Ce travail soutenu a été soutenu en partie par la National Science Foundation Grant No. 0938047 EFRI, et par l&#39;Institut Virginia Tech pour les technologies critiques et des sciences appliquées (ICTAS). Les auteurs tiennent à remercier le Dr Eva Schmelz et le Dr Paul Roberts pour leur don type de cellules MOSE-L. Les auteurs reconnaissent Angela Anderson pour son aide à la culture cellulaire, Caitlan Swaffar pour son aide avec l&#39;édition de ce document et la préparation des expériences, et tous les membres du laboratoire Bioelectromechanical Systems.

Une. Fabrication d&#39;un dispositif prototype CDEP microfluidique: Vue d&#39;ensemble <ol><li> Suivez les procédures précédemment rapportés 22 en utilisant résine photosensible et gravure ionique réactive profonde (DRIE) pour graver la conception de canal désiré (figure 1) dans une plaquette de silicium (figure 2). Déposer une mince couche de Téflon afin d&#39;améliorer la libération du microdispositif à partir de la plaquette. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma d&#39;un dispositif à faible tri continue de fréquence. L&#39;échantillon canal fonctionne de gauche à droite et 500 m de large avec des rétrécissements en dents de scie de 100 um. Les deux paires de canaux fluidiques composent d&#39;électrodes de source et de puits électrodes, respectivement, et sont séparés du canal d&#39;échantillon par une barrière d&#39;épaisseur 20 um de PDMS. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> Figure 2. Le fabrprocessus de ication d&#39;un dispositif CDEP. (a) Pour 60 secondes, la lumière UV réagit sélectivement avec résine photosensible exposée à travers un motif de masque de la géométrie du dispositif CDEP. (b) Photoresist est éliminé en utilisant développeur. (c) gravure ionique réactive profonde (DRIE) est utilisé pour graver 50 um caractéristiques de profondeur, et à 5 min de gravure par voie humide par l&#39;hydroxyde de tétraméthylammonium (TMAH) à 25% à 70 ° C est utilisé pour réduire la rugosité des parois latérales. (d) un revêtement de Téflon est ajouté pour améliorer la libération de l&#39;appareil à partir de la plaquette. (e) PDMS est versée sur la plaquette tampon réutilisable après dégazage et durci pendant 45 minutes à 100 ° C. (f) PDMS est retiré de la plaquette. PDMS et d&#39;une lame de verre propre est exposé à un plasma d&#39;air pendant 2 min et liées ensemble. <ol start="2"><li> Enveloppez la tranche d&#39;une feuille d&#39;aluminium pour éviter de débordement. Mélanger le polydiméthylsiloxane (PDMS) à 10:1 en élastomère à l&#39;agent de durcissement, de-gaz pendant environ 20 min, Et versez sur la plaquette. Chauffer pendant 45 min à 100 ° C pour éviter d&#39;endommager le revêtement de Téflon du timbre. Laissez l&#39;appareil refroidir. </li><li> Après refroidissement, retirez le papier d&#39;aluminium, de l&#39;assiette PDMS en utilisant une lame chirurgicale, et le punch des trous d&#39;accès à l&#39;entrée du canal / sortie en utilisant un perforateur émoussé adaptée à la taille de tube. Ici, un perforateur émoussé 1,5 mm est utilisé. </li><li> Nettoyer une lame de microscope en verre à l&#39;aide d&#39;un rinçage de l&#39;eau et du savon, de l&#39;éthanol, de l&#39;eau déminéralisée, et le séchage à l&#39;air, respectivement. Nettoyez l&#39;appareil PDMS en utilisant du ruban Scotch Magic. Examiner au microscope pour être sûr canaux sont propres. Exposer la lame et dispositif de PDMS à plasma d&#39;air pendant 2 min. Appuyez fermement côté du canal de dispositif à lame de verre, en évitant la formation de bulles d&#39;air entre l&#39;appareil et le chariot (Figure 3). </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> Figure 3. </strong&gt; (a) Le masque utilisé pour la photolithographie au cours de la fabrication de timbre plaquette de silicium, et (b) le dispositif de PDMS-verre fini avec l&#39;échantillon et canaux d&#39;électrodes liquides remplis avec du colorant alimentaire vert et rouge, respectivement. Voir la Figure 1 pour les dimensions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . 2. Préparation d&#39;une suspension de cellules dans le tampon DEP <ol><li> Préparer une faible conductivité (100 uS / cm) tampon, qui sera dénommé &quot;tampon DEP» (8,5% de saccharose [w / v], 0,3% de glucose [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) 16. </li><li> Suspendre les cellules dans un tampon DEP à 3 x 10 6 cellules / ml. Ici, les cellules cancéreuses de souris à un stade avancé de l&#39;ovaire épithélial de surface (MOSE-L) sont utilisés. </li></ol> Remarque: l&#39;analyse de la viabilité cellulaire par la méthode d&#39;exclusion du colorant bleu trypan a montré une légère diminution de la viabilité(De 95,1 à 91,6%) de MOSE (MOSE-E), les cellules de stade précoce en suspension dans un tampon DEP à la température ambiante après 5 h. Il est prévu qu&#39;une légère diminution similaire se produit pour la viabilité des cellules MOSE-L, indiquant que les cellules ne doivent pas être stockés dans DEP tampon à long terme. <ol start="3"><li> Teindre les cellules en utilisant un colorant fluorescent membrane perméable, telle que la voie enzymatique activé par la calcéine AM. </li><li> Mesurer la conductivité de la suspension de cellules teint. La conductivité doit être d&#39;environ 100 uS / cm. Si la mesure de la conductivité est trop élevé, faites tourner l&#39;échantillon vers le bas, remettre en suspension dans un tampon DEP à 3 x 10 6 cellules / ml et répéter la mesure de la conductivité. </li></ol> 3. Chargement de la CDEP microfluidique Chip <ol><li> Placer la puce microfluidique sous vide pendant 30 min. </li><li> Pendant ce temps, couper un morceau de tuyau flexible pour couvrir la distance de la pompe de la seringue à la platine du microscope où sera située la puce microfluidique. Ici, une longueur de 6 pouces de tubeest nécessaire. Prévoir un tuyau à l&#39;aiguille pointe sur la seringue. </li><li> Estimer la longueur requise pour un tube de sortie en divisant le volume d&#39;échantillon prélevé cible par l&#39;aire de section transversale du tube. Couper le nécessitent longueur de tube. </li><li> Dessinez suspension de cellules dans la seringue. Vérifier que l&#39;absence de bulles sont situés dans la tubulure ou de la seringue. </li><li> Après retrait d&#39;une puce de vide, insérer le tube de sortie et le premier canal de l&#39;échantillon rapidement pour éviter les bulles d&#39;air piégées dans les canaux. Tapoter doucement la seringue lors de l&#39;amorçage pour éviter la rupture de la mince (20 mm) barrière isolante, mais il a été observé que la barrière peut résister à un débit élevé constant près de 5 ml / h sans se rompre. </li><li> Pour les premiers canaux d&#39;électrode, placer rapidement des embouts de pipette vides dans une sortie de chaque canal d&#39;électrode fluidique. Introduire à la pipette 200 ul de PBS contenant une petite quantité de rhodamine B et tapoter doucement pour introduire le fluide dans l&#39;extrémité opposée du canal de l&#39;électrode. Maintenir une légère pressionjusqu&#39;à PBS avec de la rhodamine B progresse visiblement jusqu&#39;à la pointe de l&#39;embout de pipette vide. Répétez l&#39;opération pour chaque canal de l&#39;électrode. La rhodamine B est utilisée pour visualiser la fluorescence uniquement les canaux d&#39;électrode fluidiques. </li><li> Après amorçage, remplir chaque réservoir de pointe de la pipette avec du PBS avec de la rhodamine B. Éviter la formation de bulles dans les réservoirs de pointes de pipettes, et d&#39;éliminer toute bulle visible par pipetage de haut en bas. Détachez le tuyau de sortie et jeter de façon appropriée, puis insérez un réservoir de tubulure de sortie frais de recueillir le volume cible. </li></ol> 4. Caractériser la fréquence de croisement de cellules utilisant CDEP Chip <ol><li> Positionner la puce sur la platine d&#39;un microscope inversé équipé d&#39;un appareil photo numérique (figure 4). </li></ol><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> Figure 4. </strong&gt; (a) expérimental pour l&#39;ensemble des expériences CDEP. La puce CDEP se trouve sur la plate-forme du microscope inversé. Une caméra envoie des images à l&#39;ordinateur pour l&#39;enregistrement. La pompe à seringue maintient un débit d&#39;entrée constant. Le générateur de fonction génère un signal qui est intensifié par l&#39;amplificateur haute tension et relié à la puce CDEP par des électrodes en fil. L&#39;oscilloscope surveille le signal envoyé à la puce. (B) Vue détaillée de la puce CDEP et connexions fluidiques et électroniques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <ol start="2"><li> Monter la seringue sur le pousse-seringue et insérer des fils-électrodes dans fluidiques réservoirs du canal