Desteklenen bu çalışma, Ulusal Bilim Hibe No EFRI 0938047 altında Vakfı ve Kritik Teknoloji ve Uygulamalı Bilimler Virginia Tech Enstitüsü (İÇTAŞ) tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar MOSE-L hücrelerinin kendi tür hediye Dr Eva Schmelz ve Dr Paul Roberts için takdirlerimi ifade etmek isterim. Yazarlar onun bu belgeyi düzenleme ve deney hazırlama ile ona yardım için hücre kültürü, caitlan Swaffar ile yardım ve tüm Bioelectromechanical Sistemleri laboratuvar üyeleri için Angela Anderson kabul.

1.. Genel Bakış: Bir Prototip cDEP mikroakışkan Aygıt Fabricating <ol><li> Bir silikon gofret içine istenen kanal tasarımı (Şekil 1) (Şekil 2) etch photoresist&#39;i ve Derin Reaktif İyon dağlama (DRIE) kullanılarak önceden bildirilen prosedürleri 22 izleyin. Gofret mikrocihazda salınmasını geliştirmek için Teflon ince bir tabaka bırakın. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> Şekil 1. Düşük frekanslı sürekli ayıklama cihazın şematik. Numune kanal çalışır sağa sola ve 100 um testere daralması ile 500 mikron genişliğinde. Akışkan elektrot kanallarının iki çift, sırasıyla, kaynak ve alıcı elektrotları oluşturmak ve bir 20 mikron kalınlığında PDMS bariyer numune kanaldan ayrılır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> Şekil 2. FabrBir cDEP cihazın ication işlemi. (a) 60 saniye için, UV ışığı selektif olarak cDEP cihaz geometrisinin bir maske desen üzerinden maruz fotorezist ile reaksiyona girer. (b) Fotorezist geliştirici kullanılarak kaldırılır. (c) Derin Reaktif İyon Aşındırma (DRIE) 50 um derin özellikleri aşındırma ve 70 ° C&#39;de tetrametilamonyum hidroksit (TMAH)% 25 ıslak aşındırma 5 dk için kullanılan yan duvarlarda pürüzlülüğü azaltmak için kullanılır. (d) bir Teflon kaplama aygıtı salınmasını geliştirmek üzere eklenmektedir gofret. (e) PDMS gazı gittikten sonra yeniden kullanılabilir gofret pul üzerine döküldü ve 100 ° F (f) PDMS gofretin çıkarılır, 45 dakika boyunca sertleştirilir. PDMS ve temiz bir cam slayt 2 dakika boyunca hava plazmaya maruz kalan ve birbirine bağlanır. <ol start="2"><li> Dökülmesine önlemek için alüminyum folyo ile sarın gofret. Yaklaşık 20 dakika boyunca madde, de-gaz sertleştirme elastomer 10:01 oranında polidimetilsiloksan (PDMS) karıştırın, Ve gofret üzerine dökün. Sıcaklık 100 ° C &#39;de 45 dakika boyunca damganın Teflon kaplamanın zarar görmesini önlemek. Cihazın soğumasını bekleyin. </li><li> Soğutma işleminden sonra, alüminyum folyo kaldırmak bir cerrahi bıçak kullanılarak PDMS Döşeme ve boru boyutuna uygun olan bir kör zımba kullanarak kanal giriş / çıkışında erişim delikler. Burada, bir 1.5 mm künt zımba kullanılır. </li><li> Sırasıyla su ve sabunla durulama, etanol, DI su ve hava ile kurutma, kullanarak bir cam mikroskop lamı temizleyin. Scotch Magic bandı kullanarak PDMS Aygıtı temizleyin. Kanallar temiz olduğundan emin olmak için mikroskop altında inceleyin. 2 dakika boyunca hava plazma slayt ve PDMS cihaz Açığa. Sıkıca cihazı ve slayt (Şekil 3) arasındaki hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek, cam slayt cihazının kanal tarafına basın. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. </strong&gt; (a) silikon yonga damga üretimi ve örnek sırasıyla yeşil ve kırmızı gıda boyası, dolu sıvı elektrot kanalları (b) PDMS işlenmiş cam cihaz sırasında fotolitografi için kullanılan maske. Boyutları için Şekil 1&#39;e bakınız. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . 2. DEP Tamponu içinde bir hücre süspansiyonunun hazırlanması <ol><li> &quot;DEP tamponu&quot; olarak adlandırılacaktır düşük iletkenlik hazırlayın (100 uS / cm) tamponu (% 8.5 sukroz [ağırlık / hacim]% 0.3 glükoz [ağırlık / hacim]% 0,725 RPMI [ağırlık / hacim]) . 16. </li><li> 3 x 10 6 hücre / ml &#39;de DEP tamponu içerisinde hücrelerin süspansiyonu. Burada, kanserli geç evre yumurtalık fare yüzey epitel (MOSE-L) hücreleri kullanılır. </li></ol> Not: tripan mavi boya dışlama yöntemi ile hücre canlılığı analizi canlılığı hafif bir düşüş gösterdi5 saat sonra, oda sıcaklığında DEP tampon maddesi içinde süspansiyon haline erken evre MOSE (MOSE-E) hücreleri (95.1-91.6 &#39;den%). Bu canlılığı benzer hafif bir azalma hücreleri uzun süreli tampon DEP saklanmalıdır gerektiğini belirten MOSE-L hücreleri için meydana geldiği tahmin edilmektedir. <ol start="3"><li> Bu tür enzimatik olarak aktive edilmiş Calcein AM gibi bir floresan zar geçirgen boya kullanarak hücreleri Boya. </li><li> Boyalı hücre süspansiyonu iletkenliği ölçülmektedir. Iletkenlik yaklaşık 100 us / cm olmalıdır. Iletkenlik ölçme çok yüksek ise, 6 hücre / ml x 10 3 de DEP tampon içinde tekrar süspansiyon aşağı örnek spin ve iletkenlik ölçümü tekrarlayın. </li></ol> 3. CDEP mikroakışkan Chip yükleniyor <ol><li> 30 dakika boyunca vakum altında mikroakışkan çip yerleştirin. </li><li> Bu arada, mikroakışkan çip yer alacak mikroskop sahneye şırınga pompasından mesafe yayılan esnek tüp bir parça kesti. Burada, boru içinde bir 6 inç uzunlukgereklidir. Şırınga, iğne ucu Fit boru. </li><li> Borunun kesit alanı ile hedef toplanan numune hacmine bölünmesiyle çıkış boru için gerekli uzunluğu tahmin. Boru uzunluğunu gerektirir kesin. </li><li> Şırıngaya hücre süspansiyonu çizin. Kabarcıklar boru veya şırınga yer olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Vakum dan çipi kaldırılması üzerine, kanallarda hapsolmuş hava kabarcıklarını önlemek için hızlı bir çıkış boru ve prime örnek Kanalı ekleyebilir. Bariyer yalıtım ince (20 um) kırılması önlemek için astar zaman, bariyer yırtmadan 5 ml / saat yakın sabit bir yüksek iş dayanabilir gözlenmektedir da yavaşça, şırınga dokunun. </li><li> Başbakan elektrot kanalları, hızlı bir şekilde her akışkan elektrot kanalın bir çıkış boş pipet uçları yerleştirmek. Rhodamine B küçük bir miktar ihtiva eden 200 ul PBS pipet ve yavaşça elektrot kanalının karşı ucuna sıvı tanıtmak dokunun. Hafif basınç koruyunrhodamine B ile PBS gözle boş pipet ucu kadar ilerleyene kadar. Her bir elektrot kanal için tekrarlayın. Rhodamine B, sadece flüoresan akışkan elektrot kanalları göstermek için kullanılır. </li><li> Emişli sonra, pipet ucu rezervuarlarda rhodamine B. kaçının kabarcık oluşumu ile PBS ile her pipet haznesine, yukarı ve hafifçe aşağı pipetleme tarafından görünür bir kabarcık kaldırın. Çıkış tüpünü ayırın ve uygun atın, sonra hedef hacmi toplamak için yeni bir çıkış tüp deposunu takın. </li></ol> 4. CDEP Chip kullanarak Hücreler karakterize Crossover Frekansı <ol><li> Dijital kamera (Şekil 4) ile donatılmış bir inverted mikroskop sahnede çip yerleştirin. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> Şekil 4. </strong&gt; (a) cDEP deneyler için genel deney düzeneği. CDEP çip ters mikroskop platformun üzerinde yer alır. Bir kamera kayıt için görüntüleri bilgisayara gönderir. Şırınga pompası, sabit bir giriş akış tutar. Fonksiyon jeneratörü, yüksek gerilim yükseltici tarafından girdi ve tel elektrotlar ile cDEP çipe bağlı olan bir sinyal üretir. Osiloskop çip gönderilen sinyalini izler. (B) cDEP çip ve akışkan ve elektronik bağlantılarının Detay görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <ol start="2"><li> Şırınga pompası şırınga monte ve akışkan elektrot kanal rezervuar içine tel elektrotlar eklemek. </li><li> Şırınga pompası ve şırınga arasında iyi bir temas sağlamak için, 1 ml / saatte boyunca sıvı pompalanması. Görme engelsiz hücrelerin akışını ve kabarcıkların veya sızıntı olmamasını sağlamak için kanal uzunluğunu kontrol edin. Kırmızı0.005 ml / saat akış oranı UCE. Not: 1 ml / saat 31,35 kadar yüksek Throughput diğer geometrilere cihazlarda elde edilmiştir. </li><li> Güvenliğiniz için, fonksiyon jeneratörü, yüksek gerilim amplifikatör ve osiloskop üzerinde güç ve istenilen gerilim ve frekansa ayarlayarak elektronik test edin. İşte bu parametreler 200 V ve 20 kHz bulunmaktadır. Kabul edilebilir performans, güç kapalı doğrulanması üzerine. Yüksek gerilim elektrotları amplifikatöre bağlayın. Not: Bu deneyler için kullanılan yüksek voltajlı elektronik çalışırken uygun elektrik güvenlik prosedürlerine dikkat. </li><li> Sürekli akışı sağlanması üzerine, istenilen frekansta istenilen gerilim uygulayın. Bu deneyde, gerilim 5-60 kHz arasındaki frekanslarda 200 V RMS olduğunu. </li><li> Görüntü işleme teknikleri kanal hücre dağılımı ölçmek için ve geçiş frekansı karakterize etmek için (adım 5) ile hücre tepkisinin kaydedin video dosyaları. Bunu yapmak için,sabit bir gerilim muhafaza ve sistematik olarak frekans değişir. Deney, hem de rasgele deneysel çalışmalar arasında başlangıcında ve sonunda, herhangi bir elektrik alanı uygulamadan hücrelerinin dağılımını kontrol hücre dağılımı kaydedin. Hücreleri (burada, 5 dakika) izlenen konuma girişten akması için gereken zaman miktarını tahmin. Yeni frekansı ayarladıktan sonra, sonra (burada, hücre dağılımının 2 dk Video) kayıt yapmaya başlar, bu kadar süre bekleyin. </li></ol> 5. Karakterizasyon Crossover Frekans Görüntü İşleme <ol><li> Bir bilgisayar komut dosyası kullanarak, bağıl konum y-(z-yönünde kanalın derinliği dikey olduğu yerde, Y-yönünde kanal genişliği, ve x-yönünde kanal uzunluğu) tespit etmek üzere, her bir video çerçeve kare analiz her flüoresan hücre veya parçacığın bir alt kanal yüksek DEP kuvvet bölgeden x koordinatı belirtilmiş. Göreli dis bir grafik oluşturmaktribution. </li><li> Kontrol dağılımının merkez her voltaj ve frekansta dağılımın merkez karşılaştırın. , Belirli bir voltaj ve farklı frekanslar için, merkez denetimin y-pozisyonunda eşleşen geçiş frekansını belirler. </li></ol> 6. Hücre sıralanması veya Zenginleştirme Gerçekleştirme Experiment değişen <ol><li> 3 x 10 6 partikül / ml &#39;lik bir toplam konsantrasyonda DEP tamponu içerisinde arzu edilen karışımı sterilize edilir. Burada, bu karışım DEP tampon maddesi içinde 4 um floresan boncuklar ile MOSE-L hücredir. Bir cDEP cihaz hazırlamak için daha önce tarif edildiği adımları. </li><li> Bir karışımdan hücreleri sıralamak veya zenginleştirmek için, hedef hücrelerin çapraz frekansları ve daha önce anlatıldığı gibi, arka plan parçacıkları belirler. Parçacıkların popülasyonlar zıt d DEP kuvvetler yaşarlar, böylece hedef hücrelerin ve arka plan parçacıkların iki çapraz frekansları arasında bir frekansta deneme çalıştırınirections. MOSE-L hücreleri ve 4 mikron boncuk sıralamak için, 11,90 ± 0.63 kHz yukarıda mikrocihazda çalışır. Son zamanlarda Salmanzadeh et al. 33 tarafından rapor MOSE-L hücreleri ilk geçiş frekansı </li><li> Bir sıralı numunenin içeriğini toplamak için, çıkış ağzına eldiven parmağını yerleştirerek ve hafifçe boru asılarak, hedef hacmi toplama üzerine çıkış tüpünü çıkarın. Daha fazla analiz için bir rezervuar içine toplanmış hedef hacmi dökün Not:. Diğer örnek kurtarma yöntemleri çip kalıcı rezervuar bağlama ve basit pipetleme örnek kaldırarak içerebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Butler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell culture and upstream processing. , (2007).</li><li>Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+Cell+Capture+in+Microfluidic+Devices.">Rare Cell Capture in Microfluidic Devices.</a> Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+cells+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature.</a> Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).</li><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+activated+cell+sorting.">Fluorescence activated cell sorting.</a> The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).</li><li>Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitarget+magnetic+activated+cell+sorter.">Multitarget magnetic activated cell sorter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).</li><li>Chabert, M., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+high-throughput+encapsulation+and+hydrodynamic+self-sorting+of+single+cells.">Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).</li><li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+inertial+focusing,+ordering,+and+separation+of+particles+in+microchannels.">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).</li><li>Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidics.">Inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).</li><li>Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+single-cell+sorting+system+based+on+optical+trapping.">Automated single-cell sorting system based on optical trapping.</a> J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).</li><li>Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+(SAW)+acoustophoresis:+now+and+beyond.">Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond.</a> Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).</li><li>Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Article-Dielectrophoresis:+Status+of+the+theory,+technology,+and+applications.">Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications.</a> Biomicrofluidics. 4, (2010).</li><li>Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+separation+of+cancer+cells+from+blood.">Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood.</a> Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).</li><li>Pohl, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , (1978).</li><li>Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+cells+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature.</a> Journal of Membrane Science. , (2012).</li><li>Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Viable+and+Nonviable+Yeast+Using+Dielectrophoresis.">Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis.</a> J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).</li><li>Flanagan, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+dielectric+properties+distinguish+stem+cells+and+their+differentiated+progeny.">Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny.</a> Stem Cells. 26, 656-665 (2008).</li><li>Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+multidrug+resistance+reversal+using+dielectrophoresis+and+flow+cytometry.">Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry.</a> Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).</li><li>Hoettges, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis-activated+multiwell+plate+for+label-free+high-throughput+drug+assessment.">Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment.</a> Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).</li><li>Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulator-based+dielectrophoresis+for+the+selective+concentration+and+separation+of+live+bacteria+in+water.">Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water.</a> Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).</li><li>Davalos, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+impact+of+dynamic+surface+coatings+on+polymeric+insulator-based+dielectrophoretic+particle+separators.">Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).</li><li>Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+manipulation+by+means+of+insulator-based+dielectrophoresis+employing+direct+current+electric+fields.">DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields.</a> Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).</li><li>Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contactless+dielectrophoresis:+a+new+technique+for+cell+manipulation.">Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation.</a> Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).</li><li>Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis-based+cell+manipulation+using+electrodes+on+a+reusable+printed+circuit+board.">Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board.</a> Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).</li><li>Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+focusing+in+a+contactless+dielectrophoretic+microfluidic+chip+with+insulating+structures.">Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures.</a> Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).</li><li>Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC+electrokinetics:+applications+for+nanotechnology.">AC electrokinetics: applications for nanotechnology.</a> Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).</li><li>Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis:+Status+of+the+theory,+technology,+and+applications.">Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications.</a> Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).</li><li>Pethig, R., Ferrari, M. a. u. r. o., Ozkan, M. i. h. r. i. m. a. h., Heller, M. i. c. h. a. e. l. . J. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.">Ch. 4.</a> BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. 4, 103-126 (2007).</li><li>Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+isolation+of+live/dead+cells+using+contactless+dielectrophoresis+(cDEP).">Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP).</a> Lab Chip. 10, 438-445 (2010).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+differentiation+of+mouse+ovarian+surface+epithelial+cells,+macrophages,+and+fibroblasts+using+contactless+dielectrophoresis.">Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis.</a> Biomicrofluidics. 6, (2012).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+prostate+tumor+initiating+cells+(TICs)+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature.</a> Lab Chip. 12, 182-189 (2012).</li><li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Blood+Cells+Using+Dielectrophoresis.">Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis.</a> , (2012).</li><li>Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+development+of+a+low+frequency+contactless+dielectrophoresis+(cDEP)+platform+to+sort+cancer+cells+from+dilute+whole+blood+samples.">Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples.</a> Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Dielectric+Properties+of+Different+Stages+of+Syngeneic+Murine+Ovarian+Cancer+Cells.">Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells.</a> Biomicrofluidics. , (2013).</li><li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , 590-593 (2012).</li><li>Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+contactless+dielectrophoresis:+Theoretical+considerations.">Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations.</a> Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).</li><li>Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+beads+and+cells+in+multi-channel+microfluidic+devices+using+dielectrophoresis+and+laminar.">Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar.</a> J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).</li><li>Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis.">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis.">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li></ol>

