Christensen ve diğerleri ile karşılaştırıldığında, Yıldız (*), yeni ya da değiştirilmiş adımlarını gösterir. 1 1.. Malzeme Kur <ol><li> Hücre kültürü prosedür gebe yetişkin izole edilmiş yumurtaların büyük miktarda gerektirir. C&#39;yi büyüyecek yumurtaların büyük miktarda izole etmek için bakteriler - elegans 8P agar plakaları üzerinde NA22 (CGC C. elegans Genetik Consortium kullanılabilir) ile ekildi. Bu plakalar kullanılmıştır pepton miktarı normal olarak NGM plakalar için kullanılan 8 kez miktardır. Daha yüksek pepton konsantrasyonu OP50-, kalın tabakalar halinde büyümeye ki aksine, daha verimli NA22 bakterilerin gelişimini devam ettirir. </li></ol> 8P plakaları tarifi: 3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 30 dakika süre ile, steril damıtılmış su ve otoklav içinde 1 L 25 g agar çözülür. 55 ° C&#39;de orta serin ve daha sonra 1 ml 1 MgCl2 kolesterol steril olarak filtreden geçirilmiş, 1 ml EtOH (5 mg / ml), ekleme, MgSO 4 ile 1 ml KP tamponu (500 ml stok: 5 g 2 K HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6.00) 25 ml. 10 cm Petri kutularına (25 ml / plaka) sıvı agar ortam dökün. <ol start="2"><li> Ertesi gün NA22 E: 1 ml her bir zenginleştirilmiş pepton agar levhasının tüm yüzeyi yayılmış 2XYT ortamı (16 g tripton, 10 g maya ekstresi, steril su, pH 7.0, 1 L NaCl 5 g) 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca kültürlendi coli Bu bakteriler gravid yetişkinlerin büyük miktarlarda büyümeyi destekleyen kalın bir tabaka oluşturacak bol bir besin kaynağı oluşturmaktadır. Bakterilerin büyümesine izin vermek üzere gece boyunca oda sıcaklığında tohumlanmış plakaları bırakın. Bu süreç, 4-5 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilerek hızlandırılabilir. </li><li> Numaralı seribaşı 8P plakalarına hasret hayvanları aktarın. 5-6 M9 tampon veya ml su kullanılarak bir hasret NGM plaka hayvanları yıkayın ve her 8P plaka bu süspansiyonun 1-2 ml ekleyin. </li><li> Hayvanların büyüme ve çarpma unt izinil plakaları gebe yetişkinler tarafından izdiham doldurulur. </li><li> C. hazırlanması için gerekli olan yumurta izole lizis çözeltisi 5-6 ml kullanarak gebe yetişkinlerden embriyonik hücreler, elegans. </li></ol> Lysis çözelti tarifi Taze Bleach 5 mi, 10 N NaOH ve 1.25 ml steril H2O 18.5 mi Bu karışım, her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. <ol start="6"><li> Yumurta tampon kullanarak gebe yetişkinlerden izole yumurta yıkayın: </li></ol> Yumurta tampon tarifi 118 mM NaCl, 48 mM KCI, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7.3, 340 mOsm ozmolarite. <ol start="7"><li> Çitinaz ile muamele edilerek yumurta çevreleyen yumurtaların çıkarın. Kitinaz asidik pH 25 ile en yüksek aktiviteye sahip bir enzimdir. 2 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda yumurta tamponu pH 6.5 içinde kitin (Sigma, katalog no. C6137) içinde çözülür. Şitinaz stok saklamaksteril 15 ml konik tüplerde 1 ml alikotlar içinde -20 ° C&#39;de çözelti. Bu süspansiyonun tam bölenleri bir kaç ay için -20 ° C de muhafaza edilebilir. </li><li> C&#39;yi büyüyecek fıstık lektinle kaplı otoklavlanmıştır lamelleri (12 mm çap) üzerinde elegans kültür hücreleri. Steril su (0.5 mg / ml) içinde fıstık lektin çözülür. Fıstık lektin çözelti filtre otoklave olmamalıdır. Ayrıca, UV ışığı ile muamele edilmesi gerekmez. 