de l&#39;électrode. </li><li> Pomper le fluide à travers au 1 ml / h pour assurer un bon contact entre la pompe à seringue et la seringue. Inspecter visuellement la longueur du canal pour assurer une circulation sans entrave des cellules et l&#39;absence de bulles ou de fuites. Rougedébit uce à 0,005 ml / h. Remarque: débit aussi élevé que 1 ml / h 31,35 a été réalisé dans des dispositifs d&#39;autres géométries. </li><li> Par mesure de sécurité, tester l&#39;électronique par la mise sous tension du générateur de fonctions, un amplificateur de haute tension, et un oscilloscope, et de réglage de la tension et de la fréquence souhaitée. Ici, ces paramètres sont à 200 V et 20 kHz. Lors de la vérification de performance acceptable, la mise hors tension. Connecter les électrodes à l&#39;amplificateur haute tension. Remarque: Respecter les consignes de sécurité électrique appropriées lors de l&#39;utilisation de l&#39;électronique dans les hautes tensions utilisées pour ces expériences. </li><li> Après la réalisation de flux constant, appliquer la tension souhaitée à la fréquence désirée. Dans cette expérience, la tension est de 200 V RMS à des fréquences comprises entre 5 à 60 kHz. </li><li> fichiers vidéo d&#39;enregistrement de la réponse cellulaire à des techniques de traitement d&#39;image (étape 5) pour quantifier la répartition des cellules dans le canal et de caractériser la fréquence de coupure. Pour ce faire,maintenir une tension constante et de faire varier la fréquence de façon systématique. Au début et à la fin de l&#39;expérience, ainsi que de façon aléatoire entre les essais expérimentaux, enregistrer la répartition de cellules de contrôle, la répartition des cellules sans application de champ électrique. Estimer la quantité de temps nécessaire pour que les cellules à l&#39;écoulement de l&#39;entrée vers l&#39;emplacement surveillé (ici, 5 min). Après avoir défini une nouvelle fréquence, attendre ce laps de temps, puis commencer à enregistrer (ici, une vidéo de 2 min de la distribution de la cellule). </li></ol> 5. Traitement de l&#39;image pour caractériser la fréquence de croisement <ol><li> Utilisation d&#39;un script de calcul, analyser chaque image vidéo, image par image afin de déterminer la position y relative (où la direction z est la profondeur verticale de la voie, la direction y est la largeur de canal et la direction x est la longueur de canal) de chaque cellule ou d&#39;une particule fluorescente à une abscisse déterminée en aval de la région de la force DEP haut dans le canal. Créer un graphique de l&#39;écran par rapportcontribution. </li><li> Comparer la ligne médiane de la distribution, à chaque tension et la fréquence de la ligne médiane de la répartition de commande. Pour une tension donnée et des fréquences variables, déterminer la fréquence de transition, où l&#39;axe correspond à la position y de la commande. </li></ol> 6. Varier l&#39;expérience pour effectuer le tri de cellules ou d&#39;enrichissement <ol><li> Suspension de mélange souhaité dans un tampon DEP à une concentration totale de 3 x 10 6 particules / ml. Ici, ce mélange est MOSE cellules-L avec 4 perles um fluorescents dans un tampon DEP. Suivez les étapes décrites précédemment pour préparer un dispositif CDEP. </li><li> Pour trier ou enrichir des cellules à partir d&#39;un mélange, déterminer les fréquences de coupure des cellules cibles et les particules de base comme décrit précédemment. Exploiter l&#39;expérience à une fréquence entre les deux fréquences de coupure des cellules cibles et les particules de fond de sorte que les deux populations de particules subissent des forces DEP en face directions. Pour trier les cellules MOSE-L et 4 pm perles, utiliser le micro-dispositif ci-dessus 11.90 ± 0.63 kHz. la première fréquence de coupure de cellules MOSE-L récemment rapporté par Salmanzadeh et al 33. </li><li> Pour récupérer le contenu d&#39;un échantillon trié, retirer la tubulure de sortie lors de la collecte du volume cible, en plaçant un doigt de gant au-dessus de l&#39;ouverture de sortie et en tirant doucement sur le tube. Verser le volume cible recueilli dans un réservoir pour une analyse ultérieure. Remarque: D&#39;autres méthodes de récupération de l&#39;échantillon pourraient inclure la fixation d&#39;un réservoir permanent de la puce et de prélever l&#39;échantillon par simple pipetage. </li></ol>

