Este trabajo ha sido apoyado apoyado en parte por la National Science Foundation con la subvención No. 0938047 EFRI, y por el Instituto de Tecnología de Virginia para entornos críticos de Tecnología y Ciencias Aplicadas (ICTAS). Los autores desean expresar su agradecimiento a la Dra. Eva Schmelz y el Dr. Paul Roberts por su amable donación de células MOSE-L. Los autores reconocen Angela Anderson por su ayuda en el cultivo de células, Caitlan Swaffar por su ayuda en la edición de este documento y la preparación de los experimentos, y todos los miembros del laboratorio Bioelectromechanical Systems.

1. La fabricación de un prototipo de dispositivo de microfluidos CDEP: Visión general <ol><li> Siga los procedimientos de informes anteriores 22 usando fotoprotector y Deep Reactive Ion Aguafuerte (DRIE) para grabar el diseño del canal deseado (Figura 1) en una oblea de silicio (Figura 2). Deposita una fina capa de teflón para mejorar la liberación del microdispositivo de la oblea. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de una frecuencia dispositivo de clasificación continua baja. Las muestras de canal corre de izquierda a derecha y es de 500 m de ancho, con constricciones de diente de sierra a 100 micras. Los dos pares de canales de electrodos de fluidos componen los electrodos de fuente y sumidero, respectivamente, y se separan del canal de muestra por una barrera de PDMS de espesor 20 micras. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> Figura 2. El fabrproceso de medicación de un dispositivo CDEP. (a) durante 60 segundos, la luz ultravioleta reacciona selectivamente con fotoprotector se expone a través de un modelo de máscara de la geometría del dispositivo CDEP. (b) Fotoresinas se elimina mediante desarrollador. (c) de Deep Reactive Ion Aguafuerte (DRIE) se utiliza para grabar 50 micras características profundas, y 5 min de grabado en húmedo por hidróxido de tetrametilamonio (TMAH) 25% a 70 ° C se utiliza para reducir la rugosidad en las paredes laterales. (d) un recubrimiento de Teflon se añade para mejorar la liberación del dispositivo la oblea. (e) de PDMS se vierte sobre la re-utilizable sello de la oblea después de la desgasificación y se curó durante 45 min a 100 ° F. (f) de PDMS se elimina de la oblea. PDMS y un portaobjetos de vidrio limpio se expusieron al plasma de aire durante 2 min y unidas entre sí. <ol start="2"><li> Envuelva la oblea con papel de aluminio para evitar que desborde. Mezclar polidimetilsiloxano (PDMS) en 10:1 de relación de elastómero a agente de curado, de-de gas durante aproximadamente 20 min, Y se vierte sobre la oblea. Calentar durante 45 minutos a 100 ° C para no dañar el recubrimiento de teflón de la estampilla. Deje que el dispositivo se enfríe. </li><li> Después de enfriar, retirar la lámina de aluminio, recortar PDMS utilizando una cuchilla quirúrgica, y perforar orificios de acceso en la entrada del canal / salida usando un golpeador romo adecuado para el tamaño de la tubería. Aquí, se utiliza un golpeador romo 1,5 mm. </li><li> Limpiar un portaobjetos de microscopio de vidrio utilizando un enjuague de agua y jabón, etanol, agua DI, y el secado con aire, respectivamente. Limpie el dispositivo de PDMS utilizando cinta Scotch Magic. Examinar al microscopio para asegurarse de canales están limpios. Exponga la diapositiva y el dispositivo de PDMS de plasma de aire durante 2 min. Presione firmemente lateral de canal de dispositivo para portaobjetos de vidrio, evitando la formación de burbujas de aire entre el dispositivo y la corredera (Figura 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> Figura 3. </stRong&gt; (a) La máscara utilizada para la fotolitografía durante la fabricación sello oblea de silicio, y (b) el dispositivo de PDMS-vidrio acabado con la muestra y canales de electrodos lleno de fluido con colorante verde y rojo, respectivamente. Consulte la Figura 1 para las dimensiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . 2. Preparación de una suspensión celular en DEP Buffer <ol><li> Preparar una baja conductividad (100 S / cm) de amortiguación, que se conoce como &quot;tampón DEP&quot; (8,5% de sacarosa [w / v], 0,3% de glucosa [w / v], 0,725% de RPMI [w / v]) . 