עבודה זו נתמכת כבר נתמכת בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט לא אפרי 0938047, ועל ידי וירג&#39;יניה טק המכון לקריטי טכנולוגיה ומדע יישומי (ICTAS). המחברים מבקשים להביע את ההערכה לד&quot;ר אווה שמלץ וד&quot;ר פול רוברטס למתנה מסוגם של תאי Mose-L. המחברים מודים אנג&#39;לה אנדרסון על סיועה בתרבית תאים, Caitlan Swaffar על עזרתה בעריכת המסמך והכנת ניסויים, וכל חברי המעבדה Bioelectromechanical המערכות.

1. בודה מכשיר אב טיפוס cDEP Microfluidic: סקירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההליכים שדווחו בעבר 22 באמצעות photoresist ועמוק הריאקטיבי יון תחריט (DRIE) כדי לחרוט את העיצוב הרצוי ערוץ (איור 1) בפרוסות סיליקון (איור 2). להפקיד שכבה דקה של טפלון כדי לשפר את שחרורו של microdevice מפרוסות סיליקון. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של מכשיר מיון נמוך תדר רציף. מדגם ריצות ערוץ שמאל לימין, והוא 500 מיקרומטר רחב עם אילוצים זגזגו ל100 מיקרומטר. שני הזוגות של ערוצי האלקטרודה fluidic להלחין אלקטרודות המקור וכיור, בהתאמה, והם מופרדים מערוץ המדגם על ידי 20 מיקרומטר מחסום PDMS עבה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> איור 2. Fabrתהליך ication של מכשיר cDEP. (א) ל60 שניות, אור UV סלקטיבי מגיב עם photoresist נחשף באמצעות דפוס מסכה של הגיאומטריה מכשיר cDEP. (ב) Photoresist מוסר באמצעות מפתח. (ג) עמוק הריאקטיבי יון תחריט (DRIE) משמש כדי לחרוט 50 מיקרומטר תכונות עמוקות, ו -5 דקות של תחריט רטוב על ידי הידרוקסיד tetramethylammonium (TMAH) 25% ב 70 מעלות צלזיוס משמש כדי להפחית את החספוס על הקירות הצדדיים. (ד) ציפוי טפלון נוסף כדי לשפר שחרור מכשיר מ רקיק. (ה) PDMS הוא שפך על חותמת רקיק מחדש שמיש לאחר degassing ונרפא 45 דקות ב100 מעלות צלסיוס (ו) PDMS הוא להסיר את פרוסות סיליקון. PDMS ושקופית זכוכית נקייה נחשפים לאוויר פלזמה למשך 2 דקות ומלוכדים יחד. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עטוף את פרוסות בנייר אלומיניום כדי למנוע לשפוך מעל. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) ב10:01 יחס אלסטומר לסוכן ריפוי, דה גז לכ 20 דקותו, יוצק על גבי פרוסות סיליקון. חום 45 דקות ב100 ° C כדי למנוע נזק לציפוי הטפלון של הבול. אפשר למכשיר להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקירור, הסר את נייר אלומיניום, לקצץ PDMS באמצעות סכין כירורגית, ולהכות את חורי גישה בכניסת ערוץ / יציאה באמצעות אגרופן בוטה המתאימים לגודל של צינורות. כאן, משמש אגרופן בוטה 1.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את שקופיות מיקרוסקופ זכוכית באמצעות שטיפה של מים וסבון, אתנול, מים די, וייבוש באוויר, בהתאמה. נקה את מכשיר PDMS באמצעות נייר דבק מג&#39;יק. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להיות בטוח ערוצים נקיים. לחשוף את השקופיות ומכשיר PDMS לפלזמת אוויר למשך 2 דקות. לחץ בחוזקה בצד ערוץ של מכשיר לשקופית זכוכית, הימנעות היווצרות של בועות אוויר בין המכשיר והשקופיות (איור 3). </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> איור 3. </strong&gt; (א) המסכה משמשת לphotolithography בייצור פרוסה סיליקון הבולים, ו (ב) מכשיר PDMS הזכוכית סיים עם המדגם וערוצי האלקטרודה נוזל מלא בצבע מאכל ירוק ואדום, בהתאמה. ראה איור 1 עבור ממדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> 2. הכנת תרחיף תא בDEP הצפת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ להכין מוליכות נמוכות (100 μS / סנטימטר), אשר יהיה המכונה &quot;חיץ DEP&quot; (סוכרוז 8.5% [w / v], גלוקוז 0.3% [w / v], 0.725% RPMI [w / v]) . 16 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות תאי חיץ DEP ב3 x 10 6 תאים / מיליליטר. הנה, תאי אפיתל פני השחלות עכבר בשלב מאוחר סרטני (Mose-L) נמצאים בשימוש. </li></ol> הערה: ניתוח כדאיות נייד בשיטת הרחקת צבע הכחולה trypan הראה ירידה קלה ביכולת קיום(95.1-91.6%) של תאים בשלב מוקדם מוז (Mose-E) הושעו במאגר DEP בטמפרטורת חדר לאחר 5 שעות. הוא ניבא כי ירידה קלה דומה בכדאיות מתרחשת לתאי Mose-L, מצביעה על כך שתאים לא צריכים להיות מאוחסנים בDEP חיץ לטווח ארוך. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוע את התאים באמצעות צבע קרום חדיר ניאון, כגון Calcein AM enzymatically הופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד מוליכות של ההשעיה התא הצבוע. המוליכות צריכה להיות כ 100 μS / סנטימטר. אם מדידת המוליכות גבוהה מדי, לסובב את המדגם למטה, resuspend במאגר DEP ב3 x 10 6 תאים / מיליליטר ולחזור על מדידת המוליכות. </li></ol> 3. טוען שבב microfluidic cDEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שבב microfluidic תחת ואקום ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לחתוך חתיכה של צינור גמיש כדי להקיף את המרחק ממשאבת המזרק לבמה מיקרוסקופ שבו שבב microfluidic יהיה ממוקמת. כאן, באורך 6 סנטימטר של צינורותנדרש. צינורות Fit לעקוץ טיפ על מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את האורך נדרש לצינורות לשקע על ידי חלוקת היעד שנאסף נפח דגימה על ידי שטח החתך של הצינור. חותכים את דורש אורכו של צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר השעיה תא לתוך מזרק. בדוק שאין בועות נמצאות בצינור או המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הסרת שבב מואקום, הכנס את הצינור לשקע וראש ערוץ מדגם במהירות כדי למנוע בועות אוויר שנלכדו בערוצים. לטפוח בעדינות את המזרק כאשר תחול כדי למנוע פקיעת (20 מיקרומטר) הדק בידוד מכשול, אם כי זה כבר ציין כי המכשול יכול לעמוד בתפוקה גבוהה קבועה ליד 5 מיליליטר / שעה ללא פקיעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוצי אלקטרודה ראש, מקום במהירות טיפים פיפטה ריקים בשקע אחד כל ערוץ האלקטרודה fluidic. פיפטה 200 μl של PBS המכיל כמות קטנה של rhodamine B ולטפוח בעדינות להכניס את הנוזל לקצה השני של ערוץ האלקטרודה. שמור על לחץ עדיןעד PBS עם rhodamine B בעליל מתקדם עד הקצה של קצה פיפטה הריק. חזור על פעולה עבור כל אחד מערוצי האלקטרודה. Rhodamine B משמש רק כדי להמחיש fluorescently ערוצי האלקטרודה fluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תחול, למלא כל מאגר קצה פיפטה עם PBS עם היווצרות בועה הימנע B. rhodamine במאגרי קצה פיפטה, ולהסיר כל בועה גלויה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. לנתק את הצינור לשקע וזורקים כראוי, לאחר מכן להוסיף מאגר צינורות לשקע טרי לאסוף היקף היעד. </li></ol> 4. תדר חיתוך אפיון של תאים באמצעות שבב cDEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את השבב על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה מצוידות במצלמה דיגיטלית (איור 4). </li></ol><img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> איור 4. </strong&gt; (א) התקנה ניסיונית בסך הכל לניסויי cDEP. שבב cDEP ממוקם על הפלטפורמה של מיקרוסקופ ההפוכה. מצלמה שולחת תמונות למחשב להקלטה. משאבת המזרק שומרת על זרימת יניקה מתמדת. גנרטור הפונקציה מייצר אות אשר הגבירה את ידי מגבר המתח הגבוה ומחוברת לשבב cDEP ידי אלקטרודות תיל. אוסצילוסקופ מנטר את האות שנשלחה לשבב. (ב) צפה בפרטים של שבב cDEP וחיבורי fluidic והאלקטרוני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מזרק במשאבת מזרק ולהכניס אלקטרודות חוט לתוך מאגרי ערוץ האלקטרודה fluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאיבה נוזל דרך ב1 מיליליטר / שעה כדי להבטיח קשר טוב בין משאבת המזרק והמזרק. ראייה לבדוק את אורך הערוץ כדי להבטיח זרימה בלתי מופרעת של תאים והיעדר בועות או דליפות. אדוםקצב זרימת uce ל0.005 מיליליטר / שעה. הערה: תפוקה גבוהה ככל 31,35 1 מיליליטר / שעה הושגה במכשירים של גיאומטריות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למען בטיחות, לבדוק את האלקטרוניקה על ידי הפעלה על הגנרטור הפונקציה, מגבר מתח גבוה, ואוסצילוסקופ, ולהסתגל למתח ותדר רצויים. הנה פרמטרים אלה הם 200 V ו20 קילוהרץ. עם האימות של ביצועים קבילים, את הכוח. חבר אלקטרודות למגבר מתח גבוה. הערה: שימו לב לנהלי בטיחות החשמל המתאימים בעת הפעלת האלקטרוניקה במתח הגבוה המשמש לניסויים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השגת זרימה קבועה, להחיל את המתח הרצוי בתדירות הרצויה. בניסוי זה, מתח הוא 200 V RMS בתדרים שבין 5-60 קילוהרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי וידאו תיעוד של תגובת התא עם טכניקות עיבוד תמונה (שלב 5) לכמת חלוקת תא בערוץ ולאפיין את תדר החיתוך. כדי לעשות זאת,לשמור על מתח קבוע ומשתנה בתדירות באופן שיטתי. בתחילת וסוף הניסוי, כמו גם באופן אקראי בין ריצות ניסיוניות, להקליט את חלוקת תא שליטה, חלוקת התאים ללא החלת שדה חשמלי. להעריך את משך זמן הנדרש לתאים לזרום מהכניסה למיקום המעקב (כאן, 5 דקות). לאחר קביעת תדר חדש, המתן הסכום הזה של זמן, ולאחר מכן להתחיל בהקלטה (כאן, וידאו 2 דקות של חלוקת תא). </li></ol> 5. עיבוד תמונה לתדר אפיון מחוף לחוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תסריט חישוביים, לנתח כל פריים וידאו על ידי מסגרת כדי לקבוע את Y-המיקום היחסי (שבו Z-הכיוון הוא העומק האנכי של הערוץ, ה-Y הכיוון הוא רוחב הערוץ, וה-X כיוון הוא אורך הערוץ) של כל תא או חלקיק fluorescing בצוין קואורדינטת