지원이 작품은 국립 과학 부여 번호 EFRI 0938047에서 재단 및 중요한 기술 및 응용 과학의 버지니아 공대 연구소 (ICTAS)에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 MOSE-L 세포의 자신의 종류의 선물 박사 에바 Schmelz의 박사 폴 로버츠 감사의 말씀을드립니다. 저자는 그녀의이 문서를 편집하고 실험을 준비하는 그녀의 도움을 세포 배양, Caitlan Swaffar에 대한 지원, 그리고 모든 Bioelectromechanical 시스템 실험실 구성원 안젤라 앤더슨을 인정합니다.

1. 개요 : 프로토 타입 cDEP 미세 유체 소자의 제조 <ol><li> 실리콘 웨이퍼에 원하는 채널 디자인 (그림 1) (그림 2) 에칭, 포토 레지스트와 깊은 반응 이온 에칭 (DRIE)를 사용하여 이전에보고 절차 (22)를 따르십시오. 웨이퍼로부터 마이크로 디바이스의 방출을 향상시키기 위해 테프론의 얇은 층을 증착. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> 그림 1. 낮은 주파수 연속 정렬 장치의 개략도. 샘플 채널이 실행은 왼쪽에서 오른쪽으로 100 μm의 톱니 긴축 500 μm의 폭이다. 유체 전극 채널의 두 쌍 각각 소스 및 싱크 전극을 구성하고, 20 μm의 두께 PDMS 장벽으로 샘플 채널로부터 분리된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> 그림 2. Fabr와cDEP 장치의 가스화 공정. (a) 60 초를 들면, UV 광을 선택적 cDEP 장치 형상의 마스크 패턴을 통해 노광 된 포토 레지스트와 반응한다. (b) 포토 레지스트 현상 제를 사용하여 제거된다. (c) 깊은 반응성 이온 에칭 (DRIE) 50 ㎛ 깊이의 특징을 에칭하고, 70 ° C에서 테트라 메틸 암모늄 하이드 록 사이드 (TMAH) 25 % 웨트 에칭으로 5 분간하는 데 사용은 측벽 거칠기를 줄이기 위해 사용된다. (d) 테프론 코팅에서 디바이스 방출을 향상시키기 위해 첨가 웨이퍼. (E)은 PDMS는 가스를 제거 후 재사용 가능한 웨이퍼 스탬프에 붓고 100 ° F. (F) PDMS는 웨이퍼에서 제거에 45 분 동안 경화된다. PDMS와 깨끗한 유리 슬라이드를 2 분 동안 공기 플라즈마에 노출과 함께 결합된다. <ol start="2"><li> 파급을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 웨이퍼를 감싸십시오. 약 20 분 동안 에이전트, 드 가스를 경화 엘라스토머 10:1 비율의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 혼합및 상기 웨이퍼 상에 붓는다. 열은 100 ° C에서 45 분 동안 스탬프의 테플론 코팅의 손상을 방지합니다. 장치가 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 냉각 한 후, 알루미늄 호일을 제거하는 수술 블레이드를 사용하여 PDMS를 손질하고, 튜브의 크기에 적합한 무딘 주먹을 사용하여 채널의 입구 / 출구에 액세스 구멍을 펀치. 여기서, 1.5 mm 무딘 펀치가 사용됩니다. </li><li> 각각의 물과 비누 린스, 에탄올, DI 물, 공기와 건조를 사용하여 유리 현미경 슬라이드를 청소합니다. 스카치 매직 테이프를 사용하여 PDMS 장치를 청소합니다. 채널이 깨끗한 지 확인하기 위해 현미경으로 확인한다. 2 분 동안 공기 플라즈마에 슬라이드와 PDMS 장치를 노출합니다. 단단히 장치와 슬라이드 (그림 3) 사이에 공기 거품의 형성을 방지, 유리 슬라이드에 장치의 채널 측면을 누릅니다. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> 그림 3. </st룽&gt; (A) 실리콘 웨이퍼의 우표 제작, 샘플 각각 녹색과 붉은 식용 색소, 가득 유체 전극 채널 (B) 완성 된 PDMS 유리 장치 중 포토 리소그래피에 사용되는 마스크. 