16 </li><li> Suspender las células en tampón DEP en 3 x 10 6 células / ml. En este caso, se utilizan las células cancerosas de ratón de la última etapa del epitelio superficial del ovario (MOSE-L). </li></ol> Nota: el análisis de viabilidad de las células por el método de exclusión del colorante azul de tripano mostraron una ligera disminución en la viabilidad(95,1 a 91,6%) de las células en fase inicial MOSE (MOSE-E) suspendidas en tampón DEP a temperatura ambiente después de 5 horas. Se prevé que una ligera disminución similar en la viabilidad de las células se produce para MOSE-L, lo que indica que las células no se deben almacenar en DEP tampón a largo plazo. <ol start="3"><li> Dye células utilizando un colorante fluorescente membrana permeable, tal como el enzimáticamente activado calceína-AM. </li><li> Medir la conductividad de la suspensión celular teñida. La conductividad debe ser de aproximadamente 100 S / cm. Si la medición de la conductividad es demasiado alta, girar la muestra hacia abajo, volver a suspender en tampón DEP en 3 x 10 6 células / ml y repetir la medición de la conductividad. </li></ol> 3. Carga del CDEP microfluidos chip <ol><li> Coloque el chip microfluídico bajo vacío durante 30 min. </li><li> Mientras tanto, cortar un trozo de tubo flexible para cubrir la distancia de la bomba de jeringa a la platina del microscopio en el que se encuentra el chip microfluídico. Aquí, una longitud de 6 pulgadas de tubose requiere. Tubos Fit a la aguja de punta en la jeringa. </li><li> Estimar la longitud requerida para el tubo de salida dividiendo el volumen de la muestra recogida de destino por el área de sección transversal del tubo. Cortar los requieren tramo de tubo. </li><li> Dibuje suspensión celular en la jeringa. Comprobar que no hay burbujas se encuentran en el tubo o una jeringa. </li><li> Al retirar el chip de vacío, inserte el tubo de salida y el primer canal de la muestra rápidamente para evitar las burbujas de aire atrapadas en los canales. Golpee suavemente la jeringa durante el purgado para evitar la ruptura de la delgada (20 micras) de barrera de aislamiento, aunque se ha observado que la barrera puede resistir un alto rendimiento constante cerca de 5 ml / hora sin romperse. </li><li> Para los primeros canales de electrodos, coloque rápidamente puntas de pipeta vacías en una salida de cada canal de electrodo de fluidos. Pipetear 200 l de PBS que contienen una pequeña cantidad de rodamina B y golpear suavemente para introducir el líquido en el extremo opuesto del canal de electrodo. Mantener una presión suavehasta PBS con rodamina B visiblemente avanza hasta la punta de la punta de la pipeta vacía. Repita el procedimiento para cada canal del electrodo. Rodamina B se utiliza sólo para visualizar fluorescentemente los canales de electrodos de fluidos. </li><li> Después del cebado, llene cada depósito de puntas de pipeta con PBS con rodamina B. Evite la formación de burbujas en los embalses de punta de la pipeta, y eliminar cualquier burbuja visible pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Separe el tubo de salida y desechar apropiadamente, a continuación, insertar un tubo de salida del depósito fresco para recoger el volumen de destino. </li></ol> 4. Caracterización de Frecuencia de cruce de las células utilizando CDEP chip <ol><li> Coloque el chip sobre el escenario de un microscopio invertido equipado con cámara digital (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> Figura 4. </strong&gt; (a) montaje experimental general para experimentos CDEP. El chip CDEP se encuentra en la plataforma de la microscopio invertido. Una cámara envía imágenes a la computadora para la grabación. La bomba de jeringa mantiene un flujo de entrada constante. El generador de función genera una señal que se intensificó por el amplificador de alta tensión y conectado al chip CDEP mediante electrodos de alambre. El osciloscopio monitoriza la señal enviada al chip. (B) Vista detallada del chip CDEP y las conexiones de fluidos y electrónicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol start="2"><li> Montar la jeringa en la bomba de jeringa e insertar electrodos de alambre en los depósitos de canal electrodo de