Este trabalho foi apoiado apoiado em parte pela National Science Foundation, Grant No. EFRI 0938047, e pelo Instituto de Tecnologia de Virgínia para a crítica de Tecnologia e Ciências Aplicadas (ICTAS). Os autores gostariam de expressar meu agradecimento ao Dr. Eva Schmelz e Dr. Paul Roberts para seu presente tipo de células MOSE-L. Os autores reconhecem Angela Anderson por sua assistência com cultura de células, Caitlan Swaffar por sua ajuda com a edição deste documento e preparar os experimentos, e todos os membros do laboratório Bioelectromechanical Systems.

1. Confecção de um protótipo CDEP Microfluidic: Visão Geral <ol><li> Siga os procedimentos anteriormente relatados 22 usando photoresist e Deep Reactive Ion Etching (DRIE) para gravar o projeto do canal desejado (Figura 1) em uma pastilha de silício (Figura 2). Depositar uma fina camada de Teflon para melhorar a libertação do microdispositivo da bolacha. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de um dispositivo de classificação contínua de baixa freqüência. As canal exemplo é executado esquerda para a direita e é 500 mm de largura, com constrições dente de serra de 100 mm. Os dois pares de canais de eléctrodos fluídicos compor os eléctrodos de fonte e dreno respectivamente, e estão separadas do canal de amostra por uma barreira de PDMS de espessura de 20 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> Figura 2. O fabrprocesso icação de um dispositivo CDEP. (a) durante 60 segundos, a luz UV reage selectivamente com fotorresistente exposto por meio de um padrão de máscara da geometria do dispositivo CDEP. (b) Photoresist é removido utilizando revelador. (c) funda Reactive Ion Entalhe (DRIE) é usado para gravar 50 mM características profundas, e 5 min de decapagem húmida por hidróxido de tetrametilamónio (TMAH) 25% a 70 ° C é usada para reduzir a rugosidade das paredes laterais. (d) um revestimento de Teflon é adicionado para melhorar a libertação do dispositivo a bolacha. (e) PDMS é vertida sobre a bolacha de selo pode ser reutilizado após a desgaseificação e curado durante 45 minutos a 100 ° C. (f) PDMS é removido da bolacha. PDMS e uma lâmina de vidro limpa são expostas ao plasma de ar durante 2 minutos e ligados entre si. <ol start="2"><li> Enrole o wafer com folha de alumínio para evitar spill-over. Misture polidimetilsiloxano (PDMS), em 10:1 de elastômero para agente de cura, de-gás por cerca de 20 min, E despeje sobre o wafer. Aquecer durante 45 minutos a 100 ° C para evitar danificar o revestimento de Teflon do selo. Deixe o aparelho arrefecer. </li><li> Após o resfriamento, retire a folha de alumínio, a guarnição PDMS usando uma lâmina cirúrgica, e furos de acesso na entrada do canal / saída usando um perfurador sem corte adequado para o tamanho da tubulação. Aqui, um 1,5 milímetros perfurador sem corte é usado. </li><li> Limpe a lâmina de vidro usando uma lavagem com água e sabão, álcool etílico, água DI e secagem com ar, respectivamente. Limpe o dispositivo PDMS usando fita Scotch Magia. Examinar ao microscópio para ter certeza de canais estão limpos. Expor a lâmina e dispositivo de PDMS para plasma de ar por 2 min. Pressionar firmemente o lado do canal do dispositivo de lâmina de vidro, evitando a formação de bolhas de ar entre o dispositivo e a corrediça (fig. 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> Figura 3. </stRong&gt; (a) A máscara usada para a fotolitografia durante o fabrico do selo da bolacha de silício, e (b) o dispositivo de PDMS-vidro acabado com a amostra de fluido e os canais de eléctrodos cheias com corante alimentar verde e vermelho, respectivamente. Veja a Figura 1 para as dimensões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . 2. Preparar uma suspensão de células em DEP Tampão <ol><li> Prepara-se uma condutividade baixa (100 mS / cm) de tampão, o qual irá ser referido como &quot;tampão DEP&quot; (8,5% de sacarose [w / v], 0,3% de glucose [w / v], 0,725% de RPMI [w / v]) 16. </li><li> Suspender as células em tampão DEP em 3 x 10 6 células / ml. Aqui, canceroso do mouse em estágio avançado de ovário epitelial superficial (MOSE-L), as células são usadas. </li></ol> Nota: a análise de viabilidade celular pelo método de exclusão do corante azul de tripano demonstrou uma ligeira queda na viabilidade(95,1-91,6%) de início de carreira MOSE (MOSE-E), as células suspensas em tampão DEP à temperatura ambiente depois de 5 horas. Prevê-se que uma ligeira diminuição na viabilidade semelhante ocorre em células MOSE-L, o que indica que as células não devem ser armazenados em DEP tamponar a longo prazo. <ol start="3"><li> Tingir as células utilizando um corante fluorescente de membrana permeável, tal como a enzimaticamente activada Calceina AM. </li><li> Medir a condutividade da suspensão de células tingidas. A condutividade deve ser cerca de 100 mS / cm. Se a medição da condutividade é muito alta, a rotação da amostra para baixo, ressuspender em tampão DEP em 3 x 10 6 células / ml, e repetir a medição da condutividade. </li></ol> 3. Carregando o Microfluidic Chip CDEP <ol><li> Colocar o chip de microfluidos sob vácuo durante 30 min. </li><li> Enquanto isso, cortar um pedaço de tubo flexível, para abranger a distância entre a bomba de seringa para a fase de microscópio em que o chip de microfluidos será localizado. Aqui, um comprimento de tubo de 6 polegadasé necessária. Tubulação Fit para alfinetar ponta na seringa. </li><li> Estimar o comprimento necessário para o tubo de saída através da divisão do volume de amostra recolhido alvo por a área da secção transversal do tubo. Corte a exigir comprimento da tubulação. </li><li> Desenhar suspensão de células para dentro da seringa. Verificar que não há bolhas estão localizados no tubo ou seringa. </li><li> Após a remoção de chips de vácuo, inserir o tubo de saída e preparar o canal de amostra rapidamente para evitar bolhas de ar nos canais. Bater levemente na seringa quando purga para evitar a ruptura da fina (20 um) de isolamento barreira, embora tenha sido observado que a barreira pode suportar uma taxa de transferência elevada constante perto de 5 ml / h, sem se romper. </li><li> Para os principais canais de eletrodos, coloque rapidamente as pontas de pipeta vazias em uma saída de cada canal eletrodo fluídico. Pipetar 200 l de PBS contendo uma pequena quantidade de rodamina B e suavemente toque para introduzir o fluido dentro da extremidade oposta do canal de eléctrodo. Manter uma pressão suaveaté PBS com rodamina B visivelmente avança até a ponta da ponteira vazio. Repita o procedimento para cada canal de eletrodo. Rodamina B é usado apenas para visualizar fluorescência dos canais de eléctrodos fluídicos. </li><li> Depois de aprontar, preencher cada reservatório ponta da pipeta com PBS com B. Evitar formação de bolha rhodamine nos reservatórios de pontas para pipetas e remover qualquer bolha visível com cuidado pipetando para cima e para baixo. Retire a tubulação de saída e descartar de forma adequada, em seguida, insira um novo reservatório tubulação de saída para recolher o volume alvo. </li></ol> 4. Caracterizando Crossover freqüência de células usando CDEP Chip <ol><li> Posicione o chip no palco de um microscópio invertido equipado com câmera digital (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> Figura 4. </strong&gt; (a) a configuração experimental geral para experimentos CDEP. O chip CDEP está localizado na plataforma de um microscópio invertido. A câmera envia imagens para o computador para gravação. A bomba de seringa mantém um fluxo de entrada constante. O gerador de função que gera um sinal que é intensificada pelo amplificador de alta tensão e ligado ao chip CDEP por eléctrodos de arame. O osciloscópio monitora o sinal enviado para o chip. (B) Visualização de detalhes do chip CDEP e conexões fluídicas e eletrônicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol start="2"><li> Montar seringa na bomba de seringa e inserir eletrodos de fio em reservatórios canal eletrodo fluídicos. </li><li> Bombear