치수는 그림 1을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 2. DEP 버퍼에 세포 현탁액을 준비 <ol><li> &quot;DEP 버퍼&quot;라고한다 낮은 전도성을 준비 (100 μS / cm) 버퍼 (8.5 % 자당 [W / V], 0.3 % 포도당 [W / V], 0.725 % RPMI [W / V]) . 16 </li><li> 3 × 106 세포 / ml에서 DEP 버퍼 셀 서스펜드. 여기에, 암 말기 마우스 난소 표면 상피 (MOSE-L) 세포가 사용됩니다. </li></ol> 참고 : 트리 판 블루 염색 배제 법에 의해 세포 생존 분석을 생존력의 경미한 감소를 보였다5 시간 후 실온에서 DEP 완충액 초기 단계 MOSE (MOSE-E) 세포 (95.1-91.6 %에서). 그것은 생존에 비슷한 약간의 감소는 세포가 장기 버퍼 DEP에 저장되지 것을 나타냅니다 MOSE-L 세포에 발생하는 것으로 예측된​​다. <ol start="3"><li> 그러한 효소 - 활성화 된 칼 세인 AM로, 형광 막 투과성 염료를 사용하여 세포를 염색. </li><li> 염색 된 세포 현탁액의 전도도를 측정한다. 전도도는 약 100 μS / cm이어야한다. 전도율 측정이 너무 크면, 6 세포 / ㎖ X 10 세에서 DEP 버퍼에, 아래에 resuspend을 샘플을 회전 및 전도도 측정을 반복한다. </li></ol> 3. cDEP 미세 유체 칩을 넣기 <ol><li> 30 분 동안 진공 마이크로 유체 칩을 놓습니다. </li><li> 한편, 마이크로 유체 칩이 위치 할 현미경 단계에 주사기 펌프의 거리에 걸쳐 유연한 튜브의 조각을 잘라. 여기에, 튜브의 6 인치 길이필요합니다. 주사기 끝을 바늘에 맞추기 튜브. </li><li> 관의 단면적에 의해 수집 대상 샘플 볼륨을 분할함으로써 출구 호스 위해 필요한 길이를 추정한다. 이 튜브의 길이를 필요로 자른다. </li><li> 주사기로 세포 현탁액을 그립니다. 기포가 튜브 또는 주사기에 위치하고 있지 않은지 확인합니다. </li><li> 진공에서 칩을 제거하면, 채널에 갇혀있는 공기 방울을 방지하기 위해 신속하게 배출 튜브 프라임 샘플 채널을 삽입합니다. 장벽을 절연 박막 (20 μm의) 파열을 방지하기 위해 프라이밍 때 장벽이 파열없이 5 ㎖ / 시간에 가까운 일정한 처리량을 견딜 수있는 것으로 확인되었습니다 불구하고 조심스럽게 주사기를 누릅니다. </li><li> 주요 전극 채널에 신속하게 각 유체 전극 채널의 하나의 콘센트에 빈 피펫 팁을 배치합니다. 로다 민 B의 소량을 함유하는 PBS 200 μl를 피펫 부드럽게 전극 채널의 대향 단부에 유체를 도입하는 탭. 부드러운 압력을 유지로다 민 B와 PBS는 눈에 띄게 빈 피펫 팁의 끝을 진행 할 때까지. 각 전극 채널에 대해 반복합니다. 로다 민 B는 찬란 유체 전극 채널을 시각화하는 데 사용됩니다. </li><li> 프라이밍 한 후, 피펫 팁 저수지에서 로다 민 B의 피 거품 형성과 PBS 각 피펫 팁 저수지를 채우고, 위아래로 부드럽게 피펫 팅에 의해 눈에 보이는 거품을 제거합니다. 출구 튜브를 분리하고 적절하게 폐기, 다음 대상 볼륨을 수집하는 새로운 출구 튜브 저수지를 삽입합니다. </li></ol> 4. cDEP 칩을 사용하여 세포의 특성화 크로스 오버 주파수 <ol><li> 디지털 카메라 (그림 4)가 장착 된 거꾸로 현미경의 무대에 칩을 놓습니다. </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> 그림 4. </stroNG&gt; () cDEP 실험에 대한 전체 실험 장치. cDEP 칩은 거꾸로 현미경의 플랫폼에 있습니다. 카메라가 녹화를 위해 이미지를 컴퓨터로 전송합니다. 주사기 펌프는 일정한 유입 흐름을 유지한다. 함수 발생기는 고전압 증폭기에 의해 승압하고 와이어 전극에 의해 cDEP 칩에 접속되어 신호를 생성한다. 