כוכביות (*) מצביעות על צעדים חדשים או שונה בהשוואה לכריסטנסן et al. 1 1. התקנת חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך תרבית תאים דורש כמויות גדולות של ביצים מבודדות ממבוגרים הרה. לגדול ג elegans על 8P צלחות אגר זרע עם NA22 (זמין באמצעות ג elegans הגנטי Consortium - CGC) חיידקים לבודד כמויות גדולות של ביצים. בלוחות אלה הסכום של peptone משמש הוא 8 פעמים את הסכום שמשמש בדרך כלל לצלחות NGM. ריכוז peptone גבוה יותר מקיים את הצמיחה של חיידקים NA22 יעילות רב יותר, אשר בניגוד לOP50, לגדול בשכבות עבות. </li></ol> 8P צלחות מתכון: להמס 3 גרם NaCl, 20 גרם bacto-peptone, 25 אגר גרם ב1 ליטר של מים סטריליים מזוקקים וחיטוי ל30 דקות. בואו מגניב הבינוני על 55 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף מיליליטר סטרילי מסונן-1 של כולסטרול (5 מ&quot;ג / מיליליטר בEtOH), 1 מיליליטר של 1 MgCl 2, 1 מיליליטר של 4 MgSO ו25 מיליליטר של חיץ KP (המניה של 500 מיליליטר: 5 גרם K 2 HPO 4, 30 גרמו KH 2 PO 4, pH 6.00). יוצקים בינוני אגר נוזל לתוך 10 סנטימטר צלחות פטרי (25 מיליליטר / צלחת). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת להפיץ את פני השטח של כל צלחת אגר peptone מועשר השלם עם 1 מיליליטר של NA22 E. לילה בתרבית חיידק בתקשורת 2XYT (16 גרם Tryptone, תמצית שמרי 10 גרם, 5 גרם NaCl ב1 ליטר של מים סטריליים, pH 7.0) ב 37 ° C. חיידקים אלה מהווים מקור מזון בשפע שיהווה שכבה עבה התומכת בצמיחה של כמויות גדולות של מבוגרים הרה. השאר צלחות seeded לילה בטמפרטורת חדר, כדי לאפשר צמיחה של החיידקים. התהליך יכול להיות מואץ על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החיות מורעבות ל8P צלחות שנזרעו. שטוף חיות מצלחת NGM מורעבת באמצעות 5-6 מיליליטר של חיץ או מים M9 ולהוסיף 1-2 מיליליטר של השעיה זו לכל צלחת 8P. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צמיחה והכפלה של בעלי החיים האנטil הצלחות מאוכלסות במפגש על ידי מבוגרים הרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הביצים הנדרשות להכנת ג elegans תאים עובריים, ממבוגרים הרה להולדת באמצעות 5-6 מיליליטר של תמיסת תמוגה. </li></ol> מתכון פתרון תמוגה 5 מיליליטר של אקונומיקה טריות, 1.25 מיליליטר של 10 N NaOH ו18.5 מיליליטר של סטרילי H 2 O. תערובת זו חייבת להיות מוכנה טרי לפני כל שימוש. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת באמצעות חיץ ביצה: </li></ol> מתכון חיץ ביצה 118 mM NaCl, 48 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 25 HEPES מ&quot;מ, 7.3 pH, mOsm 340 אוסמולריות. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קליפת הביצה שמקיפה את הביצים על ידי טיפול עם chitinase. Chitinase הוא אנזים עם הפעילות הגבוהה ביותר ב-pH חומצי 25. ממיסים chitinase (Sigma, לקטלג לא. C6137) בpH חיץ הביצה 6.5 בריכוז סופי של 2 מ&quot;ג / מיליליטר. אחסן את מניית chitinaseפתרון ב -20 מעלות צלזיוס ב 1 מיליליטר aliquots בצינורות חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. ניתן לאחסן aliquots ב -20 ° C עד כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ג תאים בתרבית elegans על coverslips autoclaved (בקוטר מ&quot;מ 12) מכוסה בקטיני בוטנים. ממיסים קטיני בוטנים במים סטריליים (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר). פתרון לקטיני בוטנים לא צריכים להיות מסונן או autoclaved. זה גם לא צריך להיות מטופלים עם אור האולטרה סגול. חנות 2 aliquots מיליליטר ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני מלא תרבית תאים (500 מיליליטר) מכיל L-15 מדיום תרבות 500 מיליליטר מGibco, 50 מיליליטר בסרום שור עוברי (חום מומת), 7.7 סוכרוז גרם (mOsm 45), 5 מיליליטר של 100 U / ml פניצילין ושל 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (2%). הבינוני המלאה לאחר מכן מסונן באמצעות מסנן נקבובית 0.20 