Dr Rafael Davalos temassız dielektroforez için bekleyen bir patente sahip.

DEP parçacıkların dielektrik özelliklerinin belirlenmesi ve izolasyon veya zenginleştirme uygulamaları sıralama doğru parçacık hareketini yönlendirmek için güçlü bir tekniktir. Nedeniyle bir numune ile doğrudan temas elektrod zararlı etkisi, başkalarının temasını önlemek için, daha önce sunulan yönteme benzer yaklaşımlar geliştirmişlerdir. Örneğin, Beşir vd. Ince bir cam lamel ile baskılı devre kartı elektrotlar ayrılmış microfluidic PDMS cihaz kullanarak temassız DEP cihazları geliştirildi ve bu teknik aynı zamanda video formatında kullanılabilir yapılır. 23,36 Burada, tek bir PDMS substrat kullanılarak bir çip cDEP ve akışkan elektrotların imalat ve hücre ve floresan boncuk karışımından yumurtalık kanser hücrelerinin ayrılması için deney protokolü göstermiştir. Sunulan tekniği başarıyla liv sıralama içeren daha karmaşık ve fizyolojik ilgili uygulamalar, çeşitli için kullanılır olmuşture ve ölü hücreler, 28 tümör prostat kanseri hücreleri hücreler söz seyreltilmiş, kırmızı kan hücreleri, 31,32 ve 37 meme kanseri ve yumurtalık kanseri aşamalar arasında farklılaşan 30 kanser hücreleri. 29 cDEP da parçacıkların karıştırılması için kullanılmıştır. 38 Bu uygulamalar yer alan basit bir teknik kullanılarak, çeşitli amaçlar kanal geometrisinin tasarımını değiştirerek basitçe gerçekleştirilebilir olduğunu göstermektedir. . DEP parçacıklar küresel parçacıklar için 13 manipülasyonu için böylece mikro yararlı olan, translasyon dielektroforetik kuvvet büyüklüğü ve elektrik parçacık ve süspansiyon ortamının özellikleri, hem de elektrik alanının gradyanı kare bağlıdır: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> ε m süspansiyon ortamının geçirgenliği olduğu, r yarıçapıParçacığın ve Rc [k (ω)] Clausius-Mossotti (CM) faktörü gerçek bir parçasıdır. CM etken süspansiyon ortamı ile karşılaştırıldığında parçacık göreli polarize bir ölçüsüdür ve dielektroforetik kuvvet yönünü belirler. Bu olarak tanımlanmaktadır <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> nerede <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> ve <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> sırasıyla parçacık ve orta, karmaşık geçirgenlik değerinin bulunmaktadır. Karmaşık geçirgenlik, <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , Iletkenlik (σ) ve frekans (ω) bağlıdır. Küresel parçacıklar CM faktörü teorik olarak -0.5 ve 1 arasında bağlıdır. CM faktör negatif ise orta parçacık daha polarize olabilir, yani parçacıklar bölgelerinden uzaklaşacak, çünkü, parçacıklar NDEP deneyimyüksek elektrik alan eğimleri. CM faktörü pozitif ise, parçacıklar orta daha fazla polarize olabilir ve bunlar, yüksek elektrik alan gradyanları bölgelerine doğru hareket ettiği pDEP deneyim. Bu hücrelerin gibi yapıda homojen olmayan biyolojik parçacıklar için, Clausius-Mossotti faktör parçacık geçirgenlik için etkili değerinden belirlenebilir: <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> nerede <img alt="Denklem 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> ve <img alt="Denklem 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> örneğin, sırasıyla sitoplazma gibi hücresinin iç, ve plazma membranı, etkin kompleks geçirgenlik ve karmaşık geçirgenliği olan,. r hücrenin yarıçapı, d, plazma zarının kalınlığı 26 Özellikle de, bir süspansiyon içinde parçacıklarla oluştuğundaSıvı, akışkan verilmesi için parçacık nisbetle hareket parçacık üzerinde bir sürükleme kuvveti oluşturur. Parçacık üzerindeki genel kuvvetini belirleyen bu sürtünme kuvveti dikkate alınmalıdır. Burada ilgi durumlar için, viskoz kuvvetlerin hakim ve parçacıklar, küresel, küçük ve nispeten düşük hız ile hareket kabul edilir, bu yüzden Stokes &#39;sürükle yasa sürtünme kuvveti için iyi bir yaklaşım sağlamaktadır: <img alt="Denklem 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> η akışkanın viskozitesidir burada, u p parçacığın hızıdır, ve f u da hareketli olabilir sıvısının hızıdır. Dielektroforetik kuvvet, sıvı ve partikül özellikleri bilinmektedir ve bilinen bir akış hızı göz önüne alındığında, sürtünme kuvveti ve dielektroforetik kuvvet arasındaki denge parçacık hızını tahmin etmek için çözülebilir. Hücreler deneyim eşiğin altında olması gerekmektedir kesme oranı olan, c, enell yokedici oluşabilir. Parçacıkların elektriksel özelliklerinin karakterizasyonu tahmin ve DEP altında nasıl tepki vereceğini kontrol etmek gereklidir. Bu çalışmada, özellikle hücrelerin ilk geçiş frekansını belirlemek için protokol göstermek için MOSE-L hücreleri ile düşük frekanslı cDEP kullanılan ve daha sonra muhalif DEP cevaplara dayanarak polistiren boncuklar ve MOSE-L hücrelerinin sürekli sıralama gösterdi. CDEP cihazın geometrik cihazlar yüksek frekans veya düşük frekanslı bir biçimde çalıştırılabilmesi için tasarlanmış izin vererek, elektrik alanının uzamsal değişim derecelerine değiştirebilir ve yüksek seçicilik ve belirli bir hücre tipi için ayırma verimliliği için değiştirme olur. Ayrıca, yüksek kapasiteli cihazlar daha geniş bir kanal imal edilmesi ile geliştirilebilir, paralel, 30 olarak ya da dikey olarak elektrot kanalları nispeten derin altında ve üstünde istiflenmiş olan çok katmanlı imalat 35, 30 kanallarörnek kanalı. Ince zarlar tabakalar arasındaki bir bariyer oluşturur. Polimetilmetakrilat (PMMA) ve polikarbonat fabrikasyon cihazlar ile ön test (PC) ince filmler MOSE-L hücrelerinin DEP tepki göstermiştir. Şimdiki çabalar, çok katmanlı yüksek verimli cihazlar rafine ve nihai bir plug-and-play platform karşı periferik sistemini geliştirmek için çalışmalar devam etmektedir. Sunulan temel deneysel tekniği genişletmek için, cihazın uygulamalar ve özellikler gibi karakterizasyonu karşı sıralama veya cihaza örnek rezervuarları ve yarı-otomatik sistem ekleme gibi özel talepleri sığdırmak için uygun olabilir.