오실로스코프는 칩에 전송되는 신호를 모니터링합니다. (b)는 cDEP 칩과 유체 및 전자 연결 상세도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol start="2"><li> 주사기 펌프에 주사기를 장착하고 유체 전극 채널 저수지에 와이어 전극을 삽입합니다. </li><li> 주사기 펌프와 주사기 사이 좋은 접촉을 보장하기 위해 1 ㎖ / 시간을 통해 유체를 펌프. 시각적으로 방해받지 않고 세포의 흐름과 거품이나 누수의 유무를 확인하기 위해, 채널 길이를 검사한다. 빨강0.005 ㎖ / 시간에 UCE 유량. 주 : 1 ㎖ / 시간의 31,35의 높은 처리량은 다른 형상의 장치에 달성되었다. </li><li> 안전을 위해, 함수 발생기, 고전압 증폭기 및 오실로스코프에 전원을 공급하고, 원하는 전압과 주파수를 조정하여 부품을 시험한다. 다음은 이러한 매개 변수는 200 V, 20 kHz에서입니다. 적절한 성능, 전원 오프의 검증에. 고전압 앰프에 전극을 연결합니다. 참고 :이 실험에 사용 된 높은 전압에서 전자 제품을 작동 할 때 적합한 전기 안전 절차를 준수하십시오. </li><li> 흐름을 지속적으로 달성되면, 원하는 주파수에서 원하는 전압을 적용합니다. 이 실험에서, 전압은 5 ~ 60 kHz에서의 주파수에서 200 V RMS입니다. </li><li> 화상 처리 기술이 채널에서 세포 분포를 정량화 및 크로스 오버 주파수를 특성화한다 (단계 5)와 세포 반응의 기록 비디오 파일. 이 작업을 수행하려면,일정한 전압을 유지하고 체계적으로 주파수를 변경. 실험뿐만 아니라 무작위 실험적인 실행 사이의 시작과 끝에서, 임의의 전기장을인가하지 않고 세포의 분포를 제어 셀 분포를 기록한다. 세포 (여기서, 5 분) 모니터링 위치로 입구로부터 유동에 필요한 시간의 양을 추정한다. 새로운 주파수를 설정 한 후, 다음 (여기에서 세포 분포의 2 분 영상) 촬영을 시작,이 시간을 기다립니다. </li></ol> 5. 특성화 크로스 오버 주파수에 대한 이미지 처리 <ol><li> 전산 스크립트를 사용하여, 상대적으로 Y-위치 (Z-방향 채널의 수직 깊이이고, Y 방향은 채널 폭이며, x-방향은 채널 길이)를 결정하기 위해 프레임의 각 비디오 프레임을 분석 각 형광 셀 또는 입자의 하류 채널에서 높은 DEP 힘의 영역에서 X 좌표를 지정했습니다. 상대적 표시의 그래프를 만들기tribution. </li><li> 제어 분포의 중심선과 각 전압 및 주파수 분포의 중심선을 비교한다. 주어진 전압 및 가변 주파수를 위해, 중심선이 제어의 y-위치와 일치 크로스 오버 주파수를 결정한다. </li></ol> 6. 셀 정렬 또는 심화 학습을 수행 할 수있는 실험을 변화 <ol><li> 3 × 106 입자 / ml의 농도로 전체 DEP 버퍼의 원하는 혼합물을 중단. 여기에,이 혼합물은 DEP 버퍼에 4 μM의 형광 구슬 MOSE-L 세포입니다. cDEP 장치를 준비하기 이전에 설명 된 단계를 수행합니다. </li><li> 혼합물로부터 세포를 풍부하게 정렬하거나, 표적 세포의 크로스 오버 주파수 및 앞서 설명한 배경 입자를 결정한다. 입자의 집단이이 대향 D에서 DEP 힘을 경험할 수 있도록 표적 세포 및 배경 입자의 두 개의 크로스 오버 주파수 간의 주파수에서 실험 운항irections. MOSE-L 세포와 4 μm의 구슬을 정렬하려면, 11.90 ± 0.63 kHz에서 위의 마이크로 디바이스를 운영하고 있습니다. 최근 Salmanzadeh 외. (33)에 의해보고 MOSE L-세포의 첫번째 교차 주파수 </li><li> 정렬 된 샘플의 내용을 수집, 출구 입구에 장갑의 손가락을 배치하고 부드럽게 튜브에 잡아 당 겼에 의해, 대상 볼륨을 수집에 배출 튜브를 제거합니다. 추가 분석을 위해 저수지에 수집 대상 볼륨을 부어 주 :. 다른 샘플 복구 방법은 칩에 영구 저장소를 연결하고 간단한 피펫 팅하여 샘플을 제거 포함 할 수 있습니다. </li></ol>