o líquido através de 1 ml / h, para assegurar um bom contacto entre a bomba de seringa e a seringa. Inspecione visualmente o comprimento do canal para garantir o fluxo desimpedido de células e ausência de bolhas ou vazamentos. Vermelhocaudal uce a 0.005 ml / h. Nota: O rendimento tão elevado como 1 ml / hr 31,35 foi conseguida em dispositivos de outras geometrias. </li><li> Por segurança, testar os componentes eletrônicos ao ligar o gerador de função, amplificador de alta tensão, e osciloscópio, e ajustar a tensão e frequência desejada. Aqui estes parâmetros são de 200 V e 20 kHz. Após a verificação do desempenho aceitável, desligue. Conecte os eletrodos para amplificador de alta tensão. Nota: Observe os procedimentos de segurança elétrica apropriadas quando estiver operando o sistema eletrônico nas altas tensões usadas para estes experimentos. </li><li> Ao atingir o fluxo estacionário, aplicar a tensão desejada na frequência desejada. Neste experimento, a tensão é de 200 V RMS em freqüências entre 5-60 kHz. </li><li> Gravar arquivos de vídeo da resposta celular com técnicas de processamento de imagem (passo 5) para quantificar a distribuição de células no canal e caracterizar a freqüência crossover. Para fazer isso,manter uma tensão constante e variar a frequência sistemática. No início e no final da experiência, assim como de forma aleatória entre os ensaios experimentais, registar a distribuição de células de controlo, a distribuição das células, sem aplicação de qualquer campo eléctrico. Estimar a quantidade de tempo necessário para que as células de fluxo a partir da entrada para o local de controlo (aqui, 5 minutos). Depois de definir uma nova freqüência, esperar este período de tempo, em seguida, começar a gravar (aqui, a 2 min de vídeo de distribuição celular). </li></ol> 5. Processamento de Imagem para a caracterização Crossover Frequency <ol><li> Usando um script computacional, analisar cada quadro de vídeo de quadro para determinar a posição relativa y (onde a direcção-z é a profundidade vertical do canal, a direcção y é a largura do canal, e na direcção x é o comprimento do canal) de cada célula fluorescente ou de partículas a uma especificada coordenada x, a jusante da região de alta força DEP no canal. Criar um gráfico dos dis relativostribuição. </li><li> Comparar a linha central da distribuição de cada tensão e da frequência com a linha central da distribuição de controlo. Para uma determinada voltagem e frequência variáveis, determinar a frequência de cruzamento, em que a linha central coincide com a posição y do controlo. </li></ol> 6. Variando o Experimento para executar a classificação celular ou Enriquecimento <ol><li> Suspender mistura desejada em tampão de DEP, a uma concentração total de 3 x 10 6 / ml de partículas. Aqui, esta mistura é MOSE células-L com 4 contas mM fluorescentes em tampão DEP. Siga as etapas descritas anteriormente para preparar um dispositivo CDEP. </li><li> Para classificar ou enriquecer as células a partir de uma mistura, determinar as frequências de transição das células alvo e as partículas de fundo, como anteriormente descrito. Operar a experiência, com uma frequência entre as duas frequências de transição das células alvo e as partículas de base, de modo que as duas populações de partículas experimentam forças DEP em frente directions. Para classificar as células MOSE-L e 4 mm de contas, operar o microdispositivo acima 11,90 ± 0,63 kHz. a primeira frequência de transição das células MOSE-L recentemente relatado por Salmanzadeh et al. 33 </li><li> Para recolher o conteúdo de uma amostra classificada, retirar o tubo de saída após a recolha do volume alvo, pela colocação de um dedo de luva através da abertura de saída e puxando suavemente o tubo. Verter o volume alvo recolhido num reservatório para posterior análise Nota:. Outros métodos de recuperação da amostra pode incluir um reservatório de fixação permanente com o chip e retirar a amostra por pipetagem simples. </li></ol>