x במורד הזרם מהאזור בכוח DEP גבוה בערוץ. צור גרף של דיס היחסיtribution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את האמצע של ההפצה בכל מתח ותדר באמצע של חלוקת השליטה. למתח נתון ותדרים שונים, לקבוע את תדר החיתוך, שבו קו האמצע תואם את Y-המיקום של הפקד. </li></ol> 6. משתנה הניסוי לבצע מיון תא או העשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התערובת רצויה בחיץ DEP בריכוז כולל של 3 x 10 6 מיליליטר / חלקיקים. כאן, תערובת זו היא תאי Mose-L עם 4 חרוזים fluorescing מיקרומטר במאגר DEP. בצע את השלבים שתוארו קודם לכן כדי להכין את מכשיר cDEP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למיין או להעשיר את תאים מתערובת, לקבוע את התדרים מוצלבים של תאי היעד וחלקיקי הרקע כפי שתוארו קודם לכן. הפעל את הניסוי בתדר בין שני התדרים מוצלבים של תאי היעד וחלקיקי הרקע כך ששתי האוכלוסיות של חלקיקים לחוות כוחות DEP בד ההפךirections. כדי למיין תאי Mose-L ו4 מיקרומטר חרוזים, לפעול microdevice מעל 11.90 ± 0.63 קילוהרץ. תדר החיתוך הראשון של תאי Mose-L דיווח לאחרונה על ידי Salmanzadeh et al. 33 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף את התוכן של מדגם ממוין, להסיר את הצינור לשקע על איסוף היקף היעד, על ידי הצבת אצבע כפפה על פתיחת השקע ובעדינות מושך בצינורות. יוצקים נאסף נפח היעד למאגר לצורך ניתוח נוסף הערה:. שיטות התאוששות מדגם אחרות יכולים לכלול חיבור מאגר קבוע לשבב והסרת הדגימה על ידי pipetting הפשוט. </li></ol>

<ol>
	<li>Butler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell culture and upstream processing. , (2007).</li><li>Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+Cell+Capture+in+Microfluidic+Devices.">Rare Cell Capture in Microfluidic Devices.</a> Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+cells+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature.</a> Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).</li><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+activated+cell+sorting.">Fluorescence activated cell sorting.</a> The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).</li><li>Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitarget+magnetic+activated+cell+sorter.">Multitarget magnetic activated cell sorter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).</li><li>Chabert, M., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+high-throughput+encapsulation+and+hydrodynamic+self-sorting+of+single+cells.">Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).</li><li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+inertial+focusing,+ordering,+and+separation+of+particles+in+microchannels.">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).</li><li>Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidics.">Inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).</li><li>Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+single-cell+sorting+system+based+on+optical+trapping.">Automated single-cell sorting system based on optical trapping.</a> J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).</li><li>Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+(SAW)+acoustophoresis:+now+and+beyond.">Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond.</a> Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).</li><li>Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Article-Dielectrophoresis:+Status+of+the+theory,+technology,+and+applications.">Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications.</a> Biomicrofluidics. 4, (2010).</li><li>Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+separation+of+cancer+cells+from+blood.">Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood.</a> Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).</li><li>Pohl, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , (1978).</li><li>Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+cells+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature.</a> Journal of Membrane Science. , (2012).</li><li>Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Viable+and+Nonviable+Yeast+Using+Dielectrophoresis.">Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis.</a> J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).