6 aya kadar -20 ° C&#39;de saklayın 2 ml lik bir kısmı. </li><li> Tam hücre kültür ortamı (500 mi) Gibco, 50 ml cenin sığır serumu (ısı ile deaktive edilmiş), 7.7 g sükroz (45 mOsm), 100 U / ml penisilin ve 100 ug, 5 ml / 500 ml L-15 kültür ortam içeren ml Streptomisin (% 2). Tam ortam daha sonra bir 0.20 mikron gözenek filtresi kullanılarak filtre edilir. </li></ol> Yumurta tampon ve kültür ortamı, sırasıyla 340 ve 345 mOsm osmolaritesini sahip olduğunu unutmayın. Gerçekten de, memeli hücrelerinin aksine, C. elegans hücrelerin nispeten yüksek ozmotik basıncı vardırbu hücrelerin plazma membran ile doğrudan temas edecek çözümler hazırlanırken saymak içine alınması gerekir. Bu reaktiflerin tarifleri bir osmometre 1 kullanılarak ölçülmüştür istenen ozmolarite ulaşmak için ayarlanmıştır. Bu tarifleri tam olarak takip edilmektedir ve bakım Bu reaktif maddelerin hazırlanmasında kullanıldığında bir osmometre kullanmak gerekli değildir. Diğer çözümler, yemek tarifleri burada rapor edilmez veya C&#39;yi kullanmak yayınların herhangi hazırlanmış olması, gerekiyorsa Ancak, tek bir osmoter kullanmalısınız kültür hücreleri elegans. 2. Yumurta İzolasyon <ol><li> Bu (24 oyuklu plakalar içerisinde) kültürlenmiş hücrelerin 12 kuyu için yeterli yumurta toplamak için en az dört 8P plakaları ile başlamak için tavsiye edilir. </li><li> Prosedüre başlamadan önce fıstık lektin stok solüsyonu bir tüpü eritin. Bir 24-çukurlu plaka içindeki kuyuların altındaki otoklav lamelleri yerleştirin ve lamelleri fıstık lektin 200 ul ekle. 1 saat ya da u inkübentil hücreler kaplama hazırdır. Tamamen fıstık lektin çıkarın ve steril otoklavlanmış 1 ml su ile bir kez kuyu yıkayın. Lamelleri fıstık lektininin tam çıkarılması hücre topaklanma kaçınmak için gereklidir. </li><li> Steril otoklava su kullanarak agar plakaları kapalı gebe yetişkin yıkayın. İki steril konik 50 ml tüp içine süspansiyon toplayın. Tüplerin (*) altındaki solucanlar çökelmesine izin verecek şekilde 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın. Bir transfer plastik bir pipet ile su çıkarmak ve taze steril otoklavlanmıştır su ile değiştirin. 200 xg 10 dakika boyunca (~ 1.200 rpm) (*) masa üstü santrifüj ile solucanlar Pelet. En az 3, bu son adımı tekrarlayın. </li><li> Bir steril 15 ml konik bir tüp içine transfer solucanlar ve 200 x g&#39;de 10 dakika boyunca (~ 1,200 rpm) (*) onları pelet. Hem tüpün altındaki bakteri toplama önlemek için daha yüksek bir hız santrifüj kullanmayın. Bazen santrifüj işlemi sonrasında tamamen solucanlar topak değildir. After Her bir yıkama ve temizleme önce yüzer madde, buz üzerinde 5 dakika boyunca tüpleri. Soğutulmuş su solucanlar tüpün dibine çökme olmamıştır. </li><li> Su çıkarmak ve parçalama çözüm 5-6 ml ekleyin (Malzeme kurmak bakınız). 