fluidos. </li><li> Bomba de fluido a través de al 1 ml / h para asegurar un buen contacto entre la bomba de jeringa y la jeringa. Inspeccione visualmente la longitud del canal para asegurar un flujo sin trabas de las células y la ausencia de burbujas o fugas. Rojotasa de flujo UCE a 0.005 ml / h. Nota: Rendimiento tan alto como 31,35 1 ml / h se ha logrado en los dispositivos de otras geometrías. </li><li> Por razones de seguridad, probar la electrónica por encender el generador de funciones, amplificador de alta tensión, y el osciloscopio, y el ajuste a la tensión y la frecuencia deseada. Aquí estos parámetros son 200 V y 20 kHz. Sobre la verificación de rendimiento aceptable, el suministro de energía. Conecte los electrodos a un amplificador de alto voltaje. Nota: los procedimientos de seguridad eléctricas apropiado al operar el sistema electrónico a los altos voltajes usados ​​para estos experimentos. </li><li> Sobre la realización de flujo constante, aplicar la tensión deseada en la frecuencia deseada. En este experimento, el voltaje es de 200 V de valor eficaz a frecuencias de entre 5-60 kHz. </li><li> Archivos de vídeo sin precedentes de la respuesta de las células con las técnicas de procesamiento de imágenes (paso 5) para cuantificar la distribución de células en el canal y para caracterizar la frecuencia de cruce. Para ello,mantener un voltaje constante y variar la frecuencia sistemáticamente. Al principio y al final del experimento, así como al azar entre las corridas experimentales, registrar la distribución de células de control, la distribución de las células sin aplicar ningún campo eléctrico. Estimar la cantidad de tiempo necesario para que las células fluyen desde la entrada a la ubicación monitorizada (aquí, 5 min). Después de establecer una nueva frecuencia, esperar esta cantidad de tiempo, a continuación, comenzar a grabar (aquí, un video de 2 min de la distribución de células). </li></ol> 5. Procesamiento de imágenes para caracterizar Frecuencia de cruce <ol><li> Uso de una secuencia de comandos de cálculo, analizar cada vídeo fotograma a fotograma para determinar la posición relativa y (donde la dirección z es la profundidad vertical del canal, la dirección y es la anchura del canal, y la dirección x es la longitud del canal) de cada célula fluorescente o partícula en un especificado coordenada x aguas abajo de la región de alta fuerza de DEP en el canal. Crear un gráfico de los dis relativosbución. </li><li> Comparar la línea central de la distribución en cada voltaje y la frecuencia con la línea central de la distribución de control. Para una tensión dada y frecuencias variables, determinar la frecuencia de cruce, donde la línea central coincide con el Y-posición del control. </li></ol> 6. Variando el experimento para realizar la clasificación de células o de Enriquecimiento <ol><li> Suspender mezcla deseada en tampón DEP a una concentración total de 3 x 10 6 partículas / ml. Aquí, en esta mezcla es células MOSE-L con 4 bolas fluorescentes micras en tampón DEP. Lleve a cabo los pasos descritos anteriormente para preparar un dispositivo CDEP. </li><li> Para ordenar o enriquecer las células a partir de una mezcla, determinar las frecuencias de corte de las células objetivo y las partículas de fondo descritos como anteriormente. Haga funcionar el experimento a una frecuencia entre las dos frecuencias de corte de las células diana y las partículas de fondo para que las dos poblaciones de partículas experimentan fuerzas DEP en d opuestoirections. Para ordenar las células MOSE-L y 4 micras cuentas, hacer funcionar el microdispositivo arriba 11.90 ± 0.63 kHz. la primera frecuencia de cruce de las células MOSE-L reportado recientemente por Salmanzadeh et al. 33 </li><li> Para recoger el contenido de una muestra ordenada, retire el tubo de salida a recoger el volumen de destino, mediante la colocación de un dedo de guante sobre la abertura de salida y tirando suavemente en el tubo. Vierta el volumen blanco recogido en un depósito para su posterior análisis Nota:. Otros métodos de recuperación de la muestra podrían incluir la fijación de un depósito permanente al chip y la eliminación de la muestra mediante una simple pipeta. </li></ol>