מיקרומטר. </li></ol> שים לב שיש לי חיץ הביצה ובינוני תרבות osmolarity של 340 ו345 mOsm בהתאמה. ואכן, בניגוד לתאי יונקים, ג יש תאי elegans osmolarity גבוה יחסיתשצריך להילקח בספירה בעת הכנת פתרונות שיבואו במגע ישיר עם קרום הפלזמה של התאים. המתכונים של חומרים כימיים אלה הותאמו להגיע osmolarity הרצוי, אשר נמדד באמצעות osmometer 1. אין זה הכרחי להשתמש osmometer אם המתכונים האלה אחריו בדיוק וטיפול משמש בהכנת חומרים כימיים אלה. עם זאת, יש להשתמש osmoter אם פתרונות אחרים צריכים להיות מוכנים, שמתכונים אינם מדווחים כאן או בכל אחד מהפרסומים המשתמשים בג elegans תאים בתרבית. 2. בידוד ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ להתחיל עם לפחות ארבעה 8P צלחות כדי לאסוף מספיק ביצים ל12 בארות של תאים בתרבית (ב24 גם צלחות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל עם ההליך להפשיר צינור אחד של פתרון מניות לקטינים בוטנים. הנח coverslips autoclaved בתחתית הבארות בצלחת 24 היטב ולהוסיף 200 μl של קטיני בוטנים לcoverslips. דגירה עבור שעה 1 או until התאים מוכנים להיות מצופה. להסיר לחלוטין את קטיני בוטנים ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מיליליטר של מים autoclaved סטרילי. הסרה מלאה של קטיני הבוטנים מcoverslips היא חיונית למניעת clumping תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המבוגרים הרה להולדת את הצלחות אגר באמצעות מים autoclaved סטרילי. אסוף את ההשעיה לשני צינור 50 מיליליטר חרוטי סטרילי. השאר את הצינורות על קרח לתקופה של עד 5 דקות, כדי לאפשר למשקעים של התולעים בחלק התחתון של הצינורות (*). הסר את המים עם טפטפת פלסטיק העברה ולהחליף אותו עם מים סטריליים autoclaved טריים. גלולה תולעים על ידי צנטריפוגה בטבלה העליונה ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) עבור 10 דקות (*). חזור על השלב אחרון זה לפחות 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התולעים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי וגלולתם ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) עבור 10 דקות (*). אל תשתמש במהירות גבוהה יותר צנטריפוגה כדי למנוע איסוף החיידקים בחלק התחתון של הצינור גם כן. לפעמים אחרי centrifugations התולעים אינם pelleted לחלוטין. After כל לשטוף ולפני הסרת supernatant, למקם את הצינורות במשך 5 דקות על קרח. במצונן תולעי מים לזרז לחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים ומוסיף 5-6 מיליליטר של תמיסת תמוגה (ראה חומר להגדיר). רוק ההשעיה בעדינות במשך דקות 5-10 ולאחר מכן להתחיל ניטור תמוגה תולעת תחת סטראו כל דקות 2-3. ירידה של השעיה ניתן גם להציב על coverslip לבדיקה קלה יותר. זמן הדגירה משתנה בהתאם לטריות של אקונומיקה; לקנות בקבוקים קטנים של אקונומיקה ולפתוח בקבוק חדש בכל חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ~ 70-80% מתולעים lysed (10 דקות מתחילת הדגירה), לעצור את תגובת תמוגה ידי הוספת 9 מיליליטר של pH חיץ הביצה 7.3 (ראה חומר להגדיר). צנטריפוגה ההשעיה ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) עבור 10 דקות. מכאן ואילך יש לי מבער בונזן ב, על הספסל כדי למנוע זיהום מחדש של הביצים (*) זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה העברה פלסטיק סטרילית ולשטוף את הכדור 3-4x עם חיץ ביצה עד הפתרון הוא ברור. הקפד לערבב היטב גלולה במאגר הביציות בכל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים מופרדות מפגרי בעלי החיים באמצעות 30% תמיסת סוכרוז. Resuspend את הכדור ב 2 מיליליטר של חיץ סטרילי ביצה ולהוסיף 2 מיליליטר של 60% תמיסת סוכרוז (המניה בחיץ סטרילי ביצה). מערבבים היטב וצנטריפוגות במשך 20 דקות ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) (*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את הצינורות מצנטריפוגות. הביצים צפות בחלק העליון של הפתרון. שימוש pipettor P1000 וטיפים סטריליים, להעביר את