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B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Blood+Cells+Using+Dielectrophoresis.">Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis.</a> , (2012).</li><li>Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+development+of+a+low+frequency+contactless+dielectrophoresis+(cDEP)+platform+to+sort+cancer+cells+from+dilute+whole+blood+samples.">Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples.</a> Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Dielectric+Properties+of+Different+Stages+of+Syngeneic+Murine+Ovarian+Cancer+Cells.">Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells.</a> Biomicrofluidics. , (2013).</li><li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , 590-593 (2012).</li><li>Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+contactless+dielectrophoresis:+Theoretical+considerations.">Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations.</a> Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).</li><li>Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+beads+and+cells+in+multi-channel+microfluidic+devices+using+dielectrophoresis+and+laminar.">Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar.</a> J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).</li><li>Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis.">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis.">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li></ol>

박사 라파엘 Davalos의 비접촉식 유전에 대한 특허 출원을 보유하고 있습니다.

DEP는 입자의 유전 특성을 결정하고, 격리, 또는 농축 응용 프로그램을 정렬 방향으로 입자의 움직임을 지시하는 강력한 기술이다. 때문에 샘플에 직접 전극 접촉의 해로운 영향에, 다른 사람은 접촉을 피하기 위해 이전에 제시된 방법과 유사한 접근 방식을 촬영했습니다. 예를 들어, 바쉬르 외. 얇은 유리 커버 슬립에 의해 인쇄 회로 기판의 전극으로부터 분리 된 미세 유체 PDMS 장치를 사용하여 비접촉식 DEP 장치를 개발하고,이 기술은 비디오 포맷으로 제공된다. 23,36을 여기서, 우리는 단일 PDMS 기판을 사용 cDEP 칩과 유체 전극의 제조, 및 전지 및 형광 비드의 혼합물로부터 난소 암 세포를 분리하기위한 실험 프로토콜을 보여 주었다. 제시된 기법은 성공적 리브 정렬 등 복잡한 생리 학적으로 중요한 다양한 애플리케이션에 사용되어왔다E 및 사균은 28 종양 전립선 암 세포에서 세포를 개시 묽은 적혈구, 31,32 및 유방암 (37) 및 난소 암의 단계 사이에서 구별 30 암세포. 29 cDEP 또한 입자를 혼합하는 데 사용되었다. 38 선택된 애플리케이션은 제시된 간단한 기술을 이용하여, 다양한 목적은 채널 형상의 설계를 변경하는 것만으로 달성 될 수 있다는 것을 시사한다. . DEP 입자는 구형 입자 (13)의 조작을위한 마이크로에 유용 병진 유전 힘의 크기 및 전기 입자와 그 현탁 매질의 성질뿐만 아니라, 전기장의 그래디언트의 제곱에 의존한다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> ε의 m은 현탁 매질의 유전율이고, R은 반경입자 및 Rc는 [K (ω)]를 것은 Clausius-Mossotti (CM) 계수의 실수 부이다. CM 인자는 현탁 매질에 비해 입자의 상대적인 분극의 측정 값이며, 유전 힘의 방향을 판정한다. 그것은으로 설명되어 있습니다 <img alt="식 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> 어디에 <img alt="식 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> 과 <img alt="식 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> 각각 입자와 매질의 복소 유전율이다. 복잡한 유전율, <img alt="식 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , 전도도 (σ)과 주파수 (ω)에 따라 달라집니다. 구형 입자의 CM 인자는 이론적으로 -0.5과 1 사이의 바인딩. CM 계수가 음수 인 경우에는 매체의 입자보다 더 극성이기 때문에 입자가 영역에서 벗어나 있기 때문에, 입자 NDEP 발생할높은 전기장 그라디언트. CM 계수가 양수이면, 입자는 매질보다 더 극성이며, 그들은 높은 전기장 구배의 영역을 향해 이동되는 pDEP을 경험한다. 이러한 세포와​​ 같은 구조에서 비균질 생물학적 입자 들어 것은 Clausius-Mossotti 계수 입자 유전율 대한 유효 값으로부터 결정될 수있다 : <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> 어디에 <img alt="식 (7)" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> 과 <img alt="식 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> 각각 같은 세포질과 같은 세포의 내부, 및 세포막의 유효 복소 유전율의 복소 유전율이며. R은 셀의 반경이며, d는 세포막의 두께 (26) DEP는 현탁 입자가 발생하면유체, 유체 입자의 상대 운동은 입자에 항력을 생성합니다. 입자에 작용하는 전체 힘을 결정할 때 항력이 고려되어야한다. 여기에서 관심의 상황에서, 점성 힘이 지배하고 입자가 구형 작은, 그리고 상대적으로 낮은 속도로 이동하는 것으로 간주됩니다, 그래서 스토크 드래그 법은 항력을위한 좋은 근사값을 제공합니다 : <img alt="식 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> η는 유체 점도이고, U (P)는 입자의 속도이며, U f를 또한 이동 될 수있다 유체의 속도이다. 유전 힘, 유체 및 입자 특성을 공지하고, 공지 된 유속 감안 항력 및 유전 힘 사이의 균형은 입자 속도를 추정하기 위해 해결 될 수있다. 세포 경험이 임계치 미만이어야 전단 속도하는 C에서엘 라이트 용해가 발생할 수 있습니다. 입자의 전기적 특성의 특성을 예측하고 그들이 DEP 아래를 응답하는 방법을 제어 할 필요가있다. 이 작품에서 우리는 특히 세포의 첫 번째 크로스 오버 주파수를 결정하기위한 프로토콜을 보여 MOSE-L 세포와 저주파 cDEP을 활용하고 자신의 반대 DEP 응답에 따라 폴리스티렌 비즈 MOSE-L 세포의 지속적인 정렬을 보여 주었다. cDEP 장치의 형상이 장치는 고주파 또는 저주파의 동작을 위해 설계 될 수 있도록, 전계의 공간적 기울기를 변경하고, 높은 선택성 및 특정 세포 유형의 선별 효율을 바꾸는 것이다. 부가 적으로, 고 스루풋 장치는 넓은 채널을 제조하여 개발 될 수 있으며, 병렬, (30) 또는 전극 채널이 수직으로 비교적 깊은 상하에 적층 된 다층 제조 35, 30 채널샘플 채널. 얇은 멤브레인 층 사이의 장벽을 형성한다. 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 및 폴리 카보네이트로 제조 장치와 예비 테스트 (PC) 박막 MOSE-L 세포의 DEP 반응을 증명하고있다. 현재 노력은 다층 고 처리량 장치하실하고 궁극적 플러그 앤 플레이 플랫폼을 향해 주변 시스템을 개선하기 위해 진행중이다. 제시된 기본 실험 기법에서 확장하려면 장치의 응용 프로그램 및 사양은 특성화 대 정렬, 또는 장치에 샘플 저수지 및 반 자동화 시스템을 추가하는 등의 특정 요구를 맞게 조정할 수 있습니다.

