Les astérisques (*) indiquent des étapes nouvelles ou modifiées par rapport à Christensen et al. Une Une. Matériel d&#39;installation <ol><li> Le mode opératoire de culture cellulaire nécessite de grandes quantités d&#39;oeufs isolés des adultes gravides. Cultivez C. elegans sur 8P plaques de gélose ensemencée avec NA22 (disponible sur le C. elegans Consortium génétique - CGC) des bactéries à isoler de grandes quantités d&#39;œufs. Dans ces plaques la quantité de peptone utilisée est 8 fois le montant qui est normalement utilisé pour les plaques NGM. La concentration de peptone supérieur soutient la croissance des bactéries NA22 plus efficace, qui, contrairement à OP50, grandir en couches épaisses. </li></ol> 8P plaques recette: Dissoudre 3 g de NaCl, 20 g de Bacto-peptone, 25 g d&#39;agar dans 1 litre d&#39;eau distillée stérile et autoclave pendant 30 min. Laisser refroidir le milieu à 55 ° C puis ajouter stérile filtrés 1 ml de cholestérol (5 mg / ml dans de l&#39;éthanol), 1 ml de 1 MgCl2, 1 ml de MgSO 4 et 25 ml de tampon KP (stock de 500 ml: 5 g de K 2 HPO 4, 30 g de KH 2 PO 4, pH 6,00). Verser le milieu de gélose de liquide dans des boîtes de Pétri de 10 cm (25 ml / plaque). <ol start="2"><li> Le jour suivant, réparties sur toute la surface de chaque plaque de gélose peptone enrichi avec 1 ml de NA22 E. coli cultivées pendant une nuit dans un milieu YT 2x (16 g de tryptone, 10 g d&#39;extrait de levure, 5 g de NaCl dans 1 litre d&#39;eau stérile, pH 7,0) à 37 ° C. Ces bactéries constituent une source de nourriture abondante qui formera une couche épaisse de soutenir la croissance de grandes quantités d&#39;adultes gravides. Laisser plaques ensemencées pendant une nuit à température ambiante pour permettre la croissance de la bactérie. Le procédé peut être accélérée par incubation à 37 ° C pendant 4-5 h. </li><li> Transfert animaux affamés à ensemencées 8P plaques. Lavez les animaux dans une assiette NGM affamés utilisant 5-6 ml de tampon M9 ou de l&#39;eau et ajouter 1-2 ml de cette suspension à chaque plaque 8P. </li><li> Permettre la croissance et la multiplication des animaux untIL les plaques sont remplis au confluent des adultes gravides. </li><li> Isoler les œufs nécessaires à la préparation de C. elegans, à partir de cellules embryonnaires adultes gravides à l&#39;aide de 5-6 ml de solution de lyse. </li></ol> solution de lyse recette 5 ml d&#39;eau de Javel, frais de 1,25 ml de NaOH 10 N et 18,5 ml de H 2 O. stérile Ce mélange doit être préparée avant chaque utilisation. <ol start="6"><li> Lavez les oeufs isolés des adultes gravides en utilisant un tampon d&#39;oeuf: </li></ol> recette de tampon Egg 118 mM de NaCl, 48 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolarité de 340 mOsm. <ol start="7"><li> Retirer la coquille qui entoure les œufs par traitement avec chitinase. Chitinase est une enzyme avec une activité plus élevée à pH acide 25. Dissoudre chitinase (Sigma, catalogue no. C6137) dans le tampon pH 6,5 oeuf à une concentration finale de 2 mg / ml. Rangez la chitinase actionssolution à -20 ° C en aliquotes de 1 ml dans des tubes coniques de 15 ml stériles. Des aliquotes peuvent être stockées à -20 ° C jusqu&#39;à quelques mois. </li><li> Cultivez C. elegans cellules cultivées sur des lamelles couvre-autoclavées (diamètre 12 mm) recouverte d&#39;arachide lectine. Dissoudre la lectine d&#39;arachide dans de l&#39;eau stérile (0,5 mg / ml). solution de lectine d&#39;arachide ne doit pas être filtré ou autoclave. Il ne nécessite aussi être traités avec de la lumière UV. Magasin aliquotes de 2 ml à -20 ° C pour un maximum de 6 mois. </li><li> Complete milieu de culture de cellules (500 ml) contient 500 ml de milieu L-15 de culture à partir de Gibco, à 50 ml de sérum bovin fœtal (inactivé par la chaleur), 7,7 g de saccharose (45 mOsm), 5 ml de 100 U / ml de pénicilline et de 100 pg / ml de streptomycine (2%). Le milieu complet est ensuite filtré en utilisant un filtre à pores de 0,20 um. </li></ol> On notera que la mémoire tampon d&#39;oeuf et le milieu de culture ont une osmolarité de 340 mOsm et 345 respectivement. En effet, contrairement aux cellules de mammifères, C. cellules elegans ont un niveau relativement élevé osmolaritéqui doit être pris en compte lors de la préparation des solutions qui vont venir en contact direct avec la membrane plasmique des cellules. Les recettes de ces réactifs ont été ajustés pour atteindre l&#39;osmolarité souhaitée, qui a été mesurée à l&#39;aide d&#39;un osmomètre 1. Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;utiliser un osmomètre si ces recettes sont suivies à la lettre et les soins sont utilisés dans la préparation de ces réactifs. Cependant, il faut utiliser un Osmoter si d&#39;autres solutions doivent être préparés, dont les recettes ne sont pas signalés ici ou dans l&#39;une des publications qui utilisent C. elegans cellules cultivées. 2. Isolation des oeufs <ol><li> Il est recommandé de commencer avec au moins quatre 8P plaques de recueillir suffisamment d&#39;œufs pour 12 puits de cellules cultivées (dans des plaques à 24 puits). </li><li> Avant de commencer la procédure décongeler un tube de solution arachide lectine du stock. Placer les lamelles autoclave au fond des puits dans une plaque à 24 puits et ajouter 200 ul de la lectine d&#39;arachide pour les lamelles. Incuber pendant 1 heure ou uusqu&#39;à les cellules sont prêtes à être plaqué. Supprimer complètement la lectine d&#39;arachide et laver les puits une fois avec 1 ml d&#39;eau stérile autoclave. L&#39;élimination complète de la lectine d&#39;arachide à partir des lamelles couvre-objet est essentielle pour éviter l&#39;agglutination des cellules. </li><li> Laver les adultes gravides hors les plaques d&#39;agar avec de l&#39;eau stérile à l&#39;autoclave. Recueillir la suspension en deux tube conique stérile de 50 ml. Laisser les tubes sur de la glace pendant jusqu&#39;à 5 minutes pour permettre la précipitation des vers à la partie inférieure des tubes (*). Retirer l&#39;eau avec une pipette de transfert en plastique et la remplacer avec de l&#39;eau stérile frais autoclave. Pellet vers par table centrifugation à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min (*). Répétez cette dernière étape au moins 3. </li><li> Transfert vers dans un tube de 15 ml conique stérile et un culot eux à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min (*). Ne pas utiliser de plus grande vitesse de centrifugation pour éviter de recueillir des bactéries au fond du tube aussi bien. Parfois, après centrifugations les vers ne sont pas complètement culot. After chaque lavage et avant le retrait du surnageant, placer les tubes pendant 5 min sur la glace. Dans les vers de l&#39;eau glacée pour précipiter le fond du tube. </li><li> Retirer l&#39;eau et ajouter 5-6 ml de solution de lyse (voir Matériel mis en place). Basculez la suspension doucement pendant 5-10 minutes et ensuite commencer à surveiller ver lyse au microscope stéréoscopique chaque 2-3 min. Une goutte de suspension peut aussi être placée sur une lamelle couvre-objet pour faciliter l&#39;inspection. Le temps d&#39;incubation varie en fonction de la fraîcheur de l&#39;eau de Javel; acheter de petites bouteilles d&#39;eau de Javel et d&#39;ouvrir une nouvelle bouteille chaque mois. </li><li> Lorsque ~ 70-80% de vers sont lysées (10 min à partir du début de l&#39;incubation), arrêter la réaction de lyse en ajoutant 9 ml d&#39;oeuf tampon pH 7,3 (voir Matériel mis en place). Centrifuger la suspension à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min. De ce point sur un bec Bunsen sur, sur le banc pour éviter la recontamination des oeufs (*). </li><li> Retirez délicatement le surnageant à l&#39;aide d&#39;un transfert en plastique pipette stérile et laver le culot 3-4x avec un tampon d&#39;oeuf jusqu&#39;à ce que la solution est claire. Assurez-vous de mélanger le bien de granulés dans la mémoire tampon de l&#39;œuf au cours de chaque cycle de lavage. </li><li> Les oeufs sont séparés des carcasses d&#39;animaux en utilisant une solution de saccharose à 30%. Remettre en suspension le culot dans 2 ml de tampon d&#39;oeuf stérile et ajouter une solution de saccharose à 2 ml de 60% (dans du tampon de magasin d&#39;oeuf stérile). Bien mélanger et centrifuger pendant 20 min à 200 xg (~ 1200 rpm) (*). </li><li> Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse. Les œufs flottent à la surface de la solution. Aide d&#39;une pipette P1000 et embouts stériles, transférer tous les oeufs dans un tube conique de 15 ml stériles frais. </li><li> Ajouter 10 ml de tampon d&#39;oeuf stérile au tube et centrifuger à 200 x g (~ 1200 tpm) pendant 10 min. Répétez le lavage 3 x. Assurez-vous que les oeufs sont complètement remis en