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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+contactless+dielectrophoresis:+Theoretical+considerations.">Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations.</a> Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).</li><li>Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+beads+and+cells+in+multi-channel+microfluidic+devices+using+dielectrophoresis+and+laminar.">Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar.</a> J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).</li><li>Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis.">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis.">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li></ol>

Dr. Rafael Davalos tem uma patente pendente para dieletroforese contato.

DEP é uma técnica poderosa para determinar propriedades dielétricas de partículas e dirigir partícula movimento para classificar as aplicações, de isolamento, ou de enriquecimento. Devido ao efeito prejudicial do contato direto do eletrodo com uma amostra, outros tomaram abordagens semelhantes ao método apresentado anteriormente para evitar o contato. Por exemplo, Bashir et al. Desenvolveu dispositivos DEP sem contato usando um dispositivo de PDMS microfluídicos separado de eletrodos impressos placa de circuito por uma lamela de vidro fino, e esta técnica também é disponibilizado em formato de vídeo. 23,36 Aqui, demonstramos a fabricação de um chip CDEP e eléctrodos fluídicas através de um único substrato de PDMS, e o protocolo experimental para a separação de células de cancro do ovário a partir de uma mistura de células e esferas fluorescentes. A técnica apresentada foi usado com sucesso para uma variedade de aplicações mais complexas e fisiologicamente relevantes, incluindo a separação de livE e células mortas, 28 de tumor iniciar células a partir de células de câncer de próstata, 30 células de câncer de células vermelhas do sangue diluído, 31,32 e diferenciar entre os estágios do câncer de mama e câncer de ovário 37. 29 CDEP também tem sido utilizado para misturar as partículas 38 Estes. aplicações, sugerem que, usando a técnica simples apresentada, diversas finalidades pode ser realizado simplesmente pela alteração do desenho da geometria do canal. . DEP é útil em microescala para manipulação de partículas 13 para partículas esféricas, a força dieletroforética translacional depende do tamanho e propriedades eléctricas da partícula e o seu meio de suspensão, bem como o gradiente do campo eléctrico ao quadrado: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> onde ε m é a permissividade do meio de suspensão, r é o raioda partícula, e Rc [k (ω)] é a parte real do factor de Clausius-Mossotti (CM). O factor de CM é uma medida da polarizabilidade relativa da partícula em relação ao meio de suspensão e determina a direcção da força dielectrof orética. É descrita como <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> onde <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> e <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> são as permissividades complexos da partícula e média, respectivamente. A permissividade complexa, <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , Depende da condutividade (σ) e freqüência (ω). O fator CM de partículas esféricas é teoricamente limitado entre -0,5 e 1. Se o factor de CM é negativo, as partículas experimentam PADS porque o meio é mais polarizável do que o das partículas, de modo que as partículas se movem fora de regiões degradientes de campo elétrico de alta. Se o factor de CM é positiva, as partículas são mais polarizável do que o meio e que experimentam PDEP em que se movem para as regiões de gradientes elevados do campo eléctrico. Para partículas biológicas que são não homogénea em termos de estrutura, tais como células, o factor de Clausius-Mossotti pode ser determinada a partir de um valor eficaz para a permissividade de partícula: <img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> onde <img alt="Equação 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> e <img alt="Equação 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> 26 r é o raio da célula, e d é a espessura da membrana plasmática; representam a permissividade complexa do permissividade complexa eficaz do interior da célula, tais como o citoplasma, e a membrana de plasma, respectivamente. Quando DEP ocorre com as partículas em suspensão numafluido, o movimento da partícula a em relação ao fluido irá gerar uma força de arrastamento sobre a partícula. Esta força de arrasto deve ser considerada ao determinar a força total atuando sobre a partícula. Para as situações de interesse aqui, forças viscosas dominam e as partículas são assumidas esférica, pequeno, e movendo-se com velocidade relativamente baixa, de modo que a lei arrasto de Stokes fornece uma boa aproximação para a força de arrasto: <img alt="Equação 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> onde η é a viscosidade do fluido, u p é a velocidade da partícula, e u f é a velocidade do fluido, que pode também ser móvel. Dada a força dieletroforética, fluido e propriedades de partículas conhecido, e uma velocidade de fluxo conhecidos, o equilíbrio entre a força de arrasto e a força dieletroforética pode ser resolvido para estimar a velocidade da partícula. A taxa de cisalhamento que a experiência as células devem estar abaixo do limiar a partir do qual cell lise podem ocorrer. Caracterização das propriedades elétricas das partículas é necessário prever e controlar como eles vão reagir sob DEP-los. Neste trabalho, especificamente utilizados baixo CDEP frequência com células MOSE-L para demonstrar o protocolo para determinar o primeiro frequência de transição das células e, em seguida, mostrou a classificação contínua de esferas de poliestireno e células MOSE-L com base em suas respostas opostas DEP. Alterando a geometria do dispositivo CDEP vai mudar os gradientes espaciais do campo elétrico, permitindo que os dispositivos sejam projetados para alta freqüência ou operação de baixa frequência, e em alta seletividade e eficiência de triagem para um tipo de célula especificada. Além disso, os dispositivos de elevada capacidade pode ser desenvolvida por fabricar canais mais largos, 30 canais em paralelo, de 30 ou de fabricação de múltiplas camadas 35, no qual os canais de eléctrodos estão empilhadas verticalmente acima e abaixo relativamente profundacanal de amostra. Membranas finas formar a barreira entre as camadas. Os testes preliminares com dispositivos fabricados em polimetilmetacrilato (PMMA) e policarbonato (PC), os filmes finos demonstraram resposta de células DEP MOSE-L. Os esforços atuais estão em curso para aperfeiçoar dispositivos de alto rendimento multi-camada e para melhorar o sistema periférico no sentido de uma eventual plataforma plug-and-play. Para expandir a partir da técnica experimental básico apresentado, os pedidos e as especificações do dispositivo pode ser adaptado para caber exigências específicas, tais como a triagem contra caracterização, ou a adição de reservatórios de exemplo e um sistema de semi-automatizada para o dispositivo.