생체 시료 농축 및 입자 정렬 후속 분석을 위해 필요한 경우가 많습니다. 1 예를 들어, 체액 희귀 세포의 분리가 암 탐지 및 개별 의학에서 중요한 응용 프로그램이 있습니다. 2,3 가장 일반적으로 사용되는 농축 기술은 형광 활성 세포 정렬합니다 (FACS 4) 자기 활성화 된 셀 (MACS), 세포를 구분하는 표현 표면 마커에 의존 5 정렬. 다른 전략은 유체 역학적으로 10 또는 관성 7,8 정렬 광학 핀셋, acoustophoresis 9, 10 및 유전 있습니다. 11,12 유전 영동은 불균일 한 전계의 존재하에 극성 입자의 운동이다. 13 DEP가 사용되어왔다 광범위한 응용, 2,14 생존, 15 세포의 생체 전기 특성을 특성화에 기초하여 셀을 정렬하는 등, (16)과 정렬세포의 생물 리 학적 특성에 유도 변화에 주입. 17,18 전통적인 DEP는 전압을인가하고이 강력한 기술이지만 불균일 전기장. (13)을 유도하는 미세 유체 채널 내에서 패터닝 된 평면 전극을 이용하여, 도전 같은 발생할 수 전극의 박리 및 전기. 절연체 계 유전 영동 (IDEP) (19)는 오염, 전극의 박리, 및 DC 전계 불균일성을 유도 패터닝 절연막 구조를 통해 전극 필드의 공간적 열화 문제를 해결하고있다. IDEP 선택적으로 라이브와 죽은 세균 세포를 분리하는 데 사용되었습니다, (19)는 세균 포자, 20, 조작 DNA, 다른 응용 프로그램 사이에 21을 격리 할 것. 종종 요구되는 높은 DC 전압의 결과로 발생할 수 있기 때문에 줄 가열 도전이 될 수 있습니다. 이러한 문제를 개선하기 위해, 비접촉식 DEP 마이크로 디바이스가 개발되고있다. 22-24 (22)가 가득 유체 전극 채널과 금속 전극의 대체 높은 전도성 용액. 이러한 유체 전극 용량 AC 전압을 통해 시료 채널에 얇은 절연 배리어를 통해 연결된다. 전극 샘플 접촉을 제거하면 전기 분해와 거품 형성, 샘플 오염, 전극의 박리 등의 DEP 기반의 방법과 관련된 문제를 줄일 수 있습니다. 이 샘플에서 세포의 생존을 지원하기 때문에 결과적으로 cDEP은 생체 시료에 특히 유용합니다. 중요한 것은, cDEP 샘플 불임을 유지 관리 할 수​​ 있습니다. 칩은 세포 배양 후드에서 제조 될 수 있으며, 실험은 금속 전극에 시료의 접촉을 요구하거나 샘플 environme에 개방 할 필요없이 수행 될 수있다NT. 간단한 저장조 멸균 샘플 회수를 용이하게하기 위해 칩 콘센트에 고정 될 수있다. 또한, 샘플 채널과 같은 생체 적합성 폴리머 재료 (PDMS)까지 유체 전극의 제조는 금속 전극의 커스텀 패터닝, 제조에 필요한 시간에 따른 높은 비용을 감소시키고, 초기 패터닝 전문 크린룸 장비에 대한 필요성을 제한 재사용 할 수있는 실리콘 웨이퍼를 스탬프. DEP에 의한 입자의 움직임은 입자와 매체뿐만 아니라, 전기장의 공간 구배의 특성에 의존한다. 