Questo lavoro sostenuto è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation sotto Grant No. EFRI 0938047, e dal Virginia Tech Institute per la Tecnologia Critica e Scienze Applicate (ICTAS). Gli autori desiderano esprimere apprezzamento al Dr. Eva Schmelz e il Dr. Paul Roberts per la loro gentile dono di cellule MOSE-L. Gli autori riconoscono Angela Anderson per la sua assistenza con la coltura cellulare, Caitlan Swaffar per il suo aiuto con la modifica di questo documento e la preparazione di esperimenti, e tutti i membri del laboratorio Bioelectromechanical Sistemi.

1. Realizzazione di un prototipo di dispositivo CDEP Microfluidic: Panoramica <ol><li> Seguire le procedure precedentemente riportate 22 utilizzando photoresist e Deep Reactive Ion Etching (DRIE) per incidere il disegno canale desiderato (Figura 1) in un wafer di silicio (Figura 2). Depositare un sottile strato di teflon per migliorare il rilascio del microdispositivo dal wafer. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica di un dispositivo di smistamento continuo a bassa frequenza. Le piste canale del campione sinistra a destra e 500 micron di larghezza con costrizioni a dente di sega a 100 micron. Le due coppie di elettrodi canali fluidici compongono gli elettrodi di source e sink, rispettivamente, e sono separati dal canale campione da una spessa barriera 20 pm PDMS. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> Figura 2. Il Fabrprocesso icazione di un dispositivo CDEP. (a) per 60 sec, luce UV reagisce selettivamente con photoresist esposto tramite un modello di maschera della geometria del dispositivo CDEP. (b) photoresist viene rimosso utilizzando sviluppatore. (c) profonda Reactive Ion Etching (DRIE) è utilizzato per etch 50 micron caratteristiche profonde, e 5 min di attacco umido da idrossido di tetrametilammonio (TMAH) 25% a 70 ° C viene utilizzato per ridurre la rugosità delle pareti laterali. (d) viene aggiunto un rivestimento in teflon per migliorare il rilascio del dispositivo da il wafer. (e) PDMS cola sul riutilizzabile wafer timbro dopo degasaggio e polimerizzato per 45 min a 100 ° C. (f) PDMS viene rimosso dal wafer. PDMS e un vetrino pulito sono esposti al plasma di aria per 2 min e legati insieme. <ol start="2"><li> Avvolgere il wafer con un foglio di alluminio per evitare spill-over. Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) in rapporto 10:1 di elastomero per curare agente, de-gas per circa 20 min, E versare sul wafer. Calore per 45 min a 100 ° C per evitare di danneggiare il rivestimento in teflon del timbro. Lasciare che il dispositivo si raffreddi. </li><li> Dopo raffreddamento, rimuovere un foglio di alluminio, tagliare PDMS utilizzando una lama chirurgica, e perforare fori di accesso al canale di ingresso / uscita utilizzando un perforatore smussato adeguata alle dimensioni del tubo. Qui, viene utilizzato un perforatore smussato e 1,5 mm. </li><li> Pulire un vetrino per microscopio con un risciacquo di acqua e sapone, etanolo, acqua deionizzata, e asciugatura con aria rispettivamente. Pulire il dispositivo PDMS con del nastro Scotch Magia. Esaminare al microscopio per essere sicuri che i canali siano puliti. Esporre il vetrino e il dispositivo PDMS di plasma ad aria per 2 min. Premere con forza lato canale del dispositivo per vetrino, evitando la formazione di bolle d&#39;aria tra il dispositivo e la slitta (Figura 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> Figura 3. </strong&gt; (a) La maschera utilizzata per fotolitografia durante il timbro fabbricazione di wafer di silicio, e (b) il dispositivo PDMS vetro finito con il campione e canali elettrodi fluido riempito con verde e rosso colorante alimentare, rispettivamente. Vedere la Figura 1 per le dimensioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . 2. Preparare una sospensione di cellule in DEP Buffer <ol><li> Preparare una bassa conducibilità (100 mS / cm) tampone, che verrà indicato come &quot;tampone DEP&quot; (8,5% di saccarosio [w / v], 0,3% di glucosio [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) 16. </li><li> Sospendere le cellule in tampone DEP a 3 x 10 6 cellule / ml. Qui, vengono utilizzati cancerose del mouse fase tardo-ovarico epiteliale di superficie (MOSE-L) cellule. </li></ol> Nota: analisi vitalità cellulare mediante il metodo esclusione del colorante blu tripano mostrato una lieve diminuzione della redditività(95,1-91,6%), della fase iniziale MOSE (MOSE-E) le cellule sospese in tampone DEP a temperatura ambiente dopo 5 ore. Si prevede che una simile lieve diminuzione della redditività avviene per le cellule MOSE-L, indicando che le cellule non devono essere conservati in DEP tampone lungo termine. <ol start="3"><li> Tingere cellule utilizzando un colorante fluorescente membrana permeabile, come il enzimaticamente attivato calceina AM. </li><li> Misurare la conducibilità della sospensione cellulare tinto. La conducibilità dovrebbe essere di circa 100 mS / cm. Se la misura della conducibilità è troppo alto, ruotare il campione verso il basso, risospendere in tampone DEP a 3 x 10 6 cellule / ml e ripetere la misura di conducibilità. </li></ol> 3. Caricamento della CDEP Microfluidic Chip <ol><li> Posizionare il chip microfluidica sotto vuoto per 30 min. </li><li> Nel frattempo, tagliare un pezzo di tubo flessibile per coprire la distanza dalla pompa siringa alla fase microscopio in cui verrà collocato il chip microfluidica. Qui, una lunghezza di 6 pollici tuboè richiesto. Adatta tubo alla punta dell&#39;ago sulla siringa. </li><li> Stimare la lunghezza necessaria per tubo di uscita dividendo il volume del campione raccolto bersaglio per l&#39;area della sezione trasversale del tubo. Tagliare la richiedono lunghezza del tubo. </li><li> Disegnare sospensione cellulare nella siringa. Controllare che nessuna bolla si trovano nella tubazione o siringa. </li><li> Dopo la rimozione di chip dal vuoto, inserire il tubo di uscita e primo canale del campione in fretta per evitare bolle d&#39;aria intrappolate nei canali. Battere delicatamente la siringa quando adescamento per evitare la rottura della sottile (20 micron) barriera isolante, anche se è stato osservato che la barriera in grado di sopportare una costante elevato throughput vicino 5 ml / h senza rompersi. </li><li> Per primi i canali elettrodi, collocare rapidamente le punte delle pipette vuote in una presa di corrente di ciascun canale elettrodo fluido. Pipettare 200 microlitri di PBS contenente una piccola quantità di rodamina B e toccare delicatamente per introdurre il fluido nell&#39;estremità opposta del canale elettrodo. Mantenere una leggera pressionefino PBS con rodamina B progredisce visibilmente la punta della punta della pipetta vuoto. Ripetere per ogni canale elettrodo. Rodamina B è utilizzato solo per visualizzare fluorescente canali elettrodi fluidici. </li><li> Dopo l&#39;adescamento, riempire ogni serbatoio punta della pipetta con PBS con rodamina B. Evitare la formazione di bolle nei serbatoi punta pipetta e rimuovere eventuali bolle visibili pipettando delicatamente su e giù. Staccare il tubo di uscita ed eliminare in modo appropriato, quindi inserire un nuovo serbatoio tubo di uscita per raccogliere il volume di destinazione. </li></ol> 4. Caratterizzare Frequenza di crossover di cellule utilizzando CDEP Chip <ol><li> Posizionare il chip sulla scena di un microscopio invertito dotato di fotocamera digitale (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> Figura 4. </strong&gt; (a) la configurazione generale sperimentale per gli esperimenti CDEP. Il chip CDEP si trova sulla piattaforma del microscopio invertito. Una telecamera invia le immagini al computer per la registrazione. La pompa a siringa mantiene un flusso di ingresso costante. Il generatore di funzione genera un segnale che viene intensificato dall&#39;amplificatore ad alta tensione e collegato al chip CDEP da elettrodi a filo. L&#39;oscilloscopio controlla il segnale inviato al chip. (B) Dettaglio vista del chip CDEP e collegamenti fluidici ed elettronici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol start="2"><li> Montare siringa pompa siringa e inserire elettrodi a filo in fluidici serbatoi canali