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Bioelectron. 30, 13-20 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Dielectric+Properties+of+Different+Stages+of+Syngeneic+Murine+Ovarian+Cancer+Cells.">Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells.</a> Biomicrofluidics. , (2013).</li><li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , 590-593 (2012).</li><li>Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+contactless+dielectrophoresis:+Theoretical+considerations.">Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations.</a> Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).</li><li>Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+beads+and+cells+in+multi-channel+microfluidic+devices+using+dielectrophoresis+and+laminar.">Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar.</a> J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).</li><li>Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis.">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis.">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li></ol>

Dr. Rafael Davalos a un brevet en instance pour contact diélectrophorèse.

DEP est une technique puissante pour déterminer les propriétés diélectriques de particules et de diriger le mouvement des particules vers le tri des applications, l&#39;isolement, ou d&#39;enrichissement. En raison de l&#39;effet néfaste de contact des électrodes directement auprès d&#39;un échantillon, d&#39;autres ont adopté des approches similaires à la méthode présentée précédemment pour éviter le contact. Par exemple, les dispositifs DEP libre de contact-Bashir et al. Développé en utilisant un dispositif microfluidique PDMS séparé de imprimées électrodes de la plaquette de circuit par une fine lamelle de verre, et cette technique est également disponible en format vidéo. 23,36 Ici, nous avons montré la fabrication d&#39;une puce CDEP fluidiques et des électrodes en utilisant un substrat de PDMS unique, et le protocole expérimental pour la séparation de cellules de cancer ovarien à partir d&#39;un mélange de cellules et de billes fluorescentes. La technique présentée a été utilisé avec succès pour une variété d&#39;applications plus complexes et physiologiquement pertinents, y compris le tri livcellules de e et mortes, 28 tumeur initiant des cellules provenant des cellules de cancer de la prostate, les 30 cellules cancéreuses à partir de cellules rouges du sang dilués, 31,32 et la différentiation entre les stades du cancer du sein 37 et le cancer de l&#39;ovaire. 29 CDEP a également été utilisé pour mélanger des particules 38. Ces suggèrent que les applications en utilisant la technique simple présenté, diverses fins peuvent être réalisés simplement en modifiant la conception de la géométrie du canal. . DEP est utile à l&#39;échelle microscopique pour la manipulation de particules 13 Pour des particules sphériques, la force diélectrophorétique translation dépend des propriétés électriques et de la taille de la particule et son milieu de suspension, ainsi que le gradient du champ électrique au carré: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> où ε m est la constante diélectrique du milieu de suspension, r est le rayonde la particule, et Rc [k (ω)] est la partie réelle du facteur de Clausius-Mossotti (CM). Le facteur de CM est une mesure de la polarisabilité relative de la particule par rapport au milieu de mise en suspension et détermine la direction de la force diélectrophorétique. Il est décrit comme <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> où <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> et <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> sont les permittivités complexes de la particule et moyen, respectivement. La permittivité complexe, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , Dépend de la conductivité (σ) et la fréquence (ω). Le facteur de CM de particules sphériques est théoriquement lié entre -0,5 et 1. Si le facteur de CM est négative, les particules subissent nDEP parce que le support est plus polarisable de la particule, de sorte que les particules de s&#39;éloigner de régions d&#39;gradients de champ électrique élevé. Si le facteur de CM est positive, les particules sont plus polarisables que le milieu et ils éprouvent pDEP dans laquelle elles se déplacent vers les régions de forts gradients de champ électrique. Pour des particules biologiques qui sont non homogène dans la structure, comme des cellules, le facteur de Clausius-Mossotti peut être déterminée à partir d&#39;une valeur effective pour la permittivité de particules: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> où <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> et <img alt="Équation 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> sont la permittivité complexe de la permittivité complexe efficace de l&#39;intérieur de la cellule, comme le cytoplasme, et la membrane plasmique, respectivement,. r est le rayon de la cellule, et d est l&#39;épaisseur de la membrane plasmique 26 Lorsque DEP se produit avec les particules en suspension dans unfluide, le mouvement de la particule par rapport au fluide va générer une force de traînée sur la particule. Cette force de traînée doit être considéré lors de la détermination de la force globale agissant sur la particule. Pour les situations qui nous intéressent ici, les forces visqueuses dominent et les particules sont supposées sphériques, petite, et se déplaçant avec une vitesse relativement faible, de sorte que la loi de traînée de Stokes fournit une bonne approximation de la force de traînée: <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> où η est la viscosité du fluide, u p est la vitesse de la particule, et u f est la vitesse du fluide, qui peut également être en mouvement. Compte tenu de la force diélectrophorétique, fluide et les propriétés des particules connues, et une vitesse d&#39;écoulement connu, l&#39;équilibre entre la force de traction et la force diélectrophorétique peut être résolu pour estimer la vitesse de la particule. Le taux de cisaillement que l&#39;expérience des cellules doit être inférieur au seuil à partir duquel cell lyse peut se produire. Caractérisation des propriétés électriques des particules est nécessaire de prévoir et de contrôler la façon dont ils vont réagir dans les PED. Dans ce travail, nous avons spécifiquement utilisés faible CDEP de fréquence avec des cellules MOSE-L pour démontrer le protocole pour déterminer la première fréquence de coupure de cellules, et ensuite montré tri continue de billes de polystyrène et des cellules MOSE-L sur la base de leurs réponses DEP opposées. La modification de la géométrie du dispositif CDEP changera les gradients spatiaux du champ électrique, ce qui permet à des dispositifs conçus pour la haute fréquence ou de fonctionnement à basse fréquence, et pour une grande sélectivité et de l&#39;efficacité de tri pour un type de cellule spécifié. En outre, des dispositifs à haut débit peuvent être développés par la fabrication des canaux plus larges, 30 voies en parallèle, ou 30 par la fabrication multicouche 35, dans lequel les canaux d&#39;électrode sont empilés verticalement au-dessus et au-dessous d&#39;une relativement profondecanal d&#39;échantillon. Membranes minces forment la barrière entre les couches. Les tests préliminaires dispositifs fabriqués en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) et polycarbonate (PC) des films minces ont démontré réponse DEP de cellules MOSE-L. Les efforts actuels sont en cours pour affiner les dispositifs à haut débit multi-couches et d&#39;améliorer le système périphérique vers une plate-forme plug-and-play éventuelle. Pour développer de la technique expérimentale de base présentée, les applications et les spécifications de l&#39;appareil peuvent être adaptés aux exigences particulières, telles que le tri par rapport à la caractérisation, ou l&#39;ajout de réservoirs d&#39;échantillons et un système semi-automatique de l&#39;appareil.