입자 및 주파수 종속 인자는 것은 Clausius-Mossotti (CM) 계수라고 범위 -0.5 ~ 1의 값을 취하고, DEP 힘의 방향을 판정한다. CM 요소가 정확히 제로되는 주파수는 크로스 오버 주파수라고한다. 이은 유전 힘이 입자와 CM 인자 변경 기호에 작용되지 않는 시점입니다. 의불활성 고체 미립자에 대한 화롯불 크로스 오버 주파수가 발생하면 음에서 양으로 CM 인자의 변화가 0.01 S / M, NDEP에서 pDEP 10 근처에 존재로의 전환을 나타내는 최초의 크로스 오버 주파수의 순서에 전도성이 낮은 버퍼의 포유 동물 세포 25. - 100 kHz로하고, 크기, 형상, 세포 골격 및 세포의 막 특성에 의해 영향을 받는다. 26,27 NDEP 정권 pDEP로부터 시프트에서 제 크로스 오버 주파수는 10 메가 헤르츠의 순서에 있고 의해 영향 핵 - 세포질 비율, 세포질 전도성 및 소포체. 27 DEP 힘은 유체 유동의 존재없이 적용 할 수 있지만, 여기에서 우리는 현탁 입자의 연속적인 정렬을 달성하기 흐르는 유체를 이용한다. 유전 힘과 스토크 항력의 결합 된 영향은 입자의 병진 운동을 지시. 우리는 두 개의 주파수 범위에서 작동을위한 장치를 개발했다. 높은 주파수 0Y 장치 (100 ~ 600 ㎑의 주파수) 전립선 종양 시작 세포 (틱), 쥐의 난소 표면 상피 (MOSE) 세포, MDA-MB-231 유방암 세포로, pDEP 세포의 달성 배치 정렬을 사용하여 작동, 또는 THP에게 살 수있다 선택적으로 샘플 채널에있는 게시물을 절연에 대한 관심의 세포를 포집하여 -1 세포. 28-31 낮은 주파수 (~ 100 kHz에서) 장치는 지속적으로 작동하고, 주파수에서 작동 할 때 한 인구는 배경 인구 경험하면서 pDEP을 경험하는 NDEP는 정렬 달성하는 입자 궤도를 리디렉션 할. 32-34 선택된 저주파 장치가 적혈구로부터 암세포를 정렬 프로그레시브 MOSE 세포주의 유전 특성의 변화를 결정하고, 비 효과를 명료하게하기 위해 사용되어왔다 공격적인 MOSE 세포의 공격적인 특성을 반전에 독성 스핑 고지 치료. 또한 cDEP의 마이크로 디바이스는 현재 최대 1 ㎖ / 시간, 증가 된 처리량으로 작동하도록 설계 될 수있다R. 31,35 설명한 바와 같이, 유연성 및 제조 공정의 저비용 제시된 실험 절차는 광범위한 애플리케이션에 대한 중요한되도록 맞춤 설계된 소자 구조를 가능하게한다. cDEP의 장기 목표 후속 배양 또는 처리를위한 샘플을 회수하여, 임상 수준에서 라벨없는 셀 정렬 및 농축을 실현하는 것이다. 여기에 제시된 기술은 DEP의 접근성을 증가하는, 제조에서의 실험으로, 간단하고 저렴한 방법입니다. 우리는 특성화 및 형광 마이크로 스피어에서 난소 암 세포의 농축을 달성하기 cDEP 칩의 제조 및 실험 프로토콜을 보여준다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