dell&#39;elettrodo. </li><li> Pompare fluido attraverso a 1 ml / hr per assicurare un buon contatto tra la pompa a siringa e la siringa. Controllare visivamente la lunghezza di canale per assicurare libero flusso delle cellule e l&#39;assenza di bolle o perdite. RossoPortata uce a 0.005 ml / h. Nota: Throughput alto come 1 ml / hr 31,35 è stato raggiunto in dispositivi di altre geometrie. </li><li> Per motivi di sicurezza, testare l&#39;elettronica da accendere il generatore di funzioni, amplificatore ad alta tensione, e oscilloscopio, e la regolazione di tensione e frequenza desiderata. Ecco questi parametri sono 200 V e 20 kHz. Sulla verifica di prestazioni accettabili, spegnere. Collegare gli elettrodi ad un amplificatore ad alta tensione. Nota: Rispettare le procedure di sicurezza elettrica durante il funzionamento dell&#39;elettronica alle alte tensioni utilizzate per questi esperimenti. </li><li> Al raggiungimento flusso costante, applicare la tensione desiderata alla frequenza desiderata. In questo esperimento, la tensione è 200 V RMS a frequenze comprese tra 5-60 kHz. </li><li> File video registrazione della risposta cellulare con tecniche di elaborazione di immagini (step 5) quantificare distribuzione di celle nel canale e per caratterizzare la frequenza di crossover. Per fare questo,mantenere una tensione costante e variare la frequenza sistematicamente. All&#39;inizio e alla fine dell&#39;esperimento, così come in modo casuale tra prove sperimentali, registrare la distribuzione delle cellule di controllo, la distribuzione delle cellule senza applicare alcun campo elettrico. Stimare la quantità di tempo necessario per le cellule di fluire dall&#39;ingresso al luogo sorvegliato (qui, 5 min). Dopo aver impostato una nuova frequenza, attendere questo periodo di tempo, quindi iniziare la registrazione (qui, a 2 min video della distribuzione di celle). </li></ol> 5. Image Processing per la caratterizzazione Frequenza di crossover <ol><li> Utilizzo di uno script di calcolo, analizzare ciascun fotogramma per fotogramma per determinare la y-posizione relativa (dove la direzione z è la profondità verticale del canale, la direzione y è la larghezza del canale, e direzione x è la lunghezza di canale) di ogni cella fluorescenti o particelle in un determinato coordinata x valle della regione di alta forza DEP nel canale. Creare un grafico dei relativi displaycontributo. </li><li> Confrontare la linea centrale della distribuzione ad ogni tensione e frequenza con la linea centrale della distribuzione controllo. Per una data tensione e frequenze variabili, determinare la frequenza di taglio, in cui la linea centrale corrisponde alla posizione y del controllo. </li></ol> 6. Variando la Esperimento per effettuare una cernita cellulare o arricchimento <ol><li> Sospendere miscela desiderata in tampone DEP in concentrazione totale di 3 x 10 6 particelle / ml. Ecco, questa miscela è cellule MOSE-L con 4 perline micron fluorescenti nel buffer DEP. Eseguire i passaggi descritti in precedenza per preparare un dispositivo CDEP. </li><li> Per ordinare o arricchire cellule da una miscela, determinare le frequenze di taglio delle cellule bersaglio e le particelle di sfondo come precedentemente descritto. Azionare l&#39;esperimento ad una frequenza tra le due frequenze di taglio delle cellule bersaglio e le particelle di fondo in modo che le due popolazioni di particelle sperimentano forze DEP in fronte directions. Per ordinare le celle MOSE-L e 4 micron perline, azionare il Microdevice sopra 11.90 ± 0.63 kHz. la prima frequenza di crossover di cellule MOSE-L recentemente riportato da Salmanzadeh et al 33. </li><li> Per raccogliere il contenuto di un campione ordinato, rimuovere il tubo di uscita sulla raccolta volume bersaglio, mettendo un dito guanto sopra l&#39;apertura di uscita e delicatamente tirando sul tubo. Versare il volume bersaglio raccolto in un serbatoio per ulteriori analisi Nota:. Altri metodi di recupero di esempio potrebbero includere associare un serbatoio permanente al chip e la rimozione del campione dalla semplice pipettaggio. </li></ol>