5-10 dakika boyunca yavaşça süspansiyon kaya ve daha sonra her 2-3 dk stereomicroscope altında solucan lisizine izleme başlar. Süspansiyonun bir damla daha kolay kontrolü için bir lamel üzerine yerleştirilebilir. Kuluçka süresi ağartıcının tazelik bağlı olarak değişir; ağartıcının küçük şişe satın almak ve her ay yeni bir şişe açın. </li><li> ~% 70-80 oranında solucan (İnkübasyonun başından itibaren 10 dakika) lize ne olursa olsun (Malzeme ayarlamak için bkz) yumurta tamponu, pH 7.3 içinde 9 ml eklenerek parçalama reaksiyonu durdurun. 10 dakika boyunca 200 x g&#39;de (1200 rpm ~) de süspansiyonu santrifüj. Yumurta (*) yeniden kirlenmesini önlemek için bankta bir Bunsen beki var Bu noktadan itibaren. </li><li> Dikkatlice steril plastik transfer pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve pelet 3-4 yıkayınçözüm açıktır x yumurta tamponu ile kadar. Her bir yıkama sırasında yumurta tamponunda pelet iyice karıştırın emin olun. </li><li> Yumurta% 30 sukroz çözeltisi kullanılarak Hayvan karkaslarının ayrılır. Steril yumurta tampon, 2 ml pelet yeniden süspanse edin ve 2 ml% 60 sukroz çözeltisi (steril yumurta tamponunda stoku) ekleyin. İyice karıştırın ve 200 x g (~ 1200 rpm) (*) 20 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Dikkatlice santrifüj tüpleri çıkarın. Yumurtalar çözeltisinin üstünde yüzen. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, yeni bir steril 15 ml konik tüp içine tüm yumurta transferi. </li><li> 10 dakika boyunca 200 x g (~ 1200 rpm) ve santrifüj tüpüne steril yumurta tampon 10 ml ilave edilir. Yıkandıkları 3 x tekrarlayın. Yumurtalar Tamamen her yıkama sırasında yumurta tampon içinde tekrar süspanse edilir emin olun. </li></ol> 3. Embriyonik hücreler Ayrılma Laminer akış kapağı steril şartlar altında Prosedürün sonraki adımlar Davranış. Hayvanlar datüm bakteri değilse en ortadan kaldırmak gerekir bakteri plakalarının, yıkama ve ağartma maddesi içeren lizis çözeltisi ile muamele elbise. Bu durumda, prosedür, bu noktada, bir laminar bir başlık kullanılarak yumurta süspansiyonu yeni bir kirlenmesini önler. <ol><li> 2 mg / ml kitinaz (yumurta tamponu pH 6.5 (*) stok), 1 ml topak haline yumurta yeniden süspanse edin ve yeni bir steril 15 ml konik tüp aktarın. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca tüp sallayın. Kesin inkübasyon süresi, enzimin ve oda sıcaklığının tazelik göre değişen ve bu nedenle her hazırlanması için belirlenmelidir. Bu inkübasyon 10 dakika sonra, ters çevrilmiş bir hücre kültürü mikroskop altında yumurta izlemeye başlamak için tavsiye edilir. Not: bizim deneyim, düşük pH şitinaz enzimatik aktivitesini arttırır. Bu nedenle, biz kitinaz (pH NaOH ile 6.5 &#39;e ayarlanır yukarıda belirtilen tarifi) eritmek için pH 6.5&#39; de yumurta tampon kullanın. </li><li> ~ Yumurtalarında% 80&#39;i tarafından sindirilir zamankitinaz tedavisi (Şekil 1 AB), 900 x g&#39;de 3 dakika boyunca (~ 2,500 rpm) (*) santrifüjleme ile yumurta pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, dikkatlice süpernatant kaldırmak ve L-15 orta 3 ml (*) ekleyin. </li><li> 6 cm çaplı plaka içine yumurta aktarın ve yavaşça bir 18 G iğne ile donatılmış bir 10 ml&#39;lik steril bir şırınga kullanılarak hücreleri ayırmak. Yeni bir plastik Petri kabı içine bir süspansiyon damla yerleştirerek ve mikroskop altında görüntüleyerek ayrışma derecesini izlemek. Zarar hücreleri önlemek için bu işlem sırasında enjektör içine hava aspire