Biyolojik örnek zenginleştirme ve parçacık ayırma sonraki analiz için çoğu zaman gereklidir. 1. Örneğin, vücut sıvılarından nadir hücrelerinin izolasyonu kanser tespiti ve tek tek tıp kapsamında önemli tatbikatlara sahiptir. 2,3 En yaygın olarak kullanılan ayırma teknikleri zenginleştirme floresan aktive hücre vardır (FACS ) 4 ve manyetik aktif hücre (MACS), hücreleri ayırt etmek için ifade yüzey belirteçleri güvenmek 5 sıralama. Diğer stratejiler hidrodinamik 6 ya da atalet 7,8 sıralama, optik cımbız, acoustophoresis 9, 10, ve dielektroforez bulunmaktadır. 11,12 Dielektroforez, düzgün olmayan bir elektrik alanı varlığında, bir polarize parçacığın hareketidir. 13 DEP için kullanılmıştır geniş bir uygulama yelpazesi, 2,14 canlılığı, 15 hücrelerin biyoelektrik özelliklerini karakterize dayalı sıralama hücreleri de dahil olmak üzere, 16 ve sıralamahücre biyofiziksel özellikleri bağlı değişiklikleri üzerine ing. 17,18 geleneksel DEP bir voltaj uygulamak ve bu güçlü bir tekniktir da düzgün olmayan bir elektrik alanı. 13 uyarılması için bir mikroakışkan kanal içinde desenli düzlemsel elektrotlar kullanan, zorluklar gibi ortaya çıkabilir elektrot katmanlarına ayrılma ve elektroliz. İzolatör bazlı dielektroforez (IDEP) 19 tıkanmayı elektrot delaminasyonu ve bir DC elektrik alanı gayri muntazamlıkların neden model verme izolasyon yapıları ile elektrot alanının mekansal bozulması zorluklarını ele almıştır. IDEP seçici olarak canlı ve ölü bakteri hücrelerinin ayrılması için kullanılmış, 19 bakteriyel sporlar, 20 ve işlemek DNA, diğer uygulamalar arasında 21 izole eder. Genellikle gerekli yüksek DC gerilimlerin bir sonucu olarak oluşabilir çünkü Joule ısıtma bir meydan okuma olabilir. Bu zorlukları düzeltmek için, temassız DEP mikrovasıtalar geliştirilmiştir. 22-24 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada sunulan teknik o kadar metalik elektrotlar ve örnek kanal arasında doğrudan temas olmaması için adlandırılmış, temassız dielektroforez (cDEP) kullanır., bu stratejiye Benzersiz 22 ile dolu sıvı elektrot kanalları ile metalik elektrotlar yedek Bir son derece iletken bir çözüm. Bu sıvı elektrotlar, kapasitif bir AC gerilim ile örnek kanala ince bir yalıtım engeli boyunca birleştirilir. Elektrotlar ile örnek temasını ortadan kaldırmak gibi elektroliz ve kabarcık oluşumu, numune kontaminasyonu ve elektrot delaminasyonu gibi DEP-tabanlı yöntemler ile ilgili sorunları azaltır. Bu örnekteki hücrelerin canlılığını destekler çünkü, bir sonuç olarak, cDEP biyolojik örnekler için özellikle yararlıdır. Önemlisi, cDEP örnek sterilite koruyabilirsiniz. Bir çip, bir hücre kültürü kaputu hazırlanabilir ve deney metal elektrotlara örnek temas gerektiren veya örnek environme açık olmasını gerektirmeden yapılabilirnt. Basit bir rezervuar steril numune kurtarma kolaylaştırmak için çip çıkışına monte edilebilir. Buna ek olarak, örnek kanal ile aynı biyolojik olarak uyumlu polimer malzemenin (PDMS) sıvı elektrot üretim metal elektrotların özel modelleme, üretim için gerekli olan zaman ile ortaya çıkan yüksek maliyetini düşürür, ve ilk modelleme için özel temiz oda için ihtiyacı sınırlar yeniden silikon gofret damga. DEP nedeniyle parçacıkların hareketi, tanecik ve ortamın yanı sıra, elektrik alanının uzaysal gradyanlar özelliklerine bağlıdır. Bir parçacık ve frekans-bağımlı faktör, Clausius-Mossotti (CM) faktörü olarak adlandırılan, aralık -0.5 1 bir değer alır ve DEP kuvvet yönünü belirler. CM faktör tam sıfır olduğu frekans geçiş frekansı denir. Bu hiçbir dielektroforetik kuvvet bir parçacığın ve CM faktör değişiklikleri işaretine uygulanan edildiği noktadır. A sinert katı mikrosferlerin ingle geçiş frekansı oluşur negatif pozitif CM faktör değişiklikleri 0.01 S / m, NDEP gelen pDEP 10&#39;a yakın var bir geçiş gösteren bir birinci geçit sıklık sırasına düşük iletkenlik tampon memeli hücreleri için 25. - 100 kHz ve boyut, şekil, hücre iskeleti ve hücrenin membran özellikleri tarafından etkilenmiştir. 26,27 NDEP rejimine pDEP bir vardiyada ikinci bir eşik frekansı 10 MHz mertebesindedir, ve etkilenir çekirdek-sitoplazma oranı, sitoplazma iletkenlik ve endoplazmik retikulum. 27 DEP kuvvet sıvı akışının varlığı olmadan uygulanabilir, ancak burada süspansiyon halindeki partiküllerin sürekli bir sıralama elde etmek için bir akan sıvı kullanmaktadır. Dielelektroforetik kuvvet ve Stokes sürtünme kuvveti kombine etkisi, bir parçacığın öteleme hareketini belirleyecektir. İki frekans aralıklarında işlem için cihazlar geliştirilmiştir. Yükseköğretim frequency cihazları (100-600 kHz) gibi prostat tümörü başlatan hücrelerin (TIC), kemirgen over yüzey epitel (MOSE) hücreleri, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücre olarak, pDEP ve hücrelerin elde toplu sıralama ile çalıştırılabilir, ya da THP canlı adres seçici örnek kanalında bulunan Mesajları yalıtım ilgi hücreleri yakalayarak -1 hücreler. 28-31 daha düşük frekans (5-100 kHz) cihazlar sürekli işletmek ve bir frekansta çalıştırıldığında bir nüfus plan nüfus deneyimleri sırasında pDEP deneyimleri hangi NDEP, sıralama elde etmek için parçacık yörüngeleri yönlendirebilirsiniz. 32-34 Bu düşük frekanslı cihazlar, kırmızı kan hücrelerinin kanser hücrelerini sıralamak ilerici MOSE hücre hattının dielektrik özelliklerindeki değişimleri belirlemek ve olmayan etkilerini aydınlatmak için kullanılmıştır agresif MOSE hücrelerin saldırgan özelliklerini tersine üzerinde toksik sphingolipid tedaviler. Buna ek olarak, şu an cDEP mikrovasıtalar kadar 1 ml / saat, artan bir çıktı ile çalışmak üzere dizayn edilebilirr. 31,35 Tarif edildiği gibi, esneklik ve üretim sürecinin düşük maliyetli sunulan deney prosedürü, geniş bir uygulama aralığı için uygun olması için izin özel olarak tasarlanmış cihaz geometrileri, sağlar. CDEP uzun vadeli hedefi müteakip kültür ya da işleme için örnek kurtarma ile, bir klinik düzeyde etiket-free cep sıralama ve zenginleştirme gerçekleştirmektir. Burada sunulan teknik DEP erişilebilirliğini artırır, imalattan gelen deney için, basit ve ucuz bir yöntemdir. Biz, karakterizasyonu ve floresan mikro yumurtalık kanser hücrelerinin çoğalmasını, elde etmek için bir çip cDEP hazırlanmasını ve deney protokolü göstermektedir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

