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

dielectrophoresis تماس (CDEP) يحقق الفرز وإثراء الجزيئات عبر خصائص عازلة الذاتية الخاصة بهم. قنوات القطب فلويديك استبدال الأقطاب المعدنية التقليدية لDEP، تناسب CDEP لعدم الإضرار-توصيف العقيمة والفرز من الجزيئات البيولوجية. ونحن لشرح كيفية إعداد microdevice CDEP وإجراء توصيف الخلايا والتجارب الفرز.

عزل خالية من التسمية والإثراء من خلال خلايا تلامس Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

label-free-isolation-enrichment-cells-through-contactless

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K Views.  Virginia Tech.  dielectrophoresis تماس (CDEP) يحقق الفرز وإثراء الجزيئات عبر خصائص عازلة الذاتية الخاصة بهم. قنوات القطب فلويديك استبدال الأقطاب المعدنية التقليدية لDEP، تناسب CDEP لعدم الإضرار-توصيف العقيمة والفرز من الجزيئات البيولوجية. ونحن لشرح كيفية إعداد microdevice ...

Video: Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

لتخصيب Chemoresistant سرطان المبيض الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا البشرية

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

في التخصيب في المختبر من خلايا سرطان المبيض-الشروع ورم

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

العزلة والخلوية Phenotyping من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع الزلالية السائل والعظام من Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...