suspension dans le tampon d&#39;oeufs pendant chaque cycle de lavage. </li></ol> 3. La dissociation des cellules embryonnaires Effectuer les étapes suivantes de la procédure en conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. Alors que les animaux sontrobe de bactéries plaques, les lavages et le traitement avec la solution de lyse contenant l&#39;eau de Javel devrait éliminer la plupart sinon toutes les bactéries. Ainsi, à l&#39;aide d&#39;une hotte laminaire à ce stade de la procédure empêche une nouvelle contamination de la suspension d&#39;oeuf. <ol><li> Reprendre oeufs culot dans 1 ml de 2 mg / ml chitinase (stock tampon dans l&#39;oeuf un pH de 6,5 (*)) et de les transférer à un nouveau tube de 15 ml conique stérile. Basculez le tube pour 10-30 min à température ambiante. Le temps d&#39;incubation exacte varie en fonction de la fraîcheur de l&#39;enzyme et de la température de la pièce et doit donc être déterminée pour chaque préparation. Il est recommandé de commencer à surveiller les œufs sous un microscope de culture cellulaire inversée après 10 min d&#39;incubation. Remarque: dans notre expérience, un pH faible augmente l&#39;activité enzymatique de la chitinase. Pour cette raison, on utilise un tampon d&#39;oeuf à pH 6,5 pour dissoudre chitinase (recette indiquée ci-dessus, où le pH est ajusté à 6,5 avec du NaOH). </li><li> Lorsque ~ 80% des coquilles d&#39;oeufs sont digérés par l&#39;traitement de la chitinase (Figures 1 AB), les oeufs culot par centrifugation à 900 x g (~ 2500 tpm) pendant 3 min (*). Aide d&#39;une pipette P1000 et embouts stériles, retirer délicatement le surnageant et ajouter 3 ml de milieu L-15 (*). </li><li> Transférer les oeufs dans une plaque de 6 cm de diamètre et de dissocier les cellules doucement à l&#39;aide d&#39;une seringue stérile de 10 ml équipée d&#39;une aiguille 18 G. Surveiller le degré de dissociation en plaçant une goutte de suspension dans une boîte de Petri en matière plastique douce et par la visualisation au microscope. Ne pas aspirer de l&#39;air dans la seringue au cours de cette procédure pour éviter d&#39;endommager les cellules. Continuer jusqu&#39;à ce que la dissociation ~ 80% des cellules sont dissociées. </li><li> Filtrer la suspension en utilisant un 5 um filtre Millipore stérile. Les suspensions cellulaires doivent être filtrés afin d&#39;éliminer les grumeaux de cellules, les œufs non digérés et larves écloses. Filtrer 4-5 ml supplémentaires de frais L-15 médias à travers le filtre pour récupérer toutes les cellules. Ne pas utiliser une force excessive lors de l&#39;étape de filtration pour éviter damaging le filtre et / ou les cellules. </li></ol> 4. La culture de cellules <ol><li> Pellet les cellules dissociées par centrifugation à 900 x g (~ 2500 tpm) pendant 3 min (*). Aide d&#39;une pipette P1000 et embouts stériles enlevez soigneusement tout le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans complet milieu L-15 et la plaque 1 ml / puits. La quantité de milieu ajoutée est fonction du nombre de plaques utilisées 8P, la confluence des vers sur les plaques, et le type d&#39;expériences qui seront effectuées sur les cellules. La densité cellulaire peut être déterminée en utilisant un hématimètre. Pour les enregistrements de patch-clamp de placage de densité de ~ 230 000 cellules / cm 2 est optimal. </li><li> Conservez la plaque de 24 puits dans un récipient en plastique contenant Tupperware serviettes en papier humide pour éviter l&#39;évaporation de milieu de culture. Stocker le récipient dans un incubateur humidifié à 20 ° C et l&#39;air ambiant. </li><li> Les cellules sont généralement prêt pour les expériences dans les 24 h lorsque la différenciation morphologique et expression de marqueurs de la GFP sont terminées. Les cellules peuvent être maintenues en culture pendant 2 semaines, mais ils sont généralement plus sain jusqu&#39;à 7-9 jours après placage. Le milieu doit être remplacé une fois par jour pour maintenir les cellules saines. </li></ol>