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Dr. Rafael Davalos ha un brevetto per contatto dielettroforesi.

DEP è una potente tecnica per determinare le proprietà dielettriche delle particelle e dirigere il movimento delle particelle verso l&#39;ordinamento delle applicazioni, di isolamento o di arricchimento. A causa degli effetti deleteri del contatto elettrodo diretto con un campione, altri hanno adottato approcci simili al metodo precedentemente presentato per evitare il contatto. Ad esempio, Bashir et al. Sviluppato dispositivi DEP senza contatto, utilizzando un dispositivo PDMS microfluidica separato dalla stampato elettrodi circuito da un vetrino di vetro sottile, e questa tecnica è anche reso disponibile in formato video. 23,36 Qui, abbiamo dimostrato la fabbricazione di un chip CDEP elettrodi e fluidici utilizzando un unico substrato PDMS, e il protocollo sperimentale per la separazione di cellule tumorali ovariche da una miscela di cellule e perline fluorescenti. La tecnica presentata è stata utilizzata con successo per una varietà di applicazioni più complesse e fisiologicamente rilevanti, inclusa la cernita livE e cellule morte, 28 tumore avviare cellule da cellule di carcinoma della prostata, 30 cellule tumorali da diluite globuli rossi, 31,32 e differenziare tra stadi del cancro 37 e cancro ovarico. 29 CDEP stato anche utilizzato per la miscelazione di particelle. 38 Fra applicazioni suggeriscono che utilizzando la tecnica semplice presentato, scopi diversi può essere realizzato semplicemente modificando il disegno della geometria del canale. . DEP è utile su microscala per la manipolazione di particelle 13 per particelle sferiche, la forza dielettroforetica traslazionale dipende dalle proprietà elettriche e dimensioni della particella e il suo mezzo di sospensione, così come il gradiente del campo elettrico quadrato: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> dove ε m è la permittività del mezzo di sospensione, r è il raggiodella particella, e Rc [k (ω)] è la parte reale del fattore di Clausius-Mossotti (CM). Il fattore CM è una misura della relativa polarizzabilità della particella rispetto al mezzo di sospensione e determina la direzione della forza dielettroforetica. È descritto come <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> dove <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> e <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> sono i complessi permittività della particella e mezzo, rispettivamente. La permettività complessa, <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , Dipende dalla conducibilità (σ) e frequenza (ω). Il fattore CM di particelle sferiche è teoricamente vincolata tra -0.5 e 1. Se il fattore CM è negativa, le particelle si NDEP perché il mezzo è più polarizzabile di particella, così le particelle si muovono distanti regionielevati gradienti di campo elettrico. Se il fattore CM è positivo, le particelle sono più polarizzabile di medio e sperimentano PDEP in cui si muovono verso regioni di alta gradienti di campo elettrico. Per particelle biologiche che sono non omogenea nella struttura, come le cellule, il fattore di Clausius-Mossotti può essere determinato da un valore effettivo della permittività particella: <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> dove <img alt="Equazione 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> e <img alt="Equazione 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> sono la permettività complessa dell&#39;effettiva permettività complessa dell&#39;interno della cellula, come il citoplasma, e la membrana plasmatica, rispettivamente. r è il raggio della cella, e d è lo spessore della membrana plasmatica 26 Quando DEP verifica con particelle sospese in unfluido, il moto della particella relativa al fluido genera una forza di trascinamento sulla particella. Questa forza di resistenza deve essere considerato nel determinare la forza complessiva che agisce sulla particella. Per le situazioni di interesse qui, forze viscose dominano e le particelle sono assunti sferico, piccolo, e si muove con velocità relativamente bassa, quindi trascinare la legge di Stokes &#39;fornisce una buona approssimazione della forza di trascinamento: <img alt="Equazione 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> dove η è la viscosità del fluido, p u è la velocità della particella, e u f è la velocità del fluido, che può anche essere in movimento. Data la forza dielettroforetica, fluido e le proprietà delle particelle noto, e una velocità di flusso noto, l&#39;equilibrio tra la forza di resistenza e la forza dielettroforetica può essere risolto per stimare la velocità delle particelle. Il gradiente di velocità che l&#39;esperienza celle deve essere inferiore alla soglia alla quale cell lisi può accadere. Caratterizzazione delle proprietà elettriche delle particelle è necessario prevedere e controllare come risponderà sotto DEP loro. In questo lavoro, in particolare utilizzato i CDEP bassa frequenza con celle MOSE-L per dimostrare il protocollo per la determinazione prima frequenza di crossover delle cellule, e quindi mostrato smistamento continuo di perle di polistirene e cellule MOSE-L in base alle loro risposte DEP opposte. Alterare la geometria del dispositivo CDEP cambierà i gradienti spaziali del campo elettrico, consentendo ai dispositivi di essere progettati per alta frequenza oa bassa frequenza, e per alta selettività ed efficienza di selezione, per un tipo cellulare specificato. Inoltre, i dispositivi high throughput possono essere sviluppate fabbricando canali più ampi, 30 canali in parallelo, 30 o di fabbricazione multistrato 35, in cui i canali degli elettrodi sono impilati verticalmente sopra e sotto una relativamente profondacanale del campione. Sottili membrane formano la barriera tra strati. Un saggio preliminare con i dispositivi fabbricati in polimetilmetacrilato (PMMA) e policarbonato (PC) film sottili hanno dimostrato risposta DEP di cellule MOSE-L. Gli attuali sforzi sono in corso per definire dispositivi high-throughput multi-strato e di migliorare il sistema periferico verso un eventuale piattaforma plug-and-play. Per espandere dalla tecnica sperimentale di base presentati, le applicazioni e le specifiche del dispositivo possono essere personalizzati per soddisfare esigenze particolari, come l&#39;ordinamento contro la caratterizzazione, o l&#39;aggiunta di serbatoi campione e un sistema semi-automatico al dispositivo.