Enrichissement de l&#39;échantillon biologique et le tri des particules est souvent nécessaire pour une analyse ultérieure. 1 Par exemple, l&#39;isolement de cellules rares à partir de fluides corporels a d&#39;importantes applications dans la détection du cancer et de la médecine personnalisée. 2,3 Les techniques d&#39;enrichissement les plus couramment utilisés sont cellulaire activé par fluorescence (FACS ) 4 et magnétique tri cellulaire activé (MACS), 5 qui s&#39;appuient sur ​​des marqueurs de surface exprimés à différencier les cellules. D&#39;autres stratégies comprennent hydrodynamique inertie 6 ou 7,8 tri, des pinces optiques, acoustophorèse 9, 10 et diélectrophorèse. 11,12 diélectrophorèse est le mouvement d&#39;une particule polarisée en présence d&#39;un champ électrique non uniforme. DEP 13 a été utilisé pour une large gamme d&#39;applications, y compris les cellules 2,14 tri sur la base de la viabilité, 15 caractérisant les propriétés bioélectriques des cellules, 16 et trition sur les changements induits dans les propriétés biophysiques des cellules. 17,18 DEP traditionnelle utilise des électrodes planes motifs dans un canal microfluidique à appliquer une tension et induire une non-uniforme champ électrique. 13 Bien que ce soit une technique puissante, les défis peuvent survenir, tels que électrode délaminage et l&#39;électrolyse. Diélectrophorèse base isolant (IDEP) 19 a abordé les défis de l&#39;encrassement, électrode délamination et la dégradation spatiale du champ de l&#39;électrode à travers des structures isolantes de motifs qui induisent des inhomogénéités dans un champ électrique continu. IDEP a été utilisé pour séparer sélectivement les cellules vivantes et mortes bactéries, 19 isoler les spores bactériennes, 20 et manipuler l&#39;ADN, 21 entre autres applications. Chauffage par effet Joule peut être un défi, car il peut se produire en raison de la haute tension à courant continu souvent requises. Pour améliorer ces défis, microdevices DEP sans contact ont été développés. 22-24 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La technique présentée ici utilise contact diélectrophorèse (CDEP), ainsi nommé pour le manque de contact direct entre les électrodes métalliques et le canal de l&#39;échantillon. 22 Unique à cette stratégie est le remplacement des électrodes métalliques avec canaux d&#39;électrodes liquides remplis de une solution hautement conducteur. Ces électrodes de fluide sont couplés de manière capacitive à travers une mince barrière isolante au canal d&#39;échantillon par l&#39;intermédiaire d&#39;une tension alternative. Éliminant le contact de l&#39;échantillon avec des électrodes permet de réduire les problèmes associés aux méthodes basées sur la DEP tels que l&#39;électrolyse et la formation de bulles, la contamination de l&#39;échantillon, et l&#39;électrode de délaminage. En conséquence, CDEP est particulièrement utile pour des échantillons biologiques, car elle prend en charge la viabilité des cellules dans l&#39;échantillon. Surtout, CDEP peut maintenir échantillon stérilité. Une puce peut être préparé dans une hotte de culture cellulaire et l&#39;expérience peut être réalisée sans nécessiter de contact avec l&#39;échantillon à des électrodes métalliques ou en exigeant que l&#39;échantillon soit ouvert à l&#39;environnement à l&#39;nt. Un réservoir simple peut être fixé à la sortie de la puce pour faciliter la récupération de l&#39;échantillon stérile. En outre, la fabrication d&#39;électrodes de fluide à partir de la même matière polymère biocompatible (PDMS), comme le canal d&#39;échantillon réduit le coût élevé supporté à motif personnalisé d&#39;électrodes métalliques, le temps nécessaire à la fabrication et limite la nécessité d&#39;un équipement de salle blanche spécialisé pour la structuration initiale de l&#39;estampille plaquette de silicium réutilisable. Mouvement de particules en raison de DEP dépend des caractéristiques de la particule et le milieu, ainsi que les gradients spatiaux du champ électrique. Une particule et le facteur dépendant de la fréquence, appelé le facteur de Clausius-Mossotti (CM), prend une valeur dans la plage de -0,5 à 1, et détermine la direction de la force DEP. La fréquence à laquelle le facteur de CM est exactement zéro est appelée la fréquence de coupure. Ceci est le point auquel aucune force diélectrophorétique est exercée sur une particule et le signe des variations de facteur de CM. Un single fréquence de croisement pour des microsphères solides inertes se produit lorsque le facteur de CM changements de négatif à positif 25 Pour des cellules de mammifère dans un tampon de faible conductivité de l&#39;ordre de 0,01 S / m, une première fréquence de croisement indiquant une transition d&#39;nDEP à pDEP existe près de 10. - 100 kHz, et est influencé par la taille, la forme, cytosquelette, et les propriétés de la membrane de la cellule. 26,27 Une seconde fréquence de coupure à un passage du régime de pDEP nDEP est de l&#39;ordre de 10 MHz, et est influencé par l&#39; noyau-cytoplasme rapport, cytoplasme conductivité, et réticulum endoplasmique. 27 force DEP peut être appliqué sans la présence d&#39;un écoulement de fluide, mais ici nous utilisons un fluide en écoulement continu pour atteindre le tri des particules en suspension. L&#39;influence combinée de la force diélectrophorétique et la force de traînée de Stokes de dicter le mouvement de translation d&#39;une particule. Nous avons développé des dispositifs pour le fonctionnement dans deux bandes de fréquences. Frequenc supérieurdispositifs y (100-600 kHz) ont fonctionné en utilisant pDEP et atteint tri des cellules du lot, tels que les cellules tumorales de la prostate amorçage (tics), de l&#39;ovaire épithéliales de surface (MOSE) des cellules murines, MDA-MB-231 cellules de cancer du sein, ou vivre THP -1 cellules par piégeage sélectivement les cellules d&#39;intérêt sur ​​les postes situés dans le canal de l&#39;échantillon isolant. 28-31 de fréquence inférieure (5-100 kHz) dispositifs fonctionnent en continu, et lorsqu&#39;il est utilisé à une fréquence à laquelle un population éprouve pDEP tandis que l&#39;arrière-plan des expériences de la population nDEP, peut rediriger les trajectoires des particules de réaliser le tri. 32-34 Ces dispositifs de basse fréquence sont utilisés pour trier les cellules cancéreuses à partir de cellules rouges du sang, de déterminer des changements dans les propriétés diélectriques d&#39;une lignée cellulaire de MOSE progressive, et d&#39;élucider les effets de la non- traitements sphingolipides toxiques sur l&#39;inversion des caractéristiques agressives de cellules MOSE agressifs. En outre, microdevices CDEP peuvent être conçus pour fonctionner à un débit accru, actuellement à 1 ml / hr. 31,35 Comme décrit, la flexibilité et le faible coût du processus de fabrication permet géométries de dispositifs conçus sur mesure, qui permettent à la procédure expérimentale présentée est pertinente pour un large éventail d&#39;applications. L&#39;objectif à long terme de CDEP est de réaliser sans étiquette tri cellulaire et l&#39;enrichissement sur le plan clinique, avec récupération de l&#39;échantillon pour la culture ou le traitement ultérieur. La technique présentée ici est une méthode simple et peu coûteuse, de la fabrication à l&#39;expérimentation, ce qui augmente l&#39;accessibilité du DEP. Nous démontrons la préparation d&#39;une puce CDEP et le protocole expérimental pour réaliser la caractérisation et l&#39;enrichissement de cellules cancéreuses d&#39;ovaire de microsphères fluorescentes.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