유전 (DEP)은 불균일 전기장에서 입자가 병진 운동을 겪는 편광되는 현상이며, 표면 마커 독립적 인 방식으로 미립자의 움직임을 지시 할 수있다. 전통적으로, DEP 장치 샘플 채널 패터닝 평면 금속 전극을 포함한다. 이 방법은 비용이 많이들 수 및 전문 클린 룸 환경을 필요로 할 수 있습니다. 최근 비접촉식 유전 (cDEP)라는 비접촉식 방법이 개발되었다. 이 방법은 직접 패터닝 유체 전극에 의해 전극과 샘플 사이의 접촉과 하나의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 기판의 샘플 채널을 피하면서 DEP의 고전적인 원리를 활용 한 미세 입자를 정렬하고 풍성하게 디자인 된 빠른 미세 전략으로 응용 프로그램이 있습니다. 이 방법으로는 순 전계가 분리되어 도전성이 높은 액체를 포함하는 유체 전극 채널을 통해 생성된다는 것이다얇은 절연 장벽에 의해 샘플 채널. 금속 전극이 직접 샘플을 접촉하지 않기 때문에, 전기 분해, 전극의 박리 및 샘플의 오염을 방지 할 수 있습니다. 또한,이 저렴하고 간단한 제조 공정을 가능하게한다. cDEP 따라서 민감한 생물 입자를 조작하기에 적합하다. 입자에 작용하는 유전 영 힘은 장치의 형상 맞춤형 디자인으로 생성 전계의 공간 구배 있지만 셀의 극한 생물 리 학적 특성에 단지 의존한다. 따라서, cDEP 여전히 bioparticles의 특성, 농축 및 정렬을 허용하면서 가변적으로, 인구 내에서 표현 될 수있다 표면 발현 분자 생체에 따라 방지 라벨이없는 기술이다. 여기, 우리는 cDEP를 사용하여 제조와 실험의 기본을 보여줍니다. 우리는 부드러운 석판을 사용하여 cDEP 칩의 간단한 준비를 설명Y 기술. 우리는 입자 또는 세포, 유전 력이 제로하는 주파수의 크로스 오버 주파수를 특성화 실험 절차를 논의한다. 마지막으로, 우리는 난소 암 세포의 혼합물을 정렬 및 미소 구 (비즈)를 형광이 기술의 사용을 보여준다.

