我々は、この研究で分析し、人間の毛髪試料を提供するためのKymberleeオブライエン、セリア·ムーア、エドワードTronick（心理学科、マサチューセッツ州、ボストン大学）