Enriquecimento da amostra biológica e de partículas de classificação é muitas vezes necessário para análise posterior. 1, por exemplo, o isolamento de células raras de fluidos corporais tem importantes aplicações em detecção de câncer e medicina individualizada. 2,3 As técnicas de enriquecimento mais comumente utilizados são células ativadas fluorescente (FACS ) 4 e magnético triagem de células activadas (MACS), 5, que dependem de marcadores de superfície expressas para diferenciar células. Outras estratégias incluem hidrodinâmico 6 ou inercial 7,8 triagem, pinças ópticas, 9 acoustophoresis, 10 e dieletroforese. 11,12 dieletroforese é o movimento de uma partícula polarizada na presença de um campo eléctrico não uniforme. DEP 13 tem sido usado para uma vasta gama de aplicações, incluindo as células de triagem 2,14 com base na viabilidade, 15 caracterizando propriedades bioeléctricos de células, 16 e espécieção mediante alterações induzidas nas propriedades biofísicas das células. 17,18 tradicional DEP utiliza eléctrodos planos estampados no interior de um canal microfluídico para aplicar uma tensão e provocar uma não-uniforme do campo eléctrico 13. Embora esta seja uma técnica poderosa, desafios podem surgir, tais como delaminação eletrodo e eletrólise. Dieletroforese baseado isolador (IDEP) 19 abordou os desafios da incrustação, eletrodo de delaminação e degradação espacial do campo eletrodo através de padronização de isolamento estruturas que induzem a não-uniformidades em um campo elétrico DC. IDep foi utilizada para separar selectivamente as células de bactérias vivas e mortas, 19 isolar os esporos bacterianos, 20 e manipular o ADN, 21, entre outras aplicações. Aquecimento de Joule pode ser um desafio, porque ele pode ocorrer como resultado das altas voltagens DC, muitas vezes exigidas. Para amenizar esses desafios, microdevices DEP livre de contato têm sido desenvolvidos. 22-24 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A técnica aqui apresentada utiliza contactless dieletroforese (CDEP), assim chamado pela falta de contato direto entre os eletrodos metálicos e do canal de amostra. 22 Exclusivo para esta estratégia é a substituição de eletrodos metálicos com canais cheios de fluido com eletrodo uma solução altamente condutora. Estes eléctrodos de fluido estão capacitivamente acoplados através de uma barreira de isolamento fino para o canal de amostra por meio de uma tensão alternada. Eliminando o contato da amostra com eletrodos reduz problemas associados aos métodos baseados em DEP como eletrólise e formação de bolhas, contaminação da amostra, e eletrodo de delaminação. Como resultado, CDEP é especialmente útil para amostras biológicas porque suporta a viabilidade das células na amostra. Importante, CDEP pode manter a esterilidade da amostra. Um chip pode ser preparado de um capuz de cultura de células e o ensaio pode ser realizado sem a necessidade de contacto da amostra para eléctrodos de metal ou exigindo que a amostra seja aberto à Environment. Um reservatório simples pode ser fixado à saída de chip para facilitar a recuperação da amostra estéril. Além disso, a fabricação de eléctrodos de fluidos a partir do mesmo material polímero biocompatível (PDMS) como o canal de amostra reduz o custo elevado efectuadas com padrões costume de eléctrodos de metal, o tempo necessário para a fabricação, e limita a necessidade de equipamento especializado para a sala limpa padronização inicial do selo wafer de