La diélectrophorèse (DEP) est le phénomène par lequel des particules polarisées dans un champ électrique non uniforme subissent un mouvement de translation, et peut être utilisé pour diriger le mouvement de microparticules d&#39;une manière indépendante de marqueur surface. Traditionnellement, les dispositifs DEP comprennent des électrodes métalliques planes à motif dans le canal d&#39;échantillon. Cette approche peut être coûteuse et nécessite un environnement de salle blanche spécialisée. Récemment, une approche sans contact appelée diélectrophorèse contact (CDEP) a été développé. Cette méthode utilise le principe classique de DEP, tout en évitant un contact direct entre les électrodes et l&#39;échantillon par structuration des électrodes fluidiques et un canal d&#39;échantillon à partir d&#39;une seule polydiméthylsiloxane (PDMS) substrat, et a une application en tant que stratégie rapide microfluidique conçu pour trier et enrichir des microparticules. La particularité de ce procédé est que le champ électrique est généré via des canaux fluidiques d&#39;électrode contenant un fluide hautement conducteur, qui sont séparées l&#39;canal de l&#39;échantillon par une mince barrière isolante. Parce électrodes métalliques ne touchent pas directement l&#39;échantillon, l&#39;électrolyse, l&#39;électrode délamination et la contamination de l&#39;échantillon sont évités. En outre, cela permet un procédé de fabrication simple et peu coûteuse. CDEP est donc bien adapté pour la manipulation de particules biologiques sensibles. La force diélectrophorétique agissant sur les particules dépend non seulement de gradients de champ électrique généré par la conception personnalisable de la géométrie du dispositif, mais les propriétés biophysiques intrinsèques de la cellule. En tant que tel, CDEP est une technique sans étiquette qui évite selon biomarqueurs moléculaires exprimées en surface qui peut être variable exprimés dans une population, tout en permettant la caractérisation, l&#39;enrichissement et le tri des particules biologiques. Ici, nous démontrons les bases de la fabrication et de l&#39;expérimentation à l&#39;aide CDEP. Nous expliquons la préparation simple d&#39;une puce CDEP utilisant lithographie doucetechniques y. Nous discutons le mode opératoire expérimental pour la caractérisation de fréquence de coupure d&#39;une particule ou d&#39;une cellule, la fréquence à laquelle la force diélectrophorétique est égal à zéro. Enfin, nous démontrons l&#39;utilisation de cette technique pour le tri d&#39;un mélange de cellules de cancer de l&#39;ovaire et fluorescent microsphères (billes).