etmeyin. Hücrelerin% 80 ayrışmış olan ~ kadar ayrışma devam edin. </li><li> Steril 5 um Millipore filtresi kullanılarak süspansiyon filtre. Hücre süspansiyonları, hücre kümeleri, sindirilmemiş yumurta ve larvalarına yumurtadan çıkarmak için filtre edilmelidir. Tüm hücreleri kurtarmak için filtre boyunca taze L-15 ortamı ilave 4-5 ml filtre. Dekar önlemek için filtrasyon aşaması sırasında aşırı güç kullanmayınfiltresi ve / veya hücreleri maging. </li></ol> 4. Hücre Kültürleme <ol><li> 3 dakika boyunca (*) için 900 x g (~ 2,500 rpm) santrifüjleme ile ayrışmış hücreleri Pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak dikkatlice süpernatant kaldırmak. Tüm L-15, orta ve plakanın 1 ml / oyuk olarak pelet hücreleri yeniden süspanse edin. Ilave ortamın miktarı, kullanılan 8P plakaların sayısı, plakalar üzerinde solucanların birleştiği ve hücreler üzerinde yapılacak deneyler türüne bağlıdır. Hücre yoğunluğu bir hemositometre kullanılarak belirlenebilir. ~ 230.000 hücre / cm 2 optimal yoğunluk kaplama yama-kelepçe kayıtları için. </li><li> Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için ıslak kağıt havlu içeren plastik bir kap içinde Tupperware 24 kuyu plakası tutun. 20 ° C ve çevre havası ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde kabı saklayın. </li><li> Hücreler genellikle 24 saat içinde deneyler için hazır olduğunda morfolojik ayrım ve ekspresGFP belirteçlerin iyon tamamlandı. Hücreler kadar 2 hafta boyunca kültür içinde tutulur, fakat bunlar genellikle kaplama sonrası 7-9 gün kadar en sağlıklı. Ortam, sağlıklı hücreleri korumak için günde bir değiştirilmesi gerekir. </li></ol>

C. elegans gelişim, davranış ve yaşlanma ile ilgili genetik yollar deşifre için güçlü bir model organizmadır. Onun rahatlığı öncelikle genetik manipüle edilebilme kolaylığından ve kısa yaşam döngüsü kaynaklanıyor. Onun kolaylık rağmen, C. elegans sınırlamaları vardır. C elegans hücreler son derece küçük ve bu mikro-dizi analizi ile gen ekspresyon profili olarak, doğrudan bu tür elektrofizyolojik ve farmakolojik teknikleri gibi hücrelere erişim, veya özel ...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) hücresel fonksiyonun, farklılaşma ve davranış moleküler temellerini araştıran güçlü bir model organizmadır. Genom, metabolik ve biyosentetik yollar omurgalılar &#39;benzer olmakla birlikte, genetik ve moleküler tractability 2 çok daha fazladır. Avantajları arasında, onun büyüklüğü ve basit anatomi, onun hızlı yaşam döngüsü (25 ° C&#39;de 3 gün), kısa ömürlü (2 hafta) ve yavrular çok sayıda (&gt; 200) vardır. Nedeniyle hermaphroditic doğası ve kısa yaşam döngüsü, moleküler ve genetik manipülasyonlar C. basittir transgenik hayvanlarda 3,4 ve bu RNA girişim 5 gibi gen knock-down tekniklerin uygulanması da dahil olacak elegans. C. elegans vücut ve yumurta kabuğu şeffaf. Bu nedenle hücreleri kolayca yetişkin ve standart mikroskopi kullanılarak embriyo hem de görülebilir. Son 40 yıl içinde, C. elegans </em&gt; topluluk C için çok değerli bir kaynak yarattı mutantlar, tırnakları ve transgeniklerinin geniş bir koleksiyon, sinir sistemi 8 tam yeniden yapılanma dahil anatomi ve geliştirme 6,7 ayrıntılı bir