כל הביצים לתוך צינור חרוטי מיליליטר 15 סטרילי טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של חיץ סטרילי ביצה לצינור צנטריפוגות ב XG 200 (~ 1,200 סל&quot;ד) עבור 10 דקות. חזור על לשטוף 3 x. ודא הביצים resuspended לחלוטין בחיץ הביצה במהלך כל שטיפה. </li></ol> 3. דיסוציאציה תאים עוברי לנהל את השלבים הבאים של ההליך בתנאים סטריליים באמצעות זרימה למינרית. בעוד בעלי חייםשמלה על צלחות חיידקים, שטיפה והטיפול בפתרון תמוגה המכיל אקונומיקה צריכה לחסל את רוב אם לא כל החיידקים. וכך באמצעות ברדס למינרית בשלב זה של ההליך זה מונע זיהום חדש של ההשעיה הביצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ביצי pelleted ב 1 מיליליטר של 2 מ&quot;ג / מיליליטר chitinase (המניה בpH ביצת חיץ 6.5 (*)) ולהעביר אותם לצינור סטרילי חדש 15 מיליליטר חרוטי. רוק הצינור ל10-30 דקות בטמפרטורת חדר. זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לטריות של האנזים, ואת הטמפרטורה של החדר ולכן צריך להיות שנקבע לכל הכנה. מומלץ להתחיל מעקב הביצים תחת המיקרוסקופ תרבית תאים הפוך לאחר 10 דקות של דגירה. הערה: בניסיון שלנו, ה-pH הנמוך מגבירה את הפעילות האנזימטית chitinase. מסיבה זו אנו משתמשים חיץ ביצה בpH 6.5 לפזר chitinase (מתכון שדווח לעיל, שבו רמת חומציות מותאמת ל6.5 באמצעות NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ~ 80% מקליפות הביצים מתעכלים על ידיטיפול chitinase (איורים 1 AB), גלולה הביצים על ידי צנטריפוגה ב900 XG (~ 2,500 סל&quot;ד) במשך 3 דקות (*). שימוש pipettor P1000 וטיפים סטריליים, להסיר בזהירות את supernatant ולהוסיף 3 מיליליטר של L-15 בינוניים (*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הביצים לתוך צלחת בקוטר 6 סנטימטר ובעדינות לנתק את התאים באמצעות מזרק סטרילי 10 מיליליטר מצויד במחט G 18. לפקח על מידת הניתוק על ידי הצבת ירידה של השעיה לתוך צלחת פטרי פלסטיק טרי ועל ידי הצגה מתחת למיקרוסקופ. לא לשאוב אוויר לתוך המזרק במהלך הליך זה, כדי למנוע תאים מזיקים. המשך הניתוק עד ~ 80% מהתאים הם ניתקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה באמצעות 5 מסנן Millipore מיקרומטר סטרילי. השעיות תא חייבת להיות מסוננות כדי להסיר גושי תא, ביצים לא מעוכלות וזחלים בקעו. סנן 4-5 מיליליטר נוסף של L-15 תקשורת טריות דרך המסנן כדי לשחזר את כל התאים. אל תשתמשו בכוח מופרז במהלך שלב הסינון כדי למנוע damaging המסנן ו / או התאים. </li></ol> 4. Culturing תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ניתקו על ידי צנטריפוגה ב900 XG (~ 2,500 סל&quot;ד) במשך 3 דקות (*). שימוש pipettor P1000 וטיפים סטרילי להסיר בזהירות את כל supernatant. Resuspend תאי pelleted במדיום L-15 מלא וצלחת 1 מיליליטר / היטב. כמות בינונית הוסיף תלויה במספר 8P צלחות בשימוש, נקודת המפגש של התולעים על הצלחות, והסוג של ניסויים שיבוצעו בתאים. צפיפות התאים ניתן לקבוע באמצעות hemocytometer. עבור הקלטות תיקון מהדק ציפוי צפיפות של ~ 230,000 תאים / 2 סנטימטר הוא אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את צלחת 24 בארות במכל פלסטיק פלסטיק המכיל מגבות נייר רטובות, כדי למנוע אידוי של מדיום לתרבות. אחסן את המכל בחממה humidified על 20 מעלות צלזיוס, אוויר הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הם בדרך כלל מוכנים לניסויים בתוך 24 שעות כאשר הבידול ומפורש מורפולוגייםיון של סמני ה-GFP הושלם. יכולים להישמר תאים בתרבית עד 2 שבועות, אבל הם בדרך כלל בריאים ביותר עד 7-9 ימים לאחר ציפוי. הבינוני צריך להיות מוחלף פעם ביום כדי לשמור על תאים בריאים. </li></ol>

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לפענוח המסלולים הגנטיים מעורבים בפיתוח, התנהגות והזדקנות. הנוחות שלה נובעת בעיקר מההקלות שבה ניתן להשפיע מבחינה גנטית וממחזור החיים הקצר שלה. למרות הנוחות שלה, ג יש elegans מגבלותיו. ג תאי elegans הם זעירים ומוגבל ...