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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+contactless+dielectrophoresis:+Theoretical+considerations.">Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations.</a> Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).</li><li>Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+beads+and+cells+in+multi-channel+microfluidic+devices+using+dielectrophoresis+and+laminar.">Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar.</a> J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).</li><li>Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis.">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis.">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li></ol>

Dr. Rafael Dávalos tiene una patente pendiente para dielectroforesis sin contacto.

DEP es una técnica poderosa para determinar las propiedades dieléctricas de las partículas y la dirección de movimiento de las partículas hacia aplicaciones de clasificación, de aislamiento, o de enriquecimiento. Debido al efecto perjudicial de contacto del electrodo directa con una muestra, otros han adoptado enfoques similares para el método presentado previamente para evitar el contacto. Por ejemplo, Bashir et al. Desarrollado dispositivos DEP sin contacto mediante el uso de un dispositivo de microfluidos PDMS separados de electrodos de placas de circuitos impresos por un cubreobjetos de cristal fino, y esta técnica también se encuentra disponible en formato de vídeo. 23,36 Aquí, hemos demostrado la fabricación de un chip de CDEP y electrodos de fluidos usando un único sustrato de PDMS, y el protocolo experimental para la separación de células de cáncer de ovario a partir de una mezcla de células y perlas fluorescentes. La técnica presentada ha sido utilizado con éxito para una variedad de aplicaciones más complejas y fisiológicamente relevantes, incluida la selección LivE y células muertas, 28 tumor de células iniciadoras de células de cáncer de próstata, 30 células cancerosas de las células rojas de la sangre diluidas, 31,32 y diferenciar entre las etapas del cáncer de mama y cáncer de ovario 37. 29 CDEP también ha sido utilizado para mezclar partículas. 38 Estos aplicaciones sugieren que mediante el uso de la técnica simple presentado, diversos propósitos se pueden lograr simplemente alterando el diseño de la geometría del canal. . DEP es útil en la microescala para la manipulación de partículas de 13 Para partículas esféricas, la fuerza dielectroforética de traslación depende de las propiedades de tamaño y eléctricas de la partícula y de su medio de suspensión, así como el gradiente del campo eléctrico al cuadrado: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> donde ε m es la permitividad del medio de suspensión, r es el radiode la partícula, y Rc [K (ω)] es la parte real del factor de Clausius-Mossotti (CM). El factor de CM es una medida de la polarizabilidad relativa de la partícula en comparación con el medio de suspensión y determina la dirección de la fuerza dielectroforética. Se describe como <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> donde <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> y <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> son los complejos permitividades de la partícula y medio, respectivamente. La permitividad compleja, <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , Depende de la conductividad (σ) y la frecuencia (ω). El factor de CM de partículas esféricas está obligado teóricamente entre -0,5 y 1. Si el factor de CM es negativa, las partículas experimentan nDEP porque el medio es más polarizable que la partícula, por lo que las partículas se mueven lejos de las regiones dealtos gradientes de campo eléctrico. Si el factor de CM es positiva, las partículas son más polarizable que el medio y que experimentan pDEP en el que se mueven hacia regiones de altos gradientes de campo eléctrico. Para partículas biológicas que son no homogénea en la estructura, tales como células, el factor de Clausius-Mossotti se puede determinar a partir de un valor efectivo para la permitividad de partícula: <img alt="Ecuación 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> donde <img alt="Ecuación 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> y <img alt="Ecuación 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> son la permitividad compleja de la permitividad compleja efectiva del interior de la célula, tales como el citoplasma, y la membrana de plasma, respectivamente;. r es el radio de la célula, y d es el espesor de la membrana de plasma de 26 Cuando DEP se produce con partículas suspendidas en unde fluido, el movimiento de la partícula en relación con el fluido va a generar una fuerza de arrastre sobre la partícula. Esta fuerza de arrastre debe ser considerado al determinar la fuerza total que actúa sobre la partícula. Para las situaciones de interés aquí, las fuerzas viscosas dominan y las partículas se supone esférica, pequeña, y se mueve con una velocidad relativamente baja, por lo que la ley de arrastre de Stokes proporciona una buena aproximación de la fuerza de arrastre: <img alt="Ecuación 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> donde η es la viscosidad del fluido, u p es la velocidad de la partícula, y U f es la velocidad del fluido, que también puede estar en movimiento. Dada la fuerza dielectroforética, de fluido y propiedades de las partículas conocido, y una velocidad de flujo conocida, el equilibrio entre la fuerza de arrastre y la fuerza dielectroforética se puede resolver para estimar la velocidad de la partícula. La velocidad de cizallamiento que la experiencia de células debe estar por debajo del umbral en el que Cell lisar puede ocurrir. Caracterización de las propiedades eléctricas de las partículas es necesario para predecir y controlar cómo van a responder bajo DEP ellos. En este trabajo, se utilizó específicamente bajo CDEP frecuencia con células MOSE-L para demostrar el protocolo para determinar primero la frecuencia de cruce de las células y, a continuación mostramos la clasificación continua de perlas de poliestireno y células MOSE-L sobre la base de sus respuestas opuestas DEP. La alteración de la geometría del dispositivo de CDEP cambiará los gradientes espaciales del campo eléctrico, permitiendo que los dispositivos a ser diseñados para funcionamiento a baja frecuencia o de alta frecuencia, y para alta selectividad y eficiencia de la clasificación de un tipo de célula especificada. Además, los dispositivos de alto rendimiento se pueden desarrollar mediante la fabricación de canales más anchos, 30 canales en paralelo, 30 o por la fabricación de múltiples capas 35, en el que los canales de electrodos se apilan verticalmente por encima y por debajo de un relativamente profundacanal de muestra. Membranas delgadas forman la barrera entre las capas. Las pruebas preliminares realizadas con dispositivos fabricados en polimetilmetacrilato (PMMA) y policarbonato (PC) películas delgadas han demostrado respuesta DEP de células MOSE-L. Los esfuerzos actuales se están realizando para perfeccionar los dispositivos de alto rendimiento de varias capas y mejorar el sistema periférico hacia una plataforma plug-and-play eventual. Para ampliar de la técnica experimental básica presentada, las aplicaciones y especificaciones del dispositivo se pueden adaptar para adaptarse a las demandas particulares, tales como la clasificación frente a la caracterización, o la adición de depósitos de muestras y un sistema semi-automatizado para el dispositivo.