DEP doit être observée qualitativement dans le canal d&#39;échantillon pour confirmer l&#39;appareil est opérationnel lorsque le champ électrique est présent. Une méthode pour tester la présence de DEP est d&#39;ajuster la fréquence à valeurs loin de la fréquence de transition, où une forte pDEP et nDEP sont prédites (à peu près&gt; 40 kHz à observer pDEP et &lt;10 kHz à observer nDEP pour la plupart des cellules cancéreuses de mammifère dans un un tampon ayant une conductivité de 100 uS / cm). Il convient de noter que les microsphères inertes présentent pDEP-dessous de leur fréquence de coupure et nDEP-dessus de leur fréquence de coupure. Pour la géométrie de la fonction en dents de scie présenté ici, pDEP devrait être considérée pour les cellules à la fréquence d&#39;essai plus élevée, indiquée par l&#39;apparition de la perle de chaînage et la focalisation des cellules ou des particules au bord de fonction en dents de scie de la chaîne, tout en fréquence de test inférieur, nDEP devrait être évident que les cellules sont restreintes à la région plus proche du bord droit de la voie. A ces basses fréquences, les cellules peuvent Lyse en raison de l&#39;électroporation, de sorte que l&#39;échantillon peuvent apparaître à contenir un nombre de cellules, et celles qui sont visibles peuvent apparaître élargie ou trouble si l&#39;on utilise un colorant fluorescent activé par voie enzymatique. Vérification des fréquences auxquelles pDEP et nDEP se produisent permet de déterminer la fréquence de transition tel que décrit dans le protocole. Pour les cellules cancéreuses de mammifères, tels que-L MOSE utilisés ici, nous avons observé nDEP à 5 kHz (figure 5a) et une forte pDEP à 60 kHz (figure 5b). MOSE cellules-L avait un diamètre de 17,7 ± 3,3 um (n = 268 cellules) et les billes ont un diamètre nominal de 4 um. Une analyse complète des propriétés diélectriques de cellules MOSE-L par rapport aux cellules MOSE dans les premiers stades de progression peut être trouvé dans les travaux récents de Salmanzadeh et al. 33 Si pDEP et nDEP ne sont pas respectées à ces extrêmes, divers problèmes peuvent se produire. La conductivité de l&#39;échantillon peut être trop élevée en raison de contaminants ou de lyse cellulaire. INSUFFISANTEnt champ électrique peut être généré en raison de bulles emprisonnées dans les canaux d&#39;électrode de fluide, qui empêchent une conduction de courant pour la partie des canaux qui bordent le canal d&#39;échantillon. Écoulement instationnaire peut être causée par une bulle piégée dans la seringue ou un tuyau d&#39;entrée, des bulles résultant de ne pas garder le dispositif sous vide pendant une durée suffisante ou ne pas remplir rapidement le dispositif lors de l&#39;enlèvement du vide, la fuite due au délaminage du PDMS faiblement liés à l&#39; lame de verre, des larmes dans la membrane de barrière due à une force excessive exercée lors du remplissage des canaux, ou des débits aux extrémités de la plage de fonctionnement de la pompe. En plus de la détermination de la fréquence de séparation de cellules, cette technique peut être utilisée pour trier un mélange, illustré ici par un mélange de cellules MOSE-L et des perles. Cet exemple prend avantage de la diélectrophorèse négative (nDEP) présenté par 4 pm perles à des fréquences où les cellules MOSE-L éprouvent diélectrophorèse positive (pDEP). Nous operated l&#39;appareil à 200 V RMS et 10 kHz (figure 6a) et a observé que les deux cellules et les billes ont été mélangés comme ils ont connu nDEP. A 50 kHz, nous avons observé le mouvement des cellules MOSE-L à la partie supérieure du canal, tandis que les billes ont été limités à la partie inférieure du canal, ce qui permet la séparation du mélange en deux composants (Figure 6b). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> Figure 5. La position des cellules MOSE-L est manipulée en changeant la fréquence du champ électrique appliqué. Les photos sont prises à la fonction en dents de scie finale dans le canal d&#39;échantillon et les électrodes fluidiques sont situés au niveau des coins sur le côté droit. Ils sont remplis avec du PBS contenant de la rhodamine B, qui devient fluorescent pour visualiser les canaux. (A) des cellules MOSE-L expérience nDEP à 200 V RMS<html> et 5 kHz. (b) des cellules MOSE-L expérience enchaînement de perles et pDEP à 200 V RMS et 60 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> Figure 6. Un mélange de cellules MOSE-L (vert) et de 4 um billes (rouge) s&#39;écouler à travers la fonction en dents de scie finale dans le canal d&#39;un dispositif de CDEP basse fréquence d&#39;échantillonnage. (A) A 200 V et 10 cellules kHz et les perles sont mélangées. Les flèches indiquent apparaissant faiblement cellules qui probablement sont morts à cause des conditions de basse fréquence. (B) A 200 V et 50 cellules kHz expérience pDEP et se déplacent vers le bord de fonction du canal, tout en perles expérience nDEP et restent confinées à la région proche le bord droit.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure.