elegans Caenorhabditis (סי אלגנס) הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לחקירת הבסיסים המולקולריים של תפקוד תאי, התמיינות, והתנהגות. בעוד הגנום, חילוף החומרים ומסלולי biosynthetic דומים לבעלי חוליות &quot;, העקיבות הגנטיות והמולקולרית שלו הן הרבה יותר גדולות 2. בין יתרונותיה לגודלה ואנטומיה פשוטה, המחזור המהיר שלה חיים (3 ימים ב25 מעלות צלזיוס), תוחלת חיים קצרה (2 שבועות) ומספר רב של צאצאים (&gt; 200) הם. בשל אופי hermaphroditic ומחזור חיים קצר, מניפולציות מולקולריות וגנטיות הן פשוט בג elegans, הכולל את הדור של בעלי חיים מהונדסים 3,4 והיישום של טכניקות עקומות למטה גן כגון התערבות RNA 5. ג גוף elegans וקליפת ביצה הם שקופים. לכן ניתן דמיינו תאים בקלות בשני המבוגרים והעובר באמצעות מיקרוסקופ רגיל. ב40 השנים האחרונות, ג elegans </em&gt; הקהילה יצרה משאבים רב ערך עבור ג מחקר elegans כולל אוסף גדול של מוטציות, knockouts וtransgenics, תיאור מפורט של האנטומיה ופיתוח 6,7, כולל השחזור המלא של מערכת העצבים 8, ולחלוטין הגנום רצף אשר מבואר וזמין לכל הקהילה גם ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com).</a> למרות יתרונות הרבים, חלקם גישות ניסיוניות כבר מאתגרות בג elegans. אלה כוללים את אלה שדורשים נגישות לקרום הפלזמה של התאים והבידוד של רקמות או סוגי תאים. ואכן C. רקמות elegans מוגבלות בתוך השלד שלה בלחץ ההידרוסטטי, שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול או בדטרגנטים האנזימטית. בסופו של 1990 מרים גודמן וג&#39;נט ריצ&#39;מונד חלוץ שיטות עבור קלטות אלקטרו של ג elegansנוירונים ותאי שריר באתר 9,10. בעוד שיטות אלו נתנו לנו תובנות חשובות עצבי ותפקוד שרירים in vivo, הם מאתגרים ותפוקה נמוכה. שיטות אלטרנטיביים ללמוד את תפקוד תא in vivo שפותחו, בעיקר בעיקר בסידן ההדמיה vivo באמצעות חיישני סידן מקודד גנטי כגון GCamP וCameleon 11-13. שיטות אלה אף, אינן מאפשרים שימוש בכלים תרופתיים משום שהם חלים על בעלי חי חיים בשלמותה. הניסיון הראשון בג culturing תאי elegans במבחנה בקנה מידה גדולה נעשו על ידי לרד בלום במהלך תקופת ההכנה של עבודת הדוקטורט שלו 14. למרבה הצער, קשיים עם הידבקות לקויה של התאים למצע, התמיינות תאים עני והישרדות מנעו את הקמתו של הפרוטוקול בתחילת כשיטת תרבית תאים חזקה. בשנת 1995 אדגר ועמיתיו פרסמו נוהלכדי לחקור את חלוקת תא והמורפוגנזה ידי בידוד והתרבות של C אחד. elegans עוברי 15. תאים עובריים שהושגו על ידי עיכול של קליפות הביצים עם שילוב של טיפול אנזימטי וניתוק ידני, המשיכו להתרבות, לייצר עד ~ 500 תאים 15. בהמשך לכך, ליונג ועמיתים לעבודה בתרבית מספר קטן של לסטומרים ללמוד המורפוגנזה מעיים. הם הראו כי במבחנה blastomere E המבודדת אחד המיוצר בתאי מעיים מקוטבים שיצרו מבנה מקביל ללומן מעיים על ידי אינטראקציה אחד עם השני דרך צמתים adherens פסגת 16. Buechner ועמיתיו גם דיווחו בשיטה דומה לC culturing. elegans תאים עובריים במבחנה 