Enriquecimiento de la muestra biológica y la clasificación de partículas es a menudo necesaria para su posterior análisis. 1 Por ejemplo, el aislamiento de células raras de los fluidos del cuerpo tiene importantes aplicaciones en la detección del cáncer y la medicina individualizada. 2,3 Las técnicas de enriquecimiento más utilizados son de células activadas por fluorescencia (FACS ) 4 y magnético de células activadas por la clasificación (MACS), 5 que confiar en los marcadores de superficie expresadas para diferenciar células. Otras estrategias incluyen hidrodinámico 6 o inercial 7,8 clasificación, pinzas ópticas, 9 acoustophoresis, 10 y dielectroforesis. 11,12 dielectroforesis es el movimiento de una partícula polarizado en presencia de un campo eléctrico no uniforme. 13 DEP se ha utilizado para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo 2,14 células de clasificación sobre la base de la viabilidad, 15 la caracterización de las propiedades bioeléctricas de células, 16 y especieción de los cambios inducidos en las propiedades biofísicas de las células. 17,18 tradicional DEP utiliza electrodos planos modelados dentro de un canal microfluídico para aplicar un voltaje e inducir una no uniforme del campo eléctrico. 13 Mientras que esta es una técnica de gran alcance, pueden surgir problemas, tales como delaminación electrodo y la electrólisis. Dielectroforesis basado aislante (idep) 19 ha abordado los retos de ensuciamiento, la delaminación del electrodo, y la degradación espacial del campo electrodo a través de estructuras aislantes de modelado que inducen no uniformidades en un campo eléctrico de corriente continua. idep se ha utilizado para separar selectivamente las células de bacterias vivas y muertas, 19 aislar las esporas bacterianas, ADN y manipular 20, 21 entre otras aplicaciones. Calentamiento Joule puede ser un desafío, ya que puede ocurrir como resultado de los altos voltajes de CC a menudo requeridos. Para paliar estos problemas, se han desarrollado microdispositivos DEP sin contacto. 22-24 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La técnica que aquí se presenta utiliza sin contacto dielectroforesis (CDEP), llamado así por la falta de contacto directo entre los electrodos metálicos y el canal de muestra. 22 Exclusivo de esta estrategia es la sustitución de los electrodos metálicos con canales de electrodos llenos de fluidos una solución altamente conductor. Estos electrodos de fluido están acoplados capacitivamente a través de una barrera aislante delgada en el canal de muestra a través de una tensión de CA. Eliminando el contacto de la muestra con electrodos reduce los problemas asociados con los métodos basados ​​en el DEP, como la electrólisis y la formación de burbujas, contaminación de la muestra, y la delaminación del electrodo. Como resultado, CDEP es especialmente útil para las muestras biológicas, ya que soporta la viabilidad de las células en la muestra. Es importante destacar que, CDEP puede mantener la esterilidad de la muestra. Un chip se puede preparar en una campana de cultivo de células y el experimento se puede realizar sin necesidad de ponerse en contacto con la muestra a los electrodos de metal o que requieren que la muestra sea abierto a la environment. Un depósito simple puede ser fijado a la salida de chip para facilitar la recuperación de la muestra estéril. Además, la fabricación de electrodos de fluido desde el mismo material polímero biocompatible (PDMS) como el canal de muestra reduce el alto coste incurrido con los patrones de encargo de electrodos de metal, el tiempo requerido para la fabricación, y limita la necesidad de equipo especializado para sala limpia el patrón inicial del sello reutilizable oblea de silicio. Movimiento de partículas debido a DEP depende de las características de la partícula y el medio, así como los gradientes espaciales del campo eléctrico. Una partícula-y dependiente de la frecuencia del factor, llamado el factor de Clausius-Mossotti (CM), toma un valor en el rango de -0,5 a 1, y determina la dirección de la fuerza DEP. La frecuencia a la que el factor de CM es exactamente cero se denomina la frecuencia de cruce. Este es el punto en el que ninguna fuerza dielectroforética que se ejerce sobre una partícula y el signo de los cambios del factor de CM. Un sIngle frecuencia de cruce para microesferas sólidas inertes se produce cuando el factor de CM cambios de negativo a positivo 25 Para las células de mamífero en un tampón de baja conductividad del orden de 0,01 S / m, una primera frecuencia de cruce que indica una transición de nDEP a pDEP existe cerca de 10. - 100 kHz, y está influenciado por el tamaño, forma, citoesqueleto, y propiedades de la membrana de la célula. 26,27 Una segunda frecuencia de cruce en un cambio de la pDEP al régimen de nDEP es del orden de 10 MHz, y está influenciado por la relación núcleo-citoplasma, conductividad citoplasma y retículo endoplasmático. 27 fuerza DEP puede aplicarse sin la presencia de flujo de fluidos, pero aquí utilizan un fluido en movimiento para lograr la clasificación continua de partículas en suspensión. La influencia combinada de la fuerza dielectroforética y fuerza de arrastre de Stokes dicta el movimiento de traslación de una partícula. Hemos desarrollado dispositivos para la operación en dos rangos de frecuencia. Frequenc Superiordispositivos de Y (100-600 kHz) han operado utilizando pDEP y ha logrado la clasificación de lotes de células, como las células de tumor de próstata que inician (TICs), células epiteliales murinas superficial del ovario (MOSE), MDA-MB-231 células de cáncer de mama, o en vivo THP -1 células por atrapar selectivamente las células de interés en los postes ubicados en el canal de muestra aislante. 28-31 de frecuencia más baja (5-100 kHz) dispositivos funcionan de forma continua, y cuando funciona a una frecuencia en la que una población experimenta pDEP mientras que el fondo las experiencias de la población nDEP, puede redirigir trayectorias de las partículas para lograr la clasificación. 32-34 Estos dispositivos de baja frecuencia se han utilizado para clasificar las células cancerosas de las células rojas de la sangre, determinar los cambios en las propiedades dieléctricas de una línea celular MOSE progresiva, y para dilucidar los efectos de la no- tratamientos esfingolípidos tóxicos en revertir las características agresivas de células MOSE agresivos. Además, microdispositivos CDEP pueden ser diseñados para funcionar a un mayor rendimiento, en la actualidad hasta 1 ml / hr. 31,35 Como se ha descrito, la flexibilidad y el bajo coste del proceso de fabricación permite geometrías de dispositivos diseñados a medida, que permiten que el procedimiento experimental presentado para ser relevante para una amplia gama de aplicaciones. El objetivo a largo plazo de las CDEP es darse cuenta sin etiquetas clasificación de células y el enriquecimiento a nivel clínico, con recuperación de la muestra de la cultura o la transformación posterior. La técnica presentada aquí es un método simple y de bajo costo, de la fabricación para la experimentación, lo que aumenta la accesibilidad de DEP. Se demuestra la preparación de un chip de CDEP y el protocolo experimental para lograr la caracterización y el enriquecimiento de las células de cáncer de ovario de microesferas fluorescentes.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