silício reutilizável. Movimento de partículas devido à DEP depende das características da partícula e o meio, bem como os gradientes espaciais do campo eléctrico. Uma partícula e dependente da frequência fator, chamado o factor de Clausius-Mossotti (CM), tem um valor no intervalo de -0,5 a 1, e determina a direcção da força DEP. A freqüência com que o fator de CM é exatamente zero é chamada de frequência de crossover. Este é o ponto em que nenhuma força é exercida sobre dieletroforética uma partícula e o sinal de alteração do factor de CM. A sfrequência de crossover ingle para microesferas sólidas inertes ocorre quando o fator CM alterações de negativa para positiva 25 Para células de mamíferos em tampão baixa condutividade da ordem de 0,01 S / m, uma freqüência primeiro cruzamento que indica uma transição de PADS para PDEP existe perto 10. - 100 kHz, e é influenciado pelo tamanho, forma, citoesqueleto, e propriedades da membrana da célula. 26,27 Uma segunda frequência de cruzamento a uma mudança da PDEP ao regime PADS é ​​da ordem de 10 MHz, e é influenciada pela relação núcleo-citoplasma, o citoplasma de condutividade, e retículo endoplasmático. 27 força DEP pode ser aplicada sem a presença do fluxo do fluido, mas aqui utiliza um fluido que se escoa para conseguir separação contínua das partículas suspensas. A influência combinada da força dieletroforética e força de arrasto de Stokes ditar o movimento de translação de uma partícula. Temos desenvolvido dispositivos para a operação em duas faixas de freqüência. Frequenc Superiordispositivos y (100-600 kHz) têm operado usando PDEP e alcançou a classificação do lote de células, como células tumorais da próstata iniciando (TICs), epiteliais da superfície ovariana células murino (Mose), MDA-MB-231 células de câncer de mama, ou viver THP -1 células prendendo seletivamente as células de interesse em isolar as mensagens localizadas no canal de amostra. 28-31 menor freqüência (5-100 kHz) dispositivos operam de forma contínua, e quando operado a uma freqüência na qual uma população experimenta PDEP enquanto a população fundo experiências PADS, pode redirecionar trajetórias de partículas para conseguir a classificação. 32-34 Estes dispositivos de baixa freqüência têm sido utilizados para classificar as células cancerosas a partir de células vermelhas do sangue, determinar as mudanças nas propriedades dielétricas de uma linha celular MOSE progressiva, e para elucidar os efeitos da não- tratamentos sphingolipid tóxicos em reverter características agressivas de células Mose agressivos. Além disso, microdevices CDEP pode ser projetado para operar em maior produção, atualmente de até 1 ml / hr. 31,35 Conforme descrito, a flexibilidade e baixo custo do processo de fabricação permite geometria do dispositivo customizados, que permitem que o processo experimental apresentado de ser relevante para uma vasta gama de aplicações. O objetivo a longo prazo da CDEP é realizar triagem de células isento de selo e de enriquecimento em nível clínico, com a recuperação da amostra para a cultura ou o processamento subseqüente. A técnica apresentada aqui é um método simples e barato, desde a fabricação até a experimentação, o que aumenta a acessibilidade da DEP. Nós demonstrar a preparação de um chip CDEP e o protocolo experimental para alcançar enriquecimento e caracterização de células de cancro do ovário a partir de microesferas fluorescentes.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