Arricchimento campione biologico e la cernita delle particelle è spesso necessario per successive analisi. 1 Ad esempio, l&#39;isolamento di cellule rare da fluidi corporei ha importanti applicazioni nella rilevazione del cancro e la medicina individualizzata. 2,3 Le tecniche di arricchimento più comunemente utilizzate sono fluorescenti cellule attivate (FACS ) 4 e magnetici delle cellule attivate ordinamento (MACS), 5 che si basano su marcatori di superficie espressi per differenziare le cellule. Altre strategie includono idrodinamico 6 o inerziale 7,8 smistamento, pinzette ottiche, acoustophoresis 9, 10 e dielettroforesi. 11,12 dielettroforesi è il movimento di una particella polarizzata in presenza di un campo elettrico non uniforme. DEP 13 è stato usato per una vasta gamma di applicazioni, comprese le cellule 2,14 smistamento basate sulla vitalità, 15 caratterizzare le proprietà bioelettriche delle cellule, 16 e listerata anche con cambiamenti indotti nelle proprietà biofisiche di cellule. 17,18 tradizionale DEP utilizza elettrodi planari modellata all&#39;interno di un canale microfluidica per applicare una tensione ed indurre una non uniforme campo elettrico. 13 Mentre questa è una tecnica potente, sfide possono derivare, ad esempio elettrodo di delaminazione ed elettrolisi. Dielettroforesi base isolante (IDEP) 19 ha affrontato le sfide di incrostazione, elettrodo delaminazione, e il degrado spaziale del campo dell&#39;elettrodo attraverso patterning strutture isolanti che inducono disuniformità in un campo elettrico DC. IDEP è stato usato per separare selettivamente cellule di batteri vivi e morti, 19 isolare spore batteriche, 20 e manipolare il DNA, 21 tra altre applicazioni. Riscaldamento Joule può essere una sfida perché può verificarsi come risultato delle tensioni continue elevate spesso richiesti. Per migliorare queste sfide, sono state sviluppate senza contatto microdispositivi DEP. 22-24 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La tecnica qui presentata utilizza contactless dielettroforesi (CDEP), così chiamata per la mancanza di un contatto diretto tra gli elettrodi metallici e il canale del campione 22. Unico a questa strategia è la sostituzione di elettrodi metallici con canali elettrodi pieno di liquido con una soluzione altamente conduttivo. Questi elettrodi fluido sono accoppiati capacitivamente attraverso una sottile barriera isolante al canale campione tramite una tensione alternata. Eliminando il contatto del campione con gli elettrodi riduce le questioni connesse con metodi basati-DEP come l&#39;elettrolisi e la formazione di bolle, la contaminazione del campione, e l&#39;elettrodo delaminazione. Come risultato, CDEP è particolarmente utile per i campioni biologici perché supporta la vitalità delle cellule nel campione. Importante, CDEP in grado di mantenere la sterilità del campione. Un chip può essere preparato in una cappa di coltura cellulare e l&#39;esperimento può essere condotto senza richiedere contatto campione di elettrodi metallici o richiede che il campione sia aperta al environment. Un semplice serbatoio può essere fissato alla presa chip per agevolare il recupero del campione sterile. Inoltre, la fabbricazione di elettrodi fluido dallo stesso materiale polimerico biocompatibile (PDMS) come il canale del campione riduce l&#39;alto costo sostenuto con patterning personalizzata di elettrodi metallici, il tempo richiesto per la fabbricazione, e limita la necessità di attrezzature specializzate camera sterile al patterning iniziale del timbro riutilizzabile wafer di silicio. Movimento di particelle dovute DEP dipende dalle caratteristiche della particella e il mezzo, così come i gradienti spaziali del campo elettrico. Una particella-e dipendente dalla frequenza fattore, chiamato fattore Clausius-Mossotti (CM), assume un valore compreso -0.5 a 1, e determina la direzione della forza DEP. La frequenza con cui il fattore CM è esattamente zero viene chiamata frequenza di crossover. Questo è il punto in cui nessuna forza dielettroforetica è esercitata su una particella e il segno variazioni del fattore CM. A single frequenza di crossover per microsfere solidi inerti si verifica quando il fattore CM cambia da negativo a positivo 25 Per le cellule di mammifero in tampone conducibilità bassa dell&#39;ordine di 0,01 S / m, una prima frequenza di crossover che indica una transizione da NDEP a PDEP esiste vicino a 10. - 100 kHz, ed è influenzato dalle dimensioni, forma, citoscheletro, e proprietà di membrana della cellula. 26,27 A seconda frequenza di crossover a un passaggio dal PDEP a regime NDEP è dell&#39;ordine di 10 MHz, ed è influenzata dalla rapporto nucleo-citoplasma, citoplasma conducibilità, e reticolo endoplasmatico. forza DEP 27 può essere applicato senza la presenza di flusso di fluido, ma qui si utilizza un fluido che scorre per raggiungere smistamento continuo di particelle sospese. L&#39;influenza combinata della forza dielettroforetica e il Stokes &#39;forza di trascinamento dettare la traslazione di una particella. Abbiamo sviluppato sistemi atti ad azionare in due gamme di frequenza. Frequenc Superioredispositivi y (100-600 kHz) hanno operato utilizzando PDEP e smistamento lotto realizzato delle cellule, come le cellule tumorali della prostata avvio (tic), ovarico epiteliale di superficie (MOSE), le cellule murine, MDA-MB-231 cellule del cancro al seno, o vivere THP -1 cellule selettivamente intrappolando cellule di interesse sui posti situati nel canale del campione isolante. 28-31 di frequenza inferiore (5-100 kHz) dispositivi funzionano continuamente, e quando si opera ad una frequenza alla quale una popolazione sperimenta PDEP mentre i precedenti esperienze di popolazione NDEP, può reindirizzare traiettorie delle particelle per ottenere l&#39;ordinamento. 32-34 Questi dispositivi a bassa frequenza sono stati utilizzati per ordinare le cellule tumorali da globuli rossi, determinare le variazioni delle proprietà dielettriche di una linea cellulare MOSE progressiva, e per chiarire gli effetti della non- trattamenti sfingolipidi tossici su invertendo le caratteristiche aggressive delle cellule MOSE aggressivi. Inoltre, microdispositivi CDEP possono essere progettati per funzionare ad una maggiore velocità, attualmente fino a 1 ml / hr. 31,35 Come descritto, la flessibilità e basso costo del processo di fabbricazione permette geometrie dei dispositivi su misura, che permettono la procedura sperimentale presentato sia rilevante per una vasta gamma di applicazioni. L&#39;obiettivo a lungo termine di CDEP è quello di realizzare label-free cell sorting e di arricchimento sul piano clinico, con il recupero del campione per la successiva cultura o la trasformazione. La tecnica qui presentata è un metodo semplice e poco costoso, dalla fabbricazione di sperimentazione, che aumenta l&#39;accessibilità di DEP. Dimostriamo la preparazione di un chip CDEP e il protocollo sperimentale per ottenere caratterizzazione e arricchimento delle cellule tumorali ovariche di microsfere fluorescenti.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