La dielectroforesis (DEP) es el fenómeno por el cual polarizados partículas en un campo eléctrico no uniforme se someten a movimiento de traslación, y se puede utilizar para dirigir el movimiento de micropartículas de una manera-marcador independiente superficie. Tradicionalmente, los dispositivos de DEP incluyen electrodos metálicos planas estampadas en el canal de muestra. Este enfoque puede ser costoso y requiere un entorno de sala limpia especializada. Recientemente, un enfoque sin contacto denominada dielectroforesis contacto (CDEP) se ha desarrollado. Este método utiliza el principio clásico de DEP evitando al mismo tiempo el contacto directo entre los electrodos y la muestra de modelado por electrodos de fluidos y un canal de muestra de una sola polidimetilsiloxano (PDMS) de sustrato, y tiene aplicación como una estrategia de microfluidos rápida diseñada para ordenar y enriquecer micropartículas. Único de este método es que el campo eléctrico se genera a través de canales de electrodos de fluidos que contiene un fluido de alta conductividad, que se separa de lacanal de muestra por una barrera aislante delgada. Debido a que los electrodos de metal no entren en contacto directamente la muestra, la electrólisis, la delaminación del electrodo, y la contaminación de la muestra se evitan. Además, esto permite un proceso de fabricación de bajo costo y simple. CDEP es por lo tanto muy adecuado para la manipulación de partículas biológicas sensibles. La fuerza dielectroforética que actúa sobre las partículas depende no sólo de gradientes espaciales del campo eléctrico generado por el diseño adaptable de la geometría del dispositivo, pero las propiedades biofísicas intrínsecas de la célula. Como tal, CDEP es una técnica libre de etiquetas que evita dependiendo de biomarcadores moleculares expresados ​​en la superficie que se puedan expresar de forma variable dentro de una población, al tiempo que permite la caracterización, el enriquecimiento, y la clasificación de biopartículas. Este sentido, demostrar los fundamentos de la fabricación y experimentación utilizando CDEP. Explicamos la simple preparación de un chip CDEP mediante litografía blandatécnicas y. Se discute el procedimiento experimental para la caracterización de frecuencia de cruce de una partícula o célula, la frecuencia a la que la fuerza dielectroforética es cero. Por último, demostrar el uso de esta técnica para la clasificación de una mezcla de células de cáncer de ovario y de fluorescencia de microesferas (bolas).