Dielektroforez, (DEP) bir tek biçimli olmayan elektrik alanı partiküller translasyonel hareket geçmesi polarize hangi bir olgudur ve bir yüzey işaretleyici bağımsız bir şekilde mikro-hareket yönlendirmek için kullanılabilir. Geleneksel olarak, DEP cihazlar örnek kanal model verilmiş düzlemsel metalik elektrotlar içerir. Bu yaklaşım, pahalı olması ve özel bir temiz oda ortamı gerektirir. Son zamanlarda, temassız dielektroforez (cDEP) denilen bir temas içermeyen bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntem, doğrudan desenleme akışkan elektrotlar tarafından elektrotları ve numune arasındaki teması ve tek polidimetilsiloksanın (PDMS) alt tabaka bir örnek kanal kaçınarak DEP klasik ilkesini kullanır ve mikropartiküller sıralamak ve zenginleştirmek için tasarlanan hızlı microfluidic stratejisi olarak uygulaması vardır. Bu yönteme özgü elektrik alanı ayrılır son derece iletken sıvı, ihtiva eden akışkan elektrot kanalları ile oluşturulur olmasıdırince bir yalıtkan bariyer tarafından örnek kanal. Metal elektrotlar doğrudan numune ile temas olmadığından, elektroliz, elektrot delaminasyon ve örnek kontaminasyon önlenir. Ayrıca, bu, ucuz ve basit bir imalat işlemi sağlar. cDEP böylece hassas biyolojik parçacıkların manipüle edilmesi için çok uygundur. Parçacıkların üzerine etki eden dielektroforetik kuvvet cihaz geometri özelleştirilebilir tasarımı tarafından üretilen elektrik alanı uzamsal gradyan, ancak hücrenin iç biyofiziksel özellikleri üzerinde sadece bağlıdır. Bu nedenle, hala cDEP bioparticles karakterizasyonu, zenginleştirme ve sıralama izin verirken değişken, bir popülasyon içinde eksprese edilebilir bir yüzey olarak ifade edilen moleküler biyolojik bağlı olarak önler bir etiket içermeyen bir tekniktir. Burada, biz cDEP kullanarak imalat ve deney temellerini göstermektedir. Bu yumuşak litografi kullanarak bir cDEP çipin basit hazırlanmasını açıklary teknikleri. Bir parçacık ya da hücre, dielektroforetik kuvvet sıfır olduğu frekansın geçiş frekansını karakterize etmek için deneysel prosedür tartışır. Son olarak, yumurtalık kanseri hücrelerinin bir karışımını ayırma ve mikro küreler (boncuk) flüoresan için bu tekniğin kullanımını göstermektedir.