açıklama, ve de açıklamalı ve bütün topluma mevcuttur tamamen sıralı genom (dahil elegans araştırma <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Sayısız avantajlara rağmen, bazı deneysel yaklaşımlar C. zorlu olmuştur elegans. Bu dokular ya da hücre tiplerinin hücre ve tecrit plazma zarına erişim gerektiren olanları içerir. Gerçekten C. elegans dokular kolayca enzimatik muamele ya da deterjanların tarafından sindirilir değil onun basınçlı hidrostatik iskelet, içinde hapsedilir. 1990&#39;ların sonunda Miriam Goodman ve Janet Richmond C elektrofizyolojik kayıtlar için yöntemler öncülük elegansin situ 9,10 nöronlar ve kas hücreleri. Bu yöntemler bize nöronal ve in vivo kas fonksiyonu önemli bilgiler verirken, onlar zor ve düşük verim vardır. In vivo olarak, hücre fonksiyonlarını incelemek için alternatif yöntemler çoğunlukla, özellikle bu tür GCamP ve cameleon 11-13 genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörler kullanılarak kalsiyum vivo görüntüleme, geliştirilmiştir. Onlar bozulmadan yaşayan hayvanlar üzerinde uygulanır çünkü bu olsa yöntemleri, farmakolojik araçların kullanımına izin vermez. Kültür C&#39;de ilk girişimi Büyük ölçekli in vitro hücre elegans doktora tezi 14 hazırlanmasında Laird Bloom tarafından yapıldı. Ne yazık ki, zorluklar substrata hücrelerin zayıf yapışması ile karşılaşılan, zayıf hücre farklılaşması ve hayatta kalma güçlü bir hücre kültür yöntemi olarak bu erken protokol kurulmasını engelledi. 1995 yılında Edgar ve arkadaşları bir prosedür yayınladıTek bir C izolasyonu ve kültürü ile hücre bölünmesini ve morfogenetiğine araştırmak. elegans 15 embriyolar. Tedavisi ve enzimatik ayrışma manuel bir kombinasyonu ile yumurta kabuğu sindirilmesi ile elde edilen embriyonik hücreler, ~ 500 hücre 15 kadar üreten, çoğalmaya devam etti. Daha sonra, Leung ve arkadaşları bağırsak morfogenetiğine çalışma blastomerlerin küçük bir sayıda kültüre. Bunlar, bir in vitro izole edilmiş E blastomere apikal adherens birleşme 16 üzerinden birbirleri ile etkileşerek intestinal lümene benzer bir yapı oluşturulur polarize bağırsak hücreleri tarafından üretilebilir olduğunu gösterdi. Buechner ve arkadaşları, kültürleme C için benzer bir yöntem rapor etmiştir. 17, in vitro olarak embriyonik hücreleri elegans. Bu erken çalışmalara dayanarak, Christensen ve arkadaşları embriyonik C kültürleme için sağlam bir protokol geliştirmiştir. elegans vitro 1 hücreler. Onlarbu izole edilmiş C göstermiştir. elegans hücreler, çeşitli hücre tipleri farklılaşmak ve hücreye özel markörlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, in vivo olarak sahip olduğu özellikleri muhafaza edebilir. In vivo olarak zor olan çeşitli teknikler, izole edilmiş C uygulanabilir embriyonik hücreleri elegans. Bu elektrofizyolojik 1,18 19, görüntü işleme ve immünokimyasal teknikleri 20,21, hem de hücreye özgü cDNA kütüphanelerinin 22,23 inşası için (FACS) floresan aktive hücre spesifik hücre tipleri izolasyonunu içerir. Bu tür RNA girişim (RNAi) olarak Gene demonte teknikleri kültürlenmiş C uygulanabilir elegans hücreler 1 ve glikoprotein keşfi için bir araç olarak Azido-şeker kullanarak yeni bir metabolik etiketleme yöntemi, son zamanlarda in vitro kültürlenmiştir C için geliştirilmiştir elegans hücreleri, 24. Sonuç olarak, hücre kültürü yöntemi dizi o genişletirC. uygulanabilir f teknikleri Bir canlı organizmanın bağlamında gen fonksiyonunu çözmek için bir çaba elegans modeli. Biz C kültürleme için buraya protokolü açıklamak büyük ölçüde birinci Christiansen ve arkadaşları 1 tarafından tarif edilen protokole göre in vitro olduğu, embriyonik hücreler elegans.