DEP debe observarse cualitativamente en el canal de muestra para confirmar el dispositivo está operativo cuando el campo eléctrico está presente. Un método para probar la presencia de DEP es para ajustar la frecuencia a valores muy lejos de la frecuencia de cruce donde se predicen pDEP fuerte y nDEP (aproximadamente&gt; 40 kHz a observar pDEP y &lt;10 kHz a observar nDEP para la mayoría de las células cancerosas de mamífero en un amortiguar con una conductividad de 100 mS / cm). Cabe señalar que las microesferas inertes exhiben pDEP por debajo de su frecuencia de cruce y nDEP por encima de su frecuencia de cruce. Para la geometría de la entidad de diente de sierra que se presenta aquí, pDEP debe ser visto para las células en la frecuencia de prueba más elevada, indicada por la aparición de la perla de encadenamiento y concentración de las células o partículas en el borde de diente de sierra característica del canal, mientras que en la frecuencia de prueba inferior, nDEP debe ser evidente a medida que las células están restringidos a la región más cerca el borde recto de la canal. A estas frecuencias bajas, las células pueden Lyse debido a la electroporación, por lo que la muestra pueden contener los elementos de menor número de células, y los que son visibles pueden aparecer ampliada o borrosa si se utiliza un colorante fluorescente enzimáticamente activa-. Verificación de las frecuencias en las que se producen pDEP y nDEP permite la determinación de la frecuencia de cruce como se describe en el protocolo. Para las células de cáncer de mamíferos, tales como MOSE-L utilizados aquí, se observó nDEP a 5 kHz (Figura 5a) y pDEP fuerte a 60 kHz (Figura 5b). Células MOSE-L tenía un diámetro de 17,7 ± 3,3 m (n = 268 células) y las perlas tienen un diámetro nominal de 4 micras. Un análisis completo de las propiedades dieléctricas de células MOSE-L en comparación con las células MOSE en las primeras etapas de la progresión se puede encontrar en el reciente trabajo de Salmanzadeh et al. 33 Si pDEP y nDEP no se observan a estos extremos, varios problemas podrían estar ocurriendo. La conductividad de la muestra puede ser demasiado alta debido a los contaminantes o de lisis celular. INSUFICIENTEcampo eléctrico NT se puede generar debido a las burbujas atrapadas en los canales de electrodos de fluidos, que impiden conducción de la corriente a la parte de los canales que bordean el canal de muestra. De estado no estacionario puede ser causada por una burbuja atrapada en la jeringa o tubo de entrada, burbujas resultante de no mantener el dispositivo al vacío durante un tiempo suficiente o no llenar rápidamente el dispositivo al retirar de vacío, fugas debido a la delaminación de PDMS mal unidos a los portaobjetos de vidrio, con lágrimas en la membrana de barrera debido a la excesiva fuerza ejercida durante el llenado de los canales, o las tasas de flujo en los extremos de la gama de funcionamiento de la bomba. Además de determinar la frecuencia de cruce de las células, esta técnica se puede utilizar para ordenar una mezcla, que se ilustra aquí por una mezcla de células MOSE-L y los granos. Este ejemplo se aprovecha de la dielectroforesis negativo (nDEP) exhibida por 4 micras cuentas en frecuencias donde las células MOSE-L experimentan dielectroforesis positivo (pDEP). Nosotros operated el dispositivo a 200 V RMS y 10 kHz (Figura 6a) y observaron que tanto las células y los granos se mezclaron mientras experimentaban nDEP. A 50 kHz se observó movimiento de las células MOSE-L a la parte superior del canal, mientras que las bolas se limita a la parte inferior del canal, lo que permite la separación de la mezcla en dos componentes (Figura 6B). <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> Figura 5. La posición de las células MOSE-L es manipulado por el cambio de la frecuencia del campo eléctrico aplicado. Las fotografías se toman a la función de diente de sierra final en el canal de muestra y los electrodos de fluidos se encuentran en las esquinas en el lado derecho. Están llenos de PBS que contenía rodamina B, que emite fluorescencia para visualizar los canales. (A) células MOSE-L experimentan nDEP a 200 V RMS<html> y 5 kHz. (b) células MOSE-L experimentan encadenamiento de perlas y pDEP a 200 V RMS y 60 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> Figura 6. Una mezcla de células MOSE-L (verde) y 4 micras perlas (rojo) fluya a través de la función de diente de sierra final en el canal de muestra de un dispositivo de CDEP de baja frecuencia. (A) a 200 V y 10 kHz células y los granos se mezclan. Las flechas apuntan a aparecer débilmente las células que probablemente han muerto debido a las condiciones de baja frecuencia. (B) A 200 V y 50 kHz células experimentan pDEP y se mueven al borde característica del canal, mientras que los granos experimentan nDEP y permanecen confinadas a la región más cerca el borde recto.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura.