Dielettroforesi (DEP) è il fenomeno per cui polarizzati particelle in un campo elettrico non uniforme subiscono traslazione, e può essere usato per dirigere il movimento di microparticelle in un marcatore indipendente maniera superficie. Tradizionalmente, i dispositivi DEP includono elettrodi metallici planari fantasia nel canale del campione. Questo approccio può essere costoso e richiede ambienti sterili specializzato. Recentemente, è stato sviluppato un approccio senza contatto chiamato dielettroforesi contactless (CDEP). Questo metodo utilizza il principio classico della DEP evitando il contatto diretto tra elettrodi e campione patterning elettrodi fluidici e un canale di esempio da un&#39;unica polidimetilsilossano (PDMS) substrato, e ha un&#39;applicazione come strategia microfluidica rapido progettata per ordinare e arricchire microparticelle. Unico a questo metodo è che il campo elettrico viene generato tramite canali elettrodi fluidici contenenti un fluido altamente conduttivo, che sono separati dalcanale del campione da una barriera isolante sottile. Perché elettrodi metallici non contattare direttamente il campione, l&#39;elettrolisi, l&#39;elettrodo delaminazione, e la contaminazione del campione sono evitati. Inoltre, ciò consente un processo di fabbricazione poco costoso e semplice. CDEP è quindi particolarmente adatto per la manipolazione di particelle biologiche sensibili. La forza dielettroforetica agisce sulle particelle dipende non solo su gradienti spaziali del campo elettrico generato da disegno personalizzabile della geometria del dispositivo, ma le proprietà biofisiche intrinseche della cella. Come tale, CDEP è una tecnica priva di etichetta che evita a seconda biomarcatori molecolari-superficie espressa che possono essere variamente espresse all&#39;interno di una popolazione, pur consentendo la caratterizzazione, l&#39;arricchimento, e smistamento di bioparticelle. Qui, dimostriamo le basi di fabbricazione e sperimentazione utilizzando CDEP. Spieghiamo la semplice preparazione di un chip CDEP con litografia sofficetecniche di y. Discutiamo la procedura sperimentale per la caratterizzazione frequenza di incrocio di una particella o cella, la frequenza alla quale la forza dielettroforetica è zero. Infine, dimostriamo l&#39;uso di questa tecnica per l&#39;ordinamento di una miscela di cellule di cancro ovarico e fluorescenti microsfere (sfere).