DEP elektrik alan mevcut olduğu zaman cihaz operasyonel doğrulamak için örnek kanalda nitelik dikkat edilmelidir. DEP varlığı açısından test etmek için bir yöntem, çok güçlü ve pDEP NDEP tahmin edilmektedir geçiş frekansı pDEP ve en memeli kanser hücreleri için NDEP gözlemlemek için &lt;10 kHz gözlemek için (yaklaşık&gt; 40 kHz ikinci frekans değerleri için ayarlamaktır ) 100 us / cm iletkenlik ile tampon. Bu atıl mikrosferler geçiş frekansının üzerine kendi geçiş frekansının altında pDEP sergiler ve NDEP unutulmamalıdır. Burada yer alan özelliği testere dişli geometrisi için, daha düşük bir test pDEP frekansta ise, NDEP, inci zincirleme ve kanalın özelliği testere dişli kenarında hücreler veya parçacıkların odaklama oluşumu ile gösterilen yüksek test frekansta hücreler için görülmelidir hücreler, kanalın düz kenar yakın bölgeye sınırlı olarak açık olmalıdır. Bu düşük frekanslar, hücreler lys olabilirnedeniyle elektroporasyon e, yani örnek daha az hücre içeren görünebilir, ve bir enzimatik aktive fluoresan boya kullanılarak eğer görünür olanlardır büyütülmüş veya bulanık görünebilir. PDEP ve NDEP meydana hangi frekansları doğrulanması protokolde tarif edildiği gibi geçiş frekansının tespit edilmesini mümkün kılmaktadır. Burada kullanılan bu MOSE-L gibi memeli kanser hücreleri için, 60 kHz (Şekil 5b), 5 kHz (Şekil 5a) ve güçlü pDEP NDEP de görülmektedir. MOSE-L hücreleri, 17.7 ± 3.3 um (n = 268 hücre) bir çapa sahiptir ve taneler, 4 | im nominal çapa sahiptir. Ilerleme önceki aşamalarında MOSE hücrelere kıyasla MOSE-L hücrelerinin dielektrik özelliklerinin tam bir analizi Salmanzadeh ve ark. 33 tarafından son çalışmalarında bulunabilir PDEP ve NDEP bu uçlarda dikkate alınmadığı takdirde, çeşitli sorunlar meydana geliyor olabilir. Numune iletkenlik nedeniyle kirletici veya hücre eritici için çok yüksek olabilir. YETERSİZnt elektrik alanı nedeniyle örnek kanalını çevreleyen kanalların kısmına akım iletimini önlemek için, sıvı elektrot kanalları, sıkışıp kabarcıklara oluşturulabilir. Durağan olmayan akış yeterli bir süre boyunca, vakum altında saklama cihazına olmadığını ya da hızlı bir şekilde nedeniyle sınırlı ölçüde bağlanmış PDMS delaminasyona vakum, sızıntı çıkarmadan sonra aygıtı doldurulmaması kaynaklanan kabarcıklar, şırınga ya da giriş boru sıkışmış bir kabarcık kaynaklanabilir Pompa çalışma aralığının uç noktalarında kanal dolgu veya akış oranları zaman cam slayt, aşırı kuvvet bariyer membran gözyaşları içinde sarf. Hücrelerin geçiş frekansını belirlemek için ek olarak, bu teknik, MOSE-L hücreleri ve boncuk karışımı ile burada gösterilen bir karışım, sıralamak için kullanılabilir. Bu örnek MOSE-L hücreleri pozitif dielektroforez (pDEP) deneyimi frekanslarda 4 um boncuk tarafından sergilenen negatif dielektroforez (NDEP) yararlanır. Biz o200 V RMS ve 10 kHz (Şekil 6a) de cihazı perated ve NDEP deneyimli olarak hücreler ve boncuklar hem de karışık görülmektedir. Boncuklar iki bileşeni (Şekil 6b) içine karışımın ayrılması için, kanalın alt kısmına sınırlı ise 50 kHz anda, kanalın üst MOSE-L hücre hareketi görülmektedir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> Şekil 5,. MOSE L-hücrelerinin konumu uygulanan elektrik alanının frekansı değiştirilerek değiştirilebilir. Resmi numune kanal nihai özelliği testere dişli alınır ve akışkan elektrotlar yandaki köşelerinde yer alır. Bunlar, PBS kanalları görselleştirmek için fluoresces rodamin B içeren doldurulur. (A) MOSE-L hücreleri, 200 V rms NDEP deneyim<html> ve 5 kHz. (b) MOSE-L hücreleri 200 V RMS ve 60 kHz inci zincirleme ve pDEP karşılaşabilirsiniz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> Şekil 6,. MOSE-L hücreler (yeşil) ve 4 um boncuk (kırmızı) içindeki bir karışımı, 200 V (a). Bir alçak frekans cDEP cihazının örnek kanal nihai testere dişli özelliği aracılığıyla akar ve 10 kHz hücreler ve boncuklar karıştırılır. Oklar 200 V At (b). Hafifçe olasılığı nedeniyle düşük frekanslı koşullarına ölen hücrelerin görünen işaret ve 50 kHz hücreleri pDEP deneyim ve kanalın özelliği kenarına taşımak, boncuk NDEP tecrübe ederken ve bölge lâyık sınırlı kalır düz kenar.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis at JoVE.com