</li><li>Flanagan, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+dielectric+properties+distinguish+stem+cells+and+their+differentiated+progeny.">Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny.</a> Stem Cells. 26, 656-665 (2008).</li><li>Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+multidrug+resistance+reversal+using+dielectrophoresis+and+flow+cytometry.">Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry.</a> Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).</li><li>Hoettges, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis-activated+multiwell+plate+for+label-free+high-throughput+drug+assessment.">Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment.</a> Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).</li><li>Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulator-based+dielectrophoresis+for+the+selective+concentration+and+separation+of+live+bacteria+in+water.">Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water.</a> Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).</li><li>Davalos, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+impact+of+dynamic+surface+coatings+on+polymeric+insulator-based+dielectrophoretic+particle+separators.">Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).</li><li>Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+manipulation+by+means+of+insulator-based+dielectrophoresis+employing+direct+current+electric+fields.">DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields.</a> Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).</li><li>Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contactless+dielectrophoresis:+a+new+technique+for+cell+manipulation.">Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation.</a> Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).</li><li>Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis-based+cell+manipulation+using+electrodes+on+a+reusable+printed+circuit+board.">Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board.</a> Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).</li><li>Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+focusing+in+a+contactless+dielectrophoretic+microfluidic+chip+with+insulating+structures.">Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures.</a> Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).</li><li>Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC+electrokinetics:+applications+for+nanotechnology.">AC electrokinetics: applications for nanotechnology.</a> Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).</li><li>Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis:+Status+of+the+theory,+technology,+and+applications.">Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications.</a> Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).</li><li>Pethig, R., Ferrari, M. a. u. r. o., Ozkan, M. i. h. r. i. m. a. h., Heller, M. i. c. h. a. e. l. . J. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.">Ch. 4.</a> BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. 4, 103-126 (2007).</li><li>Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+isolation+of+live/dead+cells+using+contactless+dielectrophoresis+(cDEP).">Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP).</a> Lab Chip. 10, 438-445 (2010).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+differentiation+of+mouse+ovarian+surface+epithelial+cells,+macrophages,+and+fibroblasts+using+contactless+dielectrophoresis.">Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis.</a> Biomicrofluidics. 6, (2012).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+prostate+tumor+initiating+cells+(TICs)+through+their+dielectrophoretic+signature.">Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature.</a> Lab Chip. 12, 182-189 (2012).</li><li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Blood+Cells+Using+Dielectrophoresis.">Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis.</a> , (2012).</li><li>Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+development+of+a+low+frequency+contactless+dielectrophoresis+(cDEP)+platform+to+sort+cancer+cells+from+dilute+whole+blood+samples.">Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples.</a> Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Dielectric+Properties+of+Different+Stages+of+Syngeneic+Murine+Ovarian+Cancer+Cells.">Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells.</a> Biomicrofluidics. , (2013).</li><li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , 590-593 (2012).</li><li>Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+contactless+dielectrophoresis:+Theoretical+considerations.">Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations.</a> Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).</li><li>Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+beads+and+cells+in+multi-channel+microfluidic+devices+using+dielectrophoresis+and+laminar.">Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar.</a> J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).</li><li>Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis.">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis.">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li></ol>

ד&quot;ר רפאל Davalos פטנט לdielectrophoresis ללא מגע.

DEP הוא טכניקה רבת עוצמה לקביעת מאפייני דיאלקטרי של חלקיקים ומכוונים את תנועת חלקיקים לכיוון מיון יישומים, בידוד, או העשרה. בשל ההשפעה המזיקה של קשר האלקטרודה ישיר עם מדגם, אחרים תפס את הגישות דומות לשיטה שהוצגה בעבר להימנע ממגע. לדוגמא, בשיר ואח&#39;. פיתח מכשירי DEP ללא קשר באמצעות מכשיר PDMS microfluidic הופרד מאלקטרודות המעגלים מודפסות ידי coverslip זכוכית דק, וטכניקה זו נעשית זמינה גם בפורמט וידאו. 23,36 הנה, יש לנו הראינו את הייצור של שבב cDEP ואלקטרודות fluidic באמצעות מצע PDMS יחיד, ופרוטוקול הניסוי להפרדת תאי סרטן שחלות מתערובת של תאים וחרוזי ניאון. הטכניקה הוצגה שמשה בהצלחה עבור מגוון רחב של יישומים מורכבים יותר ורלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל מיון ליבתאי דואר ומתים, גידול 28 ייזום תאים מתאי סרטן ערמונית, 30 תאים סרטניים לתאים לדלל דם אדומים, 31,32 והבחנה בין שלבים של סרטן השד 37 וסרטן השחלות. 29 cDEP שימשו גם לערבוב חלקיקים. 38 אלה יישומים מצביעים על כך שעל ידי שימוש בטכניקה הפשוטה שהוצגה, ניתן להשיג מטרות מגוונות פשוט על ידי שינוי העיצוב של הגיאומטריה הערוץ. . DEP הוא שימושי על microscale למניפולציה של חלקיקי 13 לחלקיקים כדוריים, כוח dielectrophoretic translational תלוי במאפייני הגודל וחשמלי של החלקיקים והבינוניים המתלים שלה, כמו גם את השיפוע של השדה החשמלי בריבוע: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> שבו מ &#39;ε הוא permittivity של המדיום המתלים, r הוא הרדיוסשל החלקיקים, וRC [k (ω)] הוא החלק האמיתי של גורם קלאוזיוס-Mossotti (CM). גורם CM הוא מדד של הקיטוב היחסי של החלקיקים בהשוואה למדיום המתלים וקובע את הכיוון של כוח dielectrophoretic. היא מתוארת כ <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> איפה <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> ו - <img alt="משוואה 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> הם permittivities המורכב של החלקיקים ובינוניים, בהתאמה. Permittivity מורכב, <img alt="משוואה 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , תלוי במוליכות (σ) ותדירות (ω). גורם CM של חלקיקים כדוריים מחויב באופן תיאורטי בין -0.5 ו1. אם גורם CM הוא שלילי, החלקיקים לחוות NDEP כי המדיום הוא יותר polarizable מאשר החלקיקים, ולכן חלקיקים להתרחק מאזורים שלהדרגות שדה חשמליות גבוהות. אם גורם CM הוא חיובי, החלקיקים יותר polarizable מהבינוני והם חווים pDEP שבו הם נעים לעבר אזורים של הדרגות שדה חשמלי גבוהות. עבור חלקיקים ביולוגיים שהם nonhomogeneous במבנה, כגון תאים, גורם קלאוזיוס-Mossotti ניתן לקבוע מן הערך יעיל לpermittivity החלקיקים: <img alt="משוואה 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> איפה <img alt="משוואה 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> ו - <img alt="משוואה 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> הם permittivity המורכב של permittivity מורכב היעיל של הפנים של התא, כגון ציטופלסמה, וקרום הפלזמה, בהתאמה;. r הוא הרדיוס של התא, וד הוא עובי קרום הפלזמה 26 כאשר DEP מתרחש עם חלקיקים מרחפים בנוזל, התנועה של החלקיק ביחס לנוזל תפיק כוח גרר על החלקיק. כוח גרר זה יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת הכוח הכולל