C. elegans est un organisme modèle puissant pour déchiffrer les voies génétiques impliqués dans le développement, le comportement et le vieillissement. Sa commodité provient principalement de la facilité avec laquelle il peut être manipulé génétiquement et de son cycle de vie court. Malgré sa commodité, C. elegans a ses limites. C. cellules elegans sont minuscules et confinée à l&#39;intérieur d&#39;une cuticule sous pression qui limite l&#39;application des procédé...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour l&#39;étude des bases moléculaires de la fonction cellulaire, la différenciation et le comportement. Alors que son génome, les voies métaboliques et biosynthétiques sont similaires chez les vertébrés », sa traçabilité génétique et moléculaire sont beaucoup plus 2. Parmi ses avantages sont sa taille et simple anatomie, son cycle de vie rapide (3 jours à 25 ° C), durée de vie courte (2 semaines) et un grand nombre de descendants (&gt; 200). En raison de sa nature hermaphrodite et cycle de vie court, les manipulations génétiques et moléculaires sont simples dans C. elegans, y compris la génération d&#39;animaux transgéniques 3,4 et l&#39;application de techniques de knock-down gènes tels que l&#39;ARN interférence 5. C. corps et la coquille elegans sont transparents. Par conséquent les cellules peuvent être facilement visualisés à la fois l&#39;adulte et l&#39;embryon au microscope standard. Au cours des 40 dernières années, le C. elegans </em&gt; communauté a créé des ressources inestimables pour C. recherche elegans notamment une grande collection de mutants, KO et transgéniques, une description détaillée de l&#39;anatomie et de développement 6,7, y compris la reconstruction complète du système nerveux 8, et un génome entièrement séquencé qui est bien annoté et disponible à toute la communauté ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Malgré les nombreux avantages, certaines approches expérimentales ont été difficiles en C. elegans. Ceux-ci comprennent ceux qui nécessitent l&#39;accès à la membrane plasmique des cellules et l&#39;isolement des tissus ou types cellulaires. En effet C. elegans tissus sont confinés à l&#39;intérieur de son squelette hydrostatique sous pression, qui n&#39;est pas facilement digéré par traitement enzymatique ou détergents. À la fin de 1990 Miriam Goodman et Janet Richmond pionnier des méthodes pour les enregistrements électrophysiologiques C. elegansles neurones et les cellules musculaires in situ 9,10. Bien que ces méthodes nous ont donné des informations importantes sur neuronale et la fonction musculaire in vivo, ils sont difficiles et à faible débit. Des méthodes alternatives pour étudier la fonction des cellules in vivo ont été développés, notamment dans la plupart imagerie calcique in vivo en utilisant des capteurs de calcium génétiquement codés comme GCamP et cameleon 11-13. Ces méthodes cependant, ne permettent pas l&#39;utilisation d&#39;outils pharmacologiques parce qu&#39;ils sont appliqués sur des animaux vivants intacts. La première tentative de culture C. cellules elegans in vitro à grande échelle a été faite par Laird Bloom lors de la préparation de sa thèse de doctorat 14. Malheureusement, les difficultés rencontrées avec une mauvaise adhérence des cellules sur le substrat, la différenciation cellulaire et la survie médiocre ont empêché la mise en place de ce protocole rapide comme un procédé de culture cellulaire robuste. En 1995, Edgar et ses collègues ont publié une procédurepour enquêter sur la division cellulaire et de la morphogenèse par l&#39;isolement et la culture d&#39;un seul C. elegans embryons 15. Les cellules embryonnaires obtenues par digestion des coquilles d&#39;œufs avec une combinaison de traitement enzymatique et la dissociation d&#39;emploi, ont continué à proliférer, produisant jusqu&#39;à ~ 500 cellules 15. Par la suite, Leung et collègues cultivées un petit nombre de blastomères d&#39;étudier la morphogenèse intestinale. Ils ont montré que in vitro une blastomère isolé E produite cellules intestinales polarisées qui ont créé une structure analogue à celle de la lumière intestinale par l&#39;interaction avec l&#39;autre à travers les jonctions adhérentes apical 16. Buechner et ses collègues ont également fait état ​​d&#39;une méthode similaire pour la culture C. elegans cellules embryonnaires in vitro 17. Sur la base de ces premiers travaux, Christensen et ses collègues ont développé un protocole robuste pour la culture embryonnaire C. elegans cellules in vitro 1. Ilsa montré que C isolé. elegans cellules peuvent se différencier en différents types de cellules et de maintenir les caractéristiques qu&#39;ils possèdent in vivo, y compris l&#39;expression de marqueurs spécifiques des