Dieletroforese (DEP) é o fenómeno pelo qual polarizado partículas num campo eléctrico não uniforme sofrer movimento de translação, e pode ser utilizada para dirigir o movimento de micropartículas de um modo independente do marcador de superfície. Tradicionalmente, os dispositivos DEP incluem eletrodos metálicos planos estampados no canal de amostra. Esta abordagem pode ser caro e requer um ambiente de sala limpa especializado. Recentemente, foi desenvolvida uma abordagem livre de contato chamado dieletroforese contactless (CDEP). Este método utiliza o princípio clássico da DEP, evitando o contato direto entre os eletrodos e amostra de padronização eletrodos fluídicos e um canal de amostra de um único polidimetilsiloxano (PDMS) substrato, e tem aplicação como uma estratégia de microfluídica rápido projetado para classificar e enriquecer micropartículas. Original para este método é que o campo eléctrico é gerado através de canais de eléctrodos fluídicos contendo um fluido altamente condutor, que são separadas dacanal de amostra por uma barreira isolante fina. Porque eletrodos de metal não contactar directamente a amostra, eletrólise, eletrodo delaminação, e contaminação da amostra são evitados. Além disso, isto permite um processo de fabrico simples e barato. CDEP é, portanto, bem adequado para a manipulação de partículas biológicas sensíveis. A força dieletroforética atuando sobre as partículas depende não apenas gradientes espaciais do campo elétrico gerado pelo projeto customizável da geometria do dispositivo, mas as propriedades biofísicas intrínsecas da célula. Como tal, CDEP é uma técnica sem etiqueta que evita dependendo biomarcadores moleculares expressas na superfície que pode ser variável expressas dentro de uma população, permitindo ainda a caracterização, o enriquecimento, e classificação de partículas biológicas. Aqui, nós demonstrar os conceitos básicos de fabricação e experimentação usando CDEP. Nós explicamos a preparação simples de um chip CDEP utilizando litografia suavetécnicas y. Discute-se o procedimento experimental para a caracterização de frequência de transição de uma partícula ou celular, a freqüência com que a força dieletroforética é zero. Finalmente, foi demonstrado o uso desta técnica para a triagem de uma mistura de células de cancro do ovário e microesferas fluorescentes (esferas).