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Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectroforesis Contactless (CDEP) logra la clasificación y el enriquecimiento de las partículas a través de sus propiedades dieléctricas intrínsecas. Canales de electrodos Fluídicas reemplazar electrodos metálicos tradicionales para DEP, satisfaciendo CDEP para no dañar la caracterización estéril y clasificación de partículas biológicas. Demostramos cómo preparar un microdispositivo CDEP y llevar a cabo la caracterización de células y experimentos de clasificación.

Aislamiento libre de marca y el enriquecimiento de las células a través Contactless Dielectroforesis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

label-free-isolation-enrichment-cells-through-contactless

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K vistas.  Virginia Tech.  Dielectroforesis Contactless (CDEP) logra la clasificación y el enriquecimiento de las partículas a través de sus propiedades dieléctricas intrínsecas. Canales de electrodos Fluídicas reemplazar electrodos metálicos tradicionales para DEP, satisfaciendo CDEP para no dañar la caracterización estéril y clasificación de partículas biológicas. Demostramos cómo preparar un microdispositivo CDEP y llevar a cabo la caracterización de células y experimentos de cl...

Video: Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Investigación

Medicina

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

El enriquecimiento de las células madre quimiorresistente cáncer ovárico de líneas celulares humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias de las arterias y venas caninas

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...