הפועל על החלקיקים. למצבים של עניין כאן, כוחות צמיגי לשלוט וחלקיקים הם הניחו כדוריים, קטנים ונעים עם מהירות נמוכה יחסית, ולכן החוק גרור &#39;סטוקס מספק קירוב טוב לכוח הגרר: <img alt="משוואה 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> שבו η הוא הצמיגות של הנוזל, עמ &#39;u הוא המהירות של החלקיקים, וו u הוא המהירות של הנוזל, שיכול להיות גם מרגש. בהתחשב בכוח dielectrophoretic, הידוע בנוזל ותכונות חלקיקים, ומהירות זרימה ידועה, האיזון בין כוח הגרר וכוח dielectrophoretic ניתן לפתור להעריך את מהירות חלקיקים. שיעור הגזירה שהחוויה התאים צריכה להיות מתחת לסף שבו גell lysing יכול להתרחש. אפיון של התכונות חשמליות של חלקיקים יש צורך לחזות ולשלוט באופן שהם יגיבו תחת DEP. בעבודה זו, אנו מנוצלים במיוחד cDEP תדר נמוך עם תאי Mose-L כדי להדגים את הפרוטוקול לקביעת תדר החיתוך הראשון של תאים, ולאחר מכן הראו מיון מתמשך של חרוזי פוליסטירן ותאי Mose-L מבוסס על תשובות DEP המנוגדות שלהם. לשנות את הגיאומטריה של מכשיר cDEP תשתנה הדרגתיים המרחבי של השדה החשמלי, המאפשרת למכשירים להיות מיועדים בתדירות גבוהה או בהפעלתה בתדירות נמוכה, ולסלקטיביות גבוהה ויעילות של מיון לסוג תא מסוים. בנוסף, ניתן לפתח מכשירי תפוקה גבוהים על ידי בודה ערוצים רחבים יותר, 30 ערוצים במקביל, 30 או על ידי ייצור רב שכבתי 35, שבו ערוצי האלקטרודה נערמים אנכי מעל ומתחת עמוק יחסיתערוץ מדגם. קרומים דקים יוצרים חיץ בין שכבות. בדיקות ראשוניות עם מכשירים המפוברק בpolymethylmethacrylate (PMMA) וסרטים דקים פוליקרבונט (PC) הדגימו תגובת DEP של תאי Mose-L. מאמצים הנוכחיים נמצאים בעיצומם כדי לחדד את מכשירי תפוקה גבוהה רב שכבתיות ועל מנת לשפר את המערכת ההיקפית לכיוון פלטפורמת Plug-and-Play סופו של דבר. כדי להרחיב את מהטכניקה הניסויית הבסיסית שהוצגה, ניתן להתאים את היישומים ואת המפרט של המכשיר כדי שיתאימו לדרישות מסוימות, כגון מיון לעומת אפיון, או הוספת מאגרי מדגם ומערכת חצי אוטומטית למכשיר.

העשרת מדגם ביולוגית ומיון חלקיקים הוא לעתים קרובות יש צורך לניתוח שלאחר מכן. לדוגמא, בידוד של תאים נדירים מנוזלי גוף יש 1 יישומים חשובים בגילוי הסרטן ורפואה מותאמת אישית. 2,3 טכניקות ההעשרה הנפוצה ביותר הן תא ניאון מיון מופעל (FACS ) 4 ומגנטיים תא מיון מופעל (MACS), 5 אשר מסתמכים על סמני משטח הביעו לבדל את התאים. אסטרטגיות אחרות כוללות הידרודינמית מיון 6 או 7,8 האינרציה, פינצטה אופטית, 9 acoustophoresis, 10 וdielectrophoresis. 11,12 dielectrophoresis היא התנועה של חלקיקים מקוטבים בנוכחות שדה חשמלי לא אחיד. 13 DEP שמש במשך מגוון רחב של יישומים, כוללים תאים 2,14 מיון המבוססים על כדאיות, 15 אפיון תכונות bioelectrical של תאים, 16 ומין<html> ing על שינויים הנגרמים במאפייני biophysical של תאים. 17,18 DEP מסורתי מנצל אלקטרודות מישוריים בדוגמת בתוך ערוץ microfluidic ליישם מתח ולגרום לא אחיד שדה חשמלי. 13 בזמן הזה הוא טכניקה רבת עוצמה, אתגרים יכולים להתעורר, כגון delamination האלקטרודה ואלקטרוליזה. dielectrophoresis מבוסס מבודד (iDEP) 19 התייחס האתגרים של עכירות, delamination אלקטרודה, והשפלה המרחבי של שדה האלקטרודה דרך מבני בידוד דפוסים שיגרמו לאי - אחידות בשדה חשמלי DC. iDEP נעשה שימוש כדי להפריד באופן סלקטיבי בתאי חיידקי חיים ומתים, 19 לבודד נבגי חיידקים, 20 ולתפעל-DNA, 21 בין יישומים אחרים. חימום ג &#39;אול יכול להיות אתגר כי זה יכול להתרחש כתוצאה מהמתח הגבוה DC נדרש לעתים קרובות. כדי לשפר אתגרים אלה, microdevices DEP ללא קשר פותחו. 22-24 s = &quot;jove_content&quot;&gt; הטכניקה המוצגת כאן מנצלת dielectrophoresis מגע (cDEP), שנקראה כך על חוסר קשר ישיר בין אלקטרודות מתכתיות וערוץ המדגם. 22 ייחודיים לאסטרטגיה זו היא ההחלפה של אלקטרודות מתכתיות עם ערוצי האלקטרודה נוזל מלאים פתרון מוליך מאוד. אלקטרודות נוזלים אלה בשילוב capacitively פני מחסום בידוד דק לערוץ המדגם באמצעות מתח AC. ביטול קשר לדוגמא עם אלקטרודות מפחית נושאים הקשורים לשיטות המבוססות על DEP כמו אלקטרוליזה והיווצרות בועה, זיהום מדגם, וdelamination האלקטרודה. כתוצאה מכך, cDEP שימושי במיוחד עבור דגימות ביולוגיות משום שהוא תומך כדאיות של התאים במדגם. חשוב לציין, cDEP יכול לשמור על סטריליות לדוגמא. שבב יכול להיות מוכן במכסת מנוע בתרבית תאים והניסוי יכול להתנהל ללא צורך במגע מדגם לאלקטרודות מתכת או מחייב שהמדגם יהיה פתוח לenvironmeNT. מאגר פשוט יכול להיות קבוע לשקע שבב כדי להקל על התאוששות מדגם סטרילי. בנוסף, הייצור של אלקטרודות נוזל מאותו החומר ביולוגית הפולימר (PDMS) כערוץ המדגם מפחית את העלות הגבוהה שנגרם עם דפוסים מותאמים אישית של אלקטרודות מתכת, הזמן