17. בהתבסס על עבודה מוקדמת זו, כריסטנסן ועמיתיו פיתחו פרוטוקול חזק עבור culturing C העוברי. elegans תאים במבחנה 1. הםהראה כי C המבודד. elegans תאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים ולשמור על התכונות שיש להם in vivo, כולל הביטוי של סמנים ספציפיים בתא. כמה טכניקות שמאתגרות in vivo, יכולות להיות מיושמות על ג המבודד elegans תאים עובריים. אלה כוללים 1,18 19 אלקטרו, הדמיה וטכניקות immunochemical 20,21, כמו גם בידוד של סוגי תאים ספציפיים על ידי Cell-Activated פלורסנט מיון (FACS) לבניית ספריות cDNA תא ספציפי 22,23. ניתן ליישם טכניקות ג&#39;ין מציאה כגון התערבות RNA (RNAi) בג בתרבית elegans תאי 1 ושיטת תיוג מטבולי רומן באמצעות Azido סוכר ככלי לגילוי גליקופרוטאין פותחו לאחרונה במבחנת ג בתרבית תאי elegans 24. לסיכום, שיטת תרבית תאים מרחיבה את מערך oטכניקות ו שיכול להיות מיושמות על ג דגם elegans במאמץ לפענח את תפקוד גן בהקשר של האורגניזם חי. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול לculturing ג elegans תאים עובריים במבחנה, המבוססת במידה רבה על הפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי כריסטיאנסן ו1 עמיתים לעבודה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

סי אלגנס הוא מערכת מודל רבת עוצמה, שבו טכניקות גנטיות ומולקולריים הן ישימות בקלות. עד לאחרונה אם כי, טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים ובידוד של תאים מסוגים מסוימים, לא יכולים להיות מיושמות בג elegans. מגבלה זו הייתה בשל העובדה שרקמות מוגבלות בתוך ציפורן בלחץ שאינו מתעכל בקלות על ידי טיפול עם אנזימים ו / או חומרי ניקוי. בהתבסס על עבודה חלוצה מוקדם על ידי לרד בלום, כריסטנסן ועמיתים 1 פיתח שיטה חזקה לculturing ג elegans תאים עובריים בקנה מידה גדולה. ביצים מבודדות ממבוגרים הרה להולדת על ידי טיפול עם אקונומיקה / NaOH ולאחר מכן טופלו בchitinase כדי להסיר את קליפות הביצים. לאחר מכן תאים עובריים הם ניתקו על ידי pipetting הידני ומצופים על זכוכית מכוסה מצע בתקשורת מועשר בסרום. בתוך 24 שעות של תאי בידוד מתחיל להבחין על ידי שינוי מורפולוגיה ועל ידי הבעת marke תאים הספציפיrs. ג elegans תאים בתרבית בשיטה זו לשרוד עד 2 שבועות במבחנה והיה בשימוש במשך אלקטרו, immunochemical, והדמיה מנתח, כמו גם שהם כבר מסודרים ומשמשים לאפיון microarray.

C. elegans תאים בתרבית להבדיל ותא מפורש סמנים ספציפיים כריסטנסן ועמיתים באמצעות מכתים trypan הכחול הוכיחו כי&gt; 99% ג העוברי תאי elegans לשרוד את הליך הבידוד. ביום 9 ו22 לאחר ציפוי, 85% ו65% בהתאמה עדיין בחיים 1. ג העוברי המב?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.5K Views.  University of Miami.  אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או ב...

Video: A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

שיטה לCulturing עוברי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video