DEP는 전기장이있을 때 장치가 작동 확인을 위해 샘플 채널에서 질적으로 관찰해야한다. DEP의 존재를 테스트하는 한 가지 방법은 훨씬 강한 pDEP 및 NDEP이 예상되는 크로스 오버 주파수 pDEP 및 대부분의 포유 동물의 암세포 NDEP을 관찰하는 &lt;10 kHz의 사항을 지키지 (약&gt; 40 kHz에서의 값에 주파수를 조정하는 것입니다 ) 100 μS / cm의 전도도와 버퍼. 이는 불활성 미립자들은 크로스 오버 주파수보다 그 크로스 오버 주파수 이하 pDEP을 나타내고 NDEP 주목해야한다. 여기에 제시된 톱니 피쳐 형상 들어 pDEP 하부 시험 주파수에서하면서 NDEP, 진주 체인 및 채널의 톱니 피쳐 에지에서 세포 또는 입자 포커싱의 발생에 의해 지시, 높은 시험 주파수에서 셀 보여야 세포가 채널의 직선 가까이 지역에 제한 될 때 명백하다. 이러한 낮은 주파수에서, 세포리스 수때문에 일렉트로에 전자, 그래서 샘플은 적은 세포를 포함하는 나타날 수 있으며 효소 활성화 형광 염료를 사용하는 경우 볼 수 있습니다 그 사람들은 확대 또는 흐릿하게 나타날 수 있습니다. pDEP 및 NDEP이 발생하는 주파수를 확인하는 프로토콜의 설명에 따라 크로스 오버 주파수의 결정을 허용한다. 여기에 사용되는 등 MOSE-L과 같은 포유 동물의 암 세포를 위해, 우리는 60 kHz에서 (그림 5b)에서 5 kHz에서 (그림 5a)와 강력한 pDEP에 NDEP을 관찰했다. MOSE-L 세포는 17.7 ± 3.3 μm의 (N = 268 세포)의 직경을 가지고 있었고, 구슬은 4 μm의 공칭 직경이있다. 진행의 초기 단계에있는 MOSE 세포에 비해 MOSE-L 세포의 유전 특성의 전체 분석 Salmanzadeh 등. (33)에 의해 최근 연구에서 찾을 수 있습니다 pDEP 및 NDEP는 이러한 극단에서 관찰되지 않은 경우, 여러 가지 문제가 발생 될 수있다. 샘플 전도도로 인해 오염 물질 또는 세포 용해시키기에 너무 높을 수 있습니다. INSUFFICIENT 전계 인해 샘플 채널 경계 채널 부분에 전류의 전도를 방지 유체 전극 채널에 갇힌 기포로 생성 될 수있다. 비정상 흐름은 충분한 시간 동안 진공 장치를 유지하지 않거나 빨리 인해에 제대로 결합 PDMS의 박리를 진공 누설 제거에 장치를 충전하지 인한 거품, 주사기 또는 입구 관에 갇혀 거품으로 인해 발생할 수 있습니다 펌프의 작동 범위의 극단에 채널을 작성 또는 유속 때 유리 슬라이드, 과도한 힘을 배리어 막에 눈물 가해. 세포의 크로스 오버 주파수를 결정하는 것에 더하여, 본 기술은 MOSE-L 세포 및 비드의 혼합물에 의해 여기에 예시 된 혼합물을 정렬하는 데 사용될 수있다. 이 예는 MOSE-L 세포가 긍정적 인 유전 (pDEP)를 경험 주파수에서 4 μm의 구슬에 의해 전시 된 음의 유전 (NDEP)을 활용합니다. 우리는 오200 V RMS 및 10 kHz의 (그림 6a)에서 장치를 perated 그들이 NDEP을 경험으로 세포와 구슬이 모두 혼합 한 것을 관찰했다. 비즈 두 성분 (도 6b)로 혼합물의 분리를 가능 채널의 하부에 한정 동안 50 kHz에서 우리는 채널의 상부에 MOSE L-세포의 움직임을 관찰했다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> 그림 5. MOSE-L 세포의 위치는인가 전계의 주파수를 변경함으로써 조작된다. 사진은 샘플 채널에서 최종 톱니 기능에서 찍은 것으로 유체 전극 우측 모서리에 위치한다. 이들은 PBS가 채널을 시각화하는 형광을 로다 민 B를 함유로 채워진다. (a) MOSE-L 세포는 200 V RMS에서 NDEP 발생할<html> 5 kHz에서. (B) MOSE-L 세포는 200 V RMS 및 60 kHz에서 진주 체인과 pDEP을 경험한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> 그림 6. MOSE-L 세포 (녹색) 및 4 ㎛의 비드 (레드)의 혼합물을 200 V에서 (a). 저주파 cDEP 장치의 샘플 채널에서 최종 톱니 기능을 통해 유동하고 10 kHz의 세포 및 비드를 혼합한다. 화살표는 200 V에서 (B). 희미 가능성이 낮기 때문에 주파수 조건에 죽은 세포를 게재하는 포인트와 50 kHz의 세포는 pDEP을 경험하고 채널의 기능을 가장자리로 이동, 비즈 NDEP을 경험하면서 지역의 가까이에 국한 유지 직선.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

비접촉 유전 (cDEP)는 자신의 고유 유전 특성을 통해 정렬 및 입자의 농축 달성한다. 유체 전극 채널 살균 특성을 비 손상 및 생물학적 입자의 정렬에 cDEP 양복지, DEP에 대한 기존의 금속 전극을 교체합니다. 우리는 cDEP의 마이크로 디바이스를 준비하고 세포의 특성 및 정렬 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다.

비접촉식 유전을 통해 라벨이없는 분리 및 세포의 농축

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.9K 조회수.  Virginia Tech.  비접촉 유전 (cDEP)는 자신의 고유 유전 특성을 통해 정렬 및 입자의 농축 달성한다. 유체 전극 채널 살균 특성을 비 손상 및 생물학적 입자의 정렬에 cDEP 양복지, DEP에 대한 기존의 금속 전극을 교체합니다. 우리는 cDEP의 마이크로 디바이스를 준비하고 세포의 특성 및 정렬 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다. 

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

연구

의학

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

인간 세포주에서 Chemoresistant 난소 암 줄기 세포에 대한 심화 학습

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...