DEP deve osservare qualitativamente nel canale del campione per confermare il dispositivo è in funzione quando il campo elettrico è presente. Un metodo per verificare la presenza di DEP è quello di regolare la frequenza di valori lontana dalla frequenza di crossover dove forte PDEP e NDEP sono previsti (circa&gt; 40 kHz osservare PDEP e &lt;10 kHz osservare NDEP per la maggior parte delle cellule tumorali di mammifero in un buffer con conducibilità di 100 mS / cm). Va notato che le microsfere inerti presentano PDEP sotto della loro frequenza di crossover e NDEP sopra loro frequenza di crossover. Per la funzione geometria dente di sega qui presentato, PDEP dovrebbe essere visto per le cellule alla frequenza di prova più elevata, indicata dal verificarsi di perla concatenamento e focalizzazione delle cellule o particelle alla caratteristica bordo a dente di sega del canale, mentre alla frequenza di prova inferiore, NDEP dovrebbe essere evidente come le cellule sono limitate alla regione più vicina al bordo diritto del canale. A queste basse frequenze, le cellule possono LYSe causa di elettroporazione, in modo che il campione può sembrare che contenga meno cellule, e quelli che sono visibili potrebbero apparire allargata o sfocate se si utilizza un colorante fluorescente enzimaticamente attiva. Verifica delle frequenze alle quali PDEP e NDEP verificano permette la determinazione della frequenza di taglio come descritto nel protocollo. Per le cellule tumorali di mammifero, come MOSE-L usato qui, abbiamo osservato NDEP a 5 kHz (figura 5a) e forte PDEP a 60 kHz (Figura 5b). Cellule MOSE-L aveva un diametro di 17,7 ± 3,3 micron (n = 268 cellule) e le perle hanno un diametro nominale 4 micron. Un&#39;analisi completa delle proprietà dielettriche delle cellule MOSE-L rispetto alle cellule Mosè in precedenti fasi di progressione può essere trovato nel recente lavoro di Salmanzadeh et al 33. Se PDEP e NDEP non si attiene a questi estremi, vari problemi potrebbero essere accadendo. La conducibilità campione può essere troppo alta a causa contaminanti o lisi cellulare. INSUFFICIENTEcampo elettrico nt può essere generato a causa di bolle intrappolate nei canali elettrodi fluido, che impediscono conduzione di corrente alla porzione dei canali confinanti con il canale del campione. Moto vario può essere causato da una bolla intrappolata nella siringa o tubo di ingresso, bolle risultante dal non tenere il dispositivo sotto vuoto per un tempo sufficiente o non riempire rapidamente il dispositivo su rimozione dal vuoto, perdite dovute a delaminazione di PDMS scarsa aderenza con la vetrino, lacrime nella membrana di barriera a causa di forza eccessiva esercitata durante il riempimento dei canali, o portate agli estremi del campo di funzionamento della pompa. Oltre a determinare la frequenza di taglio di celle, questa tecnica può essere utilizzata per ordinare una miscela, illustrata qui da una miscela di cellule MOSE-L e perline. Questo esempio sfrutta la dielettroforesi negativa (NDEP) esibito da 4 micron sfere a frequenze dove le cellule MOSE-L sperimentano dielettroforesi positiva (PDEP). Siamo operated il dispositivo a 200 V RMS e 10 kHz (Fig. 6a) e hanno osservato che sia le cellule e perline sono state mescolate come hanno vissuto NDEP. A 50 kHz abbiamo osservato movimento delle cellule MOSE-L alla sommità del canale, mentre perle sono state limitate alla porzione inferiore del canale, consentendo la separazione della miscela in due componenti (Figura 6b). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> Figura 5. La posizione delle cellule MOSE-L viene manipolata variando la frequenza del campo elettrico applicato. Le foto sono prese alla funzione dente di sega finale del canale del campione e gli elettrodi fluidici sono situate agli angoli sul lato destro. Sono pieni di PBS contenente rodamina B, che reagisce di visualizzare i canali. (A) le cellule MOSE-L esperienza NDEP a 200 V RMS<html> e 5 kHz. (b) le cellule MOSE-L sperimentano concatenamento di perle e PDEP a 200 V RMS e 60 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> Figura 6. Una miscela di cellule MOSE-L (verde) e 4 micron perline (rosso) fluire attraverso la funzione dente di sega finale nel canale campione di un dispositivo CDEP bassa frequenza. (A) a 200 V e 10 kHz cellule e perline vengono miscelati. Le frecce indicano apparire vagamente cellule che probabilmente sono morti a causa delle condizioni di scarsa frequenza. (B) A 200 V e 50 kHz cellule sperimentano PDEP e si muovono verso il bordo caratteristica del canale, mentre perle di esperienza NDEP e rimangono confinati alla regione più vicina il regolo.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura.