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Temassız dielektroforez (cDEP) kendi içsel dielektrik özellikleri aracılığıyla sıralama ve parçacıkların zenginleştirme ulaşır. Fluidic elektrot kanallar steril karakterizasyonu olmayan zarar ve biyolojik parçacıkların sıralamaya cDEP takım elbise kumaşı, DEP geleneksel metalik elektrotlar değiştirin. Biz bir cDEP mikrocihazda hazırlamak ve hücre karakterizasyonu ve sıralama deneyler nasıl gösterilmektedir.

Temassız dielektroforez sayesinde etiket ücretsiz İzolasyon ve Hücreler zenginleştirilmesi

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

label-free-isolation-enrichment-cells-through-contactless

Research

JoVE Journal

Medicine

15.9K Görüntüleme.  Virginia Tech.  Temassız dielektroforez (cDEP) kendi içsel dielektrik özellikleri aracılığıyla sıralama ve parçacıkların zenginleştirme ulaşır. Fluidic elektrot kanallar steril karakterizasyonu olmayan zarar ve biyolojik parçacıkların sıralamaya cDEP takım elbise kumaşı, DEP geleneksel metalik elektrotlar değiştirin. Biz bir cDEP mikrocihazda hazırlamak ve hücre karakterizasyonu ve sıralama deneyler nasıl gösterilmektedir. 

Video: Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Tıp

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...