cellules. Plusieurs techniques qui sont difficiles in vivo, peuvent être appliqués sur isolé C. elegans cellules embryonnaires. Il s&#39;agit notamment de 1,18 19 électrophysiologique, l&#39;imagerie et les techniques immunochimiques 20,21, ainsi que l&#39;isolement de types de cellules spécifiques par cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour la construction de banques d&#39;ADNc spécifiques de cellules 22,23. techniques de knock-down de gènes tels que l&#39;ARN interférence (ARNi) peuvent être appliqués sur cultivées C. elegans cellules 1 et une méthode de marquage métabolique roman utilisant azido-sucre comme un outil pour la découverte de la glycoprotéine a été récemment développé pour in vitro en culture C. elegans cellules 24. En conclusion, le procédé de culture de cellules élargit la gamme of techniques qui peuvent être appliquées à l&#39;C. modèle elegans dans un effort pour déchiffrer la fonction des gènes dans le contexte d&#39;un organisme vivant. Nous décrivons ici le protocole pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires in vitro, qui est en grande partie basée sur le premier protocole décrit par Christiansen et ses collègues 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans est un puissant système de modèle, dans lequel des techniques génétiques et moléculaires sont facilement applicables. Jusqu&#39;à récemment, cependant, les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules et l&#39;isolement de types cellulaires spécifiques, ne pouvaient pas être appliquées dans C. elegans. Cette limitation est due au fait que les tissus sont confinés à l&#39;intérieur d&#39;une cuticule sous pression qui n&#39;est pas facilement digéré par traitement avec des enzymes et / ou des détergents. Basé sur les premiers travaux de pionnier par Laird Bloom, Christensen et ses collègues 1 développé une méthode robuste pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires à grande échelle. Les oeufs sont isolés des adultes gravides par traitement avec l&#39;eau de Javel / NaOH et ensuite traitées avec chitinase pour enlever les coquilles. Les cellules embryonnaires sont alors dissociées par pipetage manuel et étalées sur substrat de verre recouvert dans les médias de sérum enrichi. Dans les 24 heures de cellules d&#39;isolement commencer à se différencier en changeant la morphologie et en exprimant Marke spécifique de cellulers. C. elegans cellules cultivées en utilisant cette méthode survivre jusqu&#39;à deux semaines in vitro et ont été utilisés pour électrophysiologique, immunochimique, et l&#39;imagerie des analyses aussi bien qu&#39;ils ont été triés et utilisés pour microarray profilage.

C. elegans cellules cultivées se différencient et cellules expriment des marqueurs spécifiques Christensen et ses collègues à l&#39;aide de la coloration au bleu trypan démontré que&gt; 99% des embryonnaire C. elegans cellules survivent à la procédure d&#39;isolement. Au jour 9 et 22 après l&#39;étalement, 85% et 65%, respectivement, sont encore vivantes 1. Isolé embryonnaire C. cellules elegans doivent adhérer à un substrat afin de d...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Nous décrivons ici un protocole révisé pour la culture à grande échelle de l&#39;embryon C. elegans cellules. Embryonnaire C. elegans cellules cultivées in vitro à l&#39;aide de cette méthode, semblent différencier récapituler et l&#39;expression de gènes d&#39;une manière spécifique de la cellule. Les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules ou à l&#39;isolement de types de cellules spécifiques à partir d&#39;autres tissus peuvent être appliquées sur C. elegans cellules cultivées.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.4K vues.  University of Miami.  Nous décrivons ici un protocole révisé pour la culture à grande échelle de l'embryon C. elegans cellules. Embryonnaire C. elegans cellules cultivées in vitro à l'aide de cette méthode, semblent différencier récapituler et l'expression de gènes d'une manière spécifique de la cellule. Les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules ou à l'isolement de types de cellules spécifiques à partir d&#3...

Vidéo: A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Recherche

Biologie

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Application d&#39;une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...