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans genetik ve moleküler teknikler kolay uygulanabilir olduğu güçlü bir model sistem vardır. Yakın zamana kadar olsa da, hücreler ve özel hücre tiplerinin izolasyonu doğrudan erişim gerektiren teknikleri, C de uygulanamadı elegans. Bu sınırlama, dokuların kolayca enzimler ve / veya deterjan ile muamele ile sindirilmeyen bir basınçlı kütikül içinde sınırlı olmasından kaynaklanıyordu. Laird Bloom, Christensen ve 1 C kültürleme için sağlam bir yöntem geliştirdi meslektaşları tarafından erken öncü çalışmalara dayanarak Büyük ölçekli embriyonik hücreleri elegans. Yumurta ağartıcı / NaOH ile işlenerek gebe yetişkin izole edilmiş ve daha sonra da yumurta kabuğu kaldırmak için çitinaz ile tedavi edilir. Embriyonik hücreler daha sonra el ile pipetleme ayrılmış ve serum zenginleştirilmiş ortam içinde alt-tabaka kaplı cam üzerine kaplanmıştır. Izolasyon hücrelerin 24 saat içinde morfolojisi değiştirerek ve hücre spesifik marke ifade ederek ayırt başlarrs. C. elegans, bu yöntem kullanılarak kültür hücreleri, in vitro olarak 2 hafta kadar hayatta kalma ve elektrofizyolojik, immünokimyasal için kullanılmıştır ve bu kriteri ve mikroarray kullanılmaktadır gibi görüntüleme de analiz eder.

C. kültür hücreleri spesifik belirteçler farklılaştırmak ve ekspres hücre elegans Christensen ve tripan mavi lekelemesi kullanılarak arkadaşları göstermiştir ki, embriyonik C&gt;% 99 elegans hücreler izolasyon prosedürü hayatta. 9 gün sonra kaplama ve 22, sırasıyla% 85 ve% 65, hala 1. hayatta. İzole embriyonik C. elegans hücreleri ayırt etmek için bir alt-tabaka için uygun olmalıdır. Form kümeleri uymadığı ve ...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Biz embriyonik C. büyük ölçekli kültür için burada bir revize protokol açıklar hücreleri elegans. Embriyonik C. elegans Bu yöntemi kullanarak, in vitro olarak kültürlenmiş hücreler, bir hücre özel bir şekilde genlerin ekspresyonunu ayırt ve özetlemek için görünür. Doğrudan hücrelere erişimi ya da diğer dokulardan özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektiren C teknikleri uygulanabilir kültür hücreleri elegans.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.4K Görüntüleme.  University of Miami.  Biz embriyonik C. büyük ölçekli kültür için burada bir revize protokol açıklar hücreleri elegans. Embriyonik C. elegans Bu yöntemi kullanarak, in vitro olarak kültürlenmiş hücreler, bir hücre özel bir şekilde genlerin ekspresyonunu ayırt ve özetlemek için görünür. Doğrudan hücrelere erişimi ya da diğer dokulardan özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektiren C teknikleri uygulanabilir kültür hücr...

Video: A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...