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Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Contact diélectrophorèse (CDEP) réalise le tri et l&#39;enrichissement de particules par leurs propriétés diélectriques intrinsèques. Canaux d&#39;électrodes fluidiques remplacent électrodes métalliques traditionnelles de DEP, convenant CDEP à la non-qualification endommager stérile et le tri des particules biologiques. Nous démontrons comment préparer un micro CDEP et effectuer la caractérisation des cellules et des expériences de tri.

L&#39;isolement et l&#39;enrichissement des cellules sans étiquette Grâce contact Diélectrophorèse

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.9K vues.  Virginia Tech.  Contact diélectrophorèse (CDEP) réalise le tri et l'enrichissement de particules par leurs propriétés diélectriques intrinsèques. Canaux d'électrodes fluidiques remplacent électrodes métalliques traditionnelles de DEP, convenant CDEP à la non-qualification endommager stérile et le tri des particules biologiques. Nous démontrons comment préparer un micro CDEP et effectuer la caractérisation des cellules et des expériences de tri. 

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Recherche

Médecine

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l&#39;ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Dans l&#39;Enrichissement vitro du cancer des ovaires cellules initiatrices de tumeurs

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

L&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d&#39;un cancer Modèle Souris

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolement cellulaire et phénotypage des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial et de moelle osseuse de Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolement et culture de cellules endothéliales primaires de Artères Canine et Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...