DEP devem ser observada qualitativamente no canal de amostra para confirmar que o dispositivo está operacional, quando o campo eléctrico está presente. Um método para testar a presença de DEP é ajustar a frequência para valores perto da frequência de cruzamento onde forte PDEP e PADS está previsto (cerca de&gt; 40 kHz para observar PDEP e &lt;10 kHz para observar PADS para a maioria das células cancerosas de mamífero em um tampão com condutividade de 100 mS / cm). Deve-se notar que as microesferas inertes exibem PDEP abaixo da sua frequência de crossover e PADS acima de sua freqüência de crossover. Para a geometria característica dente de serra aqui apresentada, PDEP deve ser visto por células na freqüência de teste superior, indicado pela ocorrência de pérola encadeamento e foco de células ou partículas na borda característica dente de serra do canal, enquanto que a freqüência de teste inferior, PADS Deve ser evidente que as células estão restritos à região mais próxima da borda rectilínea do canal. A estas baixas frequências, as células podem lysE devido a electroporação, assim, a amostra pode parecem conter menos células, e aqueles que estão disponíveis podem aparecer alargada ou desfocada se utilizando um corante fluorescente enzimaticamente activada. Verificando as freqüências nas quais ocorrem PDEP e PADS permite a determinação da frequência de transição, conforme descrito no protocolo. No caso de células cancerosas de mamífero, tais como L-MOSE utilizados aqui, observou-se PADS a 5 kHz (Figura 5a) e forte PDEP a 60 kHz (Figura 5b). Células MOSE-L tinha um diâmetro de 17,7 ± 3,3 um (n = 268 células) e os grânulos têm um diâmetro nominal de 4 mm. Uma análise completa das propriedades dielétricas de células MOSE-L, em comparação com células Mose em estágios iniciais de progressão pode ser encontrada no recente trabalho de Salmanzadeh et al. 33 Se PDEP e PADS não são observadas nesses extremos, vários problemas podem estar ocorrendo. A condutividade da amostra pode ser muito alto devido a contaminantes ou lise celular. INSUFICIENTEnt campo eléctrico pode ser gerado devido a bolhas de ar nos canais do eléctrodo de fluido, o que impede a condução da corrente para a porção de um dos canais que fazem fronteira com o canal de amostra. Fluxo instável pode ser causada por uma bolha aprisionada na seringa ou tubagem de admissão, a partir de bolhas resultante não manter o dispositivo sob vácuo durante um tempo suficiente ou não encher rapidamente o dispositivo após a remoção do vácuo, o vazamento, devido à delaminação de PDMS fracamente ligadas ao lâmina de vidro, com lágrimas nos a membrana de barreira devido à força excessiva exercida quando do preenchimento dos canais, ou taxas de fluxo nos extremos da faixa de operação da bomba. Além de determinar a frequência de cruzamento de células, esta técnica pode ser utilizada para classificar uma mistura, aqui ilustrada por uma mistura de células-L MOSE e grânulos. Este exemplo aproveita a dieletroforese negativo (PADS) exibida por 4 mm de contas em freqüências onde as células MOSE-L experimentar dieletroforese positivo (PDEP). Nós operated o dispositivo a 200 V RMS e 10 kHz (Figura 6a) e observou-se que ambas as células e os grânulos foram misturados à medida que experimentaram PADS. Aos 50 kHz observamos movimento de células MOSE-L para o topo do canal, enquanto que os grânulos eram restritas à parte inferior do canal, permitindo a separação da mistura em duas componentes (Figura 6b). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> Figura 5. A posição de células MOSE-L é manipulada alterando a frequência do campo eléctrico aplicado. As fotos foram tiradas no recurso de dente de serra final no canal de amostra e os eléctrodos fluídicos estão localizados nos cantos do lado direito. Eles são cheios com PBS contendo rodamina B, o qual fluoresce de visualizar os canais. (A) células MOSE-L experimentar PADS a 200 V RMS<html> e 5 kHz. (b) células MOSE-L experimentar encadeamento de pérolas e PDEP a 200 V RMS e 60 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> Figura 6. Uma mistura de células MOSE-G (verde) e 4 mm de contas (vermelho) fluem através do recurso de dente de serra final no canal de amostra de um dispositivo CDEP de baixa freqüência. (A) Em 200 V e 10 células kHz e miçangas são misturados. As setas indicam a fraca aparecendo células que provavelmente morreram devido às condições de baixa freqüência. (B) Em 200 V e células 50 kHz experimentar PDEP e mover-se para a borda característica do canal, enquanto esferas de experimentar PADS e permanecer confinado à região mais próxima a borda em linha reta.&quot;target =&quot; _blank p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura.

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Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dieletroforese Contactless (CDEP) alcança a classificação e enriquecimento de partículas através de suas propriedades dielétricas intrínsecas. Canais de eletrodos fluídicos substituir os eletrodos metálicos tradicionais para DEP, adequando CDEP para não danificar caracterização estéril e classificação de partículas biológicas. Demonstramos como preparar um microdispositivo CDEP e realizar a caracterização das células e experimentos de classificação.

Isolamento livre-Label e enriquecimento de células através de contato dieletroforese

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

label-free-isolation-enrichment-cells-through-contactless

Research

JoVE Journal

Medicine

15.9K visualizações.  Virginia Tech.  Dieletroforese Contactless (CDEP) alcança a classificação e enriquecimento de partículas através de suas propriedades dielétricas intrínsecas. Canais de eletrodos fluídicos substituir os eletrodos metálicos tradicionais para DEP, adequando CDEP para não danificar caracterização estéril e classificação de partículas biológicas. Demonstramos como preparar um microdispositivo CDEP e realizar a caracterização das células e experimentos de classificação....

Vídeo: Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Medicina

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Em Enriquecimento vitro de câncer de ovário de iniciação Células Tumorais

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...