הנדרש לייצור, ומגביל את הצורך בציוד חדר נקי מיוחד לדפוסים הראשוניים של בול פרוסות סיליקון לשימוש חוזר. תנועה של חלקיקים עקב DEP תלוי במאפיינים של החלקיקים ובינוניים, כמו גם מילויים המרחבי של השדה החשמלי. גורם חלקיקים ותדירות תלויה, הנקרא גורם קלאוזיוס-Mossotti (CM), לוקח את ערך בטווח -0.5 ל1, וקובע את הכיוון של כוח DEP. התדירות שבה גורם CM הוא בדיוק אפס נקראת תדר החיתוך. זו הנקודה שבה שום כוח dielectrophoretic מופעל על חלקיקים וסימן שינויי גורם CM. שלתדר חיתוך ingle לmicrospheres המוצק אינרטי מתרחש כאשר שינויי גורם CM משלילי לחיובי 25 לתאי יונקים במאגר מוליכות נמוכים בסדר הגודל של 0.01 S / מ &#39;, תדר חיתוך ראשון שמעיד על מעבר מNDEP לpDEP קיים ליד 10. - 100 קילוהרץ, ומושפע מהגודל, הצורה, שלד התא, ומאפייני קרום של התא. 26,27 תדר חיתוך שני במעבר מpDEP למשטר NDEP הוא בסדר גודל של 10 MHz, ומושפע יחס גרעין-ציטופלסמה, מוליכות ציטופלסמה, וreticulum endoplasmic. 27 כוח DEP ניתן ליישם ללא הנוכחות של זרימת נוזל, אך כאן אנו מנצלים נוזל זורם להשגת מיון רציף של חלקיקים מרחפים. ההשפעה המשולבת של כוח dielectrophoretic וכוח הגרר &#39;סטוקס להכתיב את תנועת translational של חלקיקים. פיתחנו מכשירים לפעולה בשני תחומי תדרים. frequenc גבוה יותרמכשירי y (100-600 קילוהרץ) פעלו באמצעות pDEP ומיון אצווה השיג של תאים, כמו תאים סרטניים בערמונית ייזום (טיקים), אפיתל פני השחלות תאים עכבריים (Mose), מד&quot;א-MB-231 תאי סרטן השד, או לחיות THP -1 תאים על ידי לכידה סלקטיבי תאים של ריבית על בידוד הודעות ממוקמות בערוץ המדגם. 28-31 בתדר נמוך (5-100 קילוהרץ) התקנים לפעול ברציפות, וכאשר פעלו בתדירות שבה אוכלוסייה אחת חוויות pDEP אילו חוויות אוכלוסיית הרקע NDEP, יכול להפנות את מסלולי חלקיקים כדי להשיג מיון. 32-34 מכשירי תדר נמוך אלה היו בשימוש כדי למיין תאים סרטניים לתאי דם אדומים, לקבוע את השינויים במאפיינים דיאלקטרי של שורת תאי Mose מתקדמת, ועל מנת להבהיר את ההשפעות של אי טיפולי sphingolipid רעילים על היפוך מאפיינים אגרסיביים של תאי Mose אגרסיביים. בנוסף, יכול להיות מתוכנן microdevices cDEP לפעול בתפוקה מוגברת, כיום עד 1 מיליליטר / hr. 31,35 כפי שתוארו, הגמישות והעלות הנמוכה של תהליך הייצור מאפשרים גיאומטריות מכשיר מותאמות במיוחד, המאפשרות ההליך הניסיוני הוצג להיות רלוונטי למגוון רחב של יישומים. המטרה ארוך הטווח של cDEP היא להבין מיון ללא תווית תא והעשרה ברמה קלינית, עם התאוששות מדגם לתרבות או עיבוד שלאחר מכן. הטכניקה המוצגת כאן היא שיטה פשוטה וזולה, מייצור לניסויים, אשר מגבירה את הנגישות של DEP. אנו מדגימים את הכנת שבב cDEP ופרוטוקול הניסוי כדי להשיג אפיון והעשרה של תאי סרטן שחלות מזעירים מניאון.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) היא התופעה שבה מקוטבת חלקיקים בשדה חשמלי לא אחיד עוברים תנועת translational, והוא יכול לשמש כדי לכוון את התנועה של microparticles באופן סמן בלתי תלוי בשטח. באופן מסורתי, מכשירי DEP כוללים אלקטרודות מתכת מישוריים בדוגמת בערוץ המדגם. גישה זו יכולה להיות יקרה ודורשת סביבת חדר נקי מיוחדת. לאחרונה, גישה ללא קשר נקראת dielectrophoresis מגע (cDEP) פותחה. שיטה זו מנצלת את העיקרון הקלאסי של DEP תוך הימנעות ממגע ישיר בין האלקטרודות ומדגם על ידי אלקטרודות fluidic דפוסים וערוץ מדגם מpolydimethylsiloxane יחידה (PDMS) מצע, ויש לו יישום כאסטרטגיה microfluidic מהירה שנועדה למיין ולהעשיר microparticles. ייחודי לשיטה זו היא שהשדה החשמלי שנוצר דרך ערוצי האלקטרודה fluidic המכילים נוזל מוליך מאוד, אשר מופרדים מערוץ מדגם על ידי מחסום בידוד דק. בגלל אלקטרודות מתכת לא ישירות לפנות למדגם, אלקטרוליזה, delamination אלקטרודה, וזיהום מדגם נמנעים. בנוסף, זה מאפשר תהליך ייצור זול ופשוט. cDEP לכן מתאים היטב לטיפול בחלקיקים ביולוגיים רגישים. כוח dielectrophoretic פועל על החלקיקים תלויים לא רק על הדרגות המרחבי של השדה החשמלי שנוצר על ידי עיצוב להתאמה אישית של מכשיר הגיאומטריה, אבל מאפייני biophysical הפנימיים של התא. ככזה, cDEP היא טכניקה ללא תווית שמונעת בהתאם לסמנים ביולוגיים מולקולריים הביע משטח שעשוי לבוא לידי ביטוי variably בתוך אוכלוסייה, תוך שהוא מאפשר אפיון, העשרה, ומיון של bioparticles. הנה, אנחנו מדגימים את העקרונות הבסיסיים של ייצור וניסוי באמצעות cDEP. אנחנו מסבירים את ההכנה הפשוטה של ​​שבב cDEP באמצעות ליטוגרפיה הרכהטכניקות y. אנחנו דנים בהליך ניסיוני לאפיון תדר חיתוך של חלקיק או תא, התדירות שבה כוח dielectrophoretic הוא אפס. לבסוף, אנחנו מדגימים את השימוש בטכניקה זו למיון תערובת של תאי סרטן שחלות וfluorescing זעירים (חרוזים).

יש לשים לב DEP איכותי בערוץ המדגם כדי לאשר את המכשיר הוא מבצעי, כאשר השדה החשמלי הוא הווה. שיטה אחת לבדיקת הנוכחות של DEP היא להתאים את התדירות לערכים רחוק מתדר החיתוך שבי pDEP החזק וNDEP הם חזו (בערך&gt; 40 קילוהרץ להתבונן pDEP ו&lt; 10 קילוהרץ להתבונן NDEP עבור רוב התאים סרטניים ביונקים חיץ עם מוליכות של 100 μS / סנטימטר). יצוין, כי זעירים מאינרטי תערוכת pDEP מתחת תדר החיתוך שלהם וNDEP מעל תדר החיתוך שלהם. לגיאומטרית התכונה זגזגה שהוצגה כאן, pDEP יש לראות לתאים בתדירות גבוהה יותר במבחנים, שמסומן על ידי המופע של פנינת שרשור והתמקדות של תאים או חלקיקים בקצה התכונה זגזג של הערוץ, ובה בתדירות הבדיקה נמוכה יותר, NDEP צריך להיות ברור כמו תאים מוגבלים לאזור קרוב יותר לקצה הישר של הערוץ. בתדרים נמוכים אלה, תאים עשויים יסדואר בשל electroporation, כך לדוגמא עשוי להיראות מכיל פחות תאים, ואלו שאינם נראים לעין עשויים להופיע מוגדלים או מטושטש אם באמצעות צבע fluorescing enzymatically הופעל. אימות התדרים שבי pDEP וNDEP להתרחש מאפשרת קביעת התדר החיתוך כפי שתואר בפרוטוקול. לתאי יונקים בסרטן, כמו Mose-L משמשים כאן, צפינו NDEP ב5 קילוהרץ (איור 5 א) וpDEP החזק ב60 קילוהרץ (איור 5). היו לי תאי Mose-L קוטר של 17.7 ± 3.3 מיקרומטר (n = 268 תאים) ויש לי את החרוזים בקוטר נומינלי 4 מיקרומטר. ניתן למצוא ניתוח מלא של מאפייני דיאלקטרי של תאי Mose-L בהשוואה לתאי Mose בשלבים מוקדמים יותר של התקדמות בעבודה האחרונה על ידי Salmanzadeh et al. 33 אם pDEP וNDEP לא נצפו בקצוות הללו, בעיות שונות יכולה להיות התרחשות. מוליכות המדגם עלולות להיות גבוהות מדי בשל מזהמים או lysing תא. Insufficieשדה חשמלי NT יכול להיות שנוצר עקב בועות לכודות בערוצי האלקטרודה הנוזל, המונעים הולכה של זרם לחלק מהערוצים הגובלים בערוץ המדגם. זרימה לא יציבה עלולה להיגרם על ידי בועה לכודה במזרק או צינורות יניקה, בועות וכתוצאה מלא שמירה על המכשיר תחת ואקום למספיק זמן או לא ממלאים את המכשיר במהירות על הסרת מואקום, דליפה בשל delamination של PDMS מלוכד היטב ל שקופיות זכוכית, דמעות בקרום המחסום בשל כוח מופרז שהופעלו בעת מילוי הערוצים, או ספיקות בקצוות של טווח ההפעלה המשאבה. בנוסף לקביעת תדר החיתוך של תאים, בטכניקה זו ניתן להשתמש כדי למיין תערובת, כמתואר כאן בתערובת של תאי Mose-L וחרוזים. דוגמא זו מנצלת את dielectrophoresis השלילי (NDEP) הוצג על ידי 4 מיקרומטר חרוזים בתדרים שבו תאי Mose-L לחוות dielectrophoresis החיובי (pDEP). אנו operated המכשיר ב200 V RMS ו10 קילוהרץ (איור 6 א) וציין כי שני תאים וחרוזים היו מעורבים כפי שהם חוו NDEP. ב50 קילוהרץ צפינו תנועה של תאי Mose-L לחלק העליון של הערוץ, בעוד שחרוזים היו מוגבלים לחלק התחתון של הערוץ, מה שמאפשר הפרדה של התערובת לשני רכיבים (6 ב איור). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> איור 5. העמדה של תאי Mose-L היא מניפולציה על ידי שינוי התדר של השדה החשמלי מיושם. התמונות נלקחות בתכונה זגזגה הסופית בערוץ המדגם ואלקטרודות fluidic ממוקמות בפינות בצד ימין. הם מלאים בPBS המכיל rhodamine B, שמאיר לדמיין את הערוצים. (א) תאי Mose-L לחוות NDEP ב200 V RMS<html> ו5 קילוהרץ. (ב) תאי Mose-L לחוות שרשור פנינה וpDEP ב200 V RMS ו60 קילוהרץ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> איור 6. תערובת של תאי Mose-L (ירוק) ו 4 מיקרומטר חרוזים (אדום) לזרום דרך התכונה זגזגה הסופית בערוץ המדגם של מכשיר cDEP תדר נמוך. (א) ב200 V ו10 תאי קילוהרץ וחרוזים מעורבבים. חיצים מצביעים על הופעה קלושה תאים שסביר להניח שמתו בשל התנאים בתדר נמוכים. (ב) ב200 V ו50 תאי קילוהרץ לחוות pDEP ולעבור לקצה התכונה של הערוץ, ואילו חרוזים לחוות NDEP ויישארו מוגבלים לאזור הקרוב יותר הקצה ישר.&quot;Target =&quot; _blank p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Watch this Scientific Journal Video about Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis at JoVE.com

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

dielectrophoresis מגע (cDEP) משיג מיון והעשרה של חלקיקים באמצעות מאפייני דיאלקטרי הפנימיים שלהם. ערוצי האלקטרודה Fluidic להחליף אלקטרודות מתכתיות מסורתיות לDEP, אריג cDEP למים שאינם פוגע באפיון סטרילי ומיון של חלקיקים ביולוגיים. אנו מדגימים כיצד להכין microdevice cDEP ולערוך אפיון תא וניסויים מיון.

בידוד ללא תווית והעשרה של תאים דרך מגע dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

label-free-isolation-enrichment-cells-through-contactless

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K Views.  Virginia Tech.  dielectrophoresis מגע (cDEP) משיג מיון והעשרה של חלקיקים באמצעות מאפייני דיאלקטרי הפנימיים שלהם. ערוצי האלקטרודה Fluidic להחליף אלקטרודות מתכתיות מסורתיות לDEP, אריג cDEP למים שאינם פוגע באפיון סטרילי ומיון של חלקיקים ביולוגיים. אנו מדגימים כיצד להכין microde...

Video: Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

בידוד נייד phenotyping של בתאי גזע mesenchymal נגזר הסינוביאלי נוזל מח עצם של Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...