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Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Contactless dielettroforesi (CDEP) realizza l&#39;ordinamento e l&#39;arricchimento delle particelle attraverso le loro intrinseche proprietà dielettriche. Canali elettrodi fluidici sostituire gli elettrodi metallici tradizionali per DEP, adattandosi CDEP per non danneggiare la caratterizzazione sterile e smistamento delle particelle biologiche. Dimostriamo come preparare un Microdevice CDEP e condurre la caratterizzazione delle cellule e sperimentazioni di ordinamento.

Isolamento privo di etichetta e di arricchimento delle cellule attraverso Contactless dielettroforesi

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.9K Views.  Virginia Tech.  Contactless dielettroforesi (CDEP) realizza l'ordinamento e l'arricchimento delle particelle attraverso le loro intrinseche proprietà dielettriche. Canali elettrodi fluidici sostituire gli elettrodi metallici tradizionali per DEP, adattandosi CDEP per non danneggiare la caratterizzazione sterile e smistamento delle particelle biologiche. Dimostriamo come preparare un Microdevice CDEP e condurre la caratterizzazione delle cellule e sperimentazioni di ordinamento....

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Ricerca

Medicina

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Arricchimento per chemioresistente Ovarian Cancer Stem Cells da linee cellulari umane

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

In Arricchimento vitro di Ovarian Cancer Cells-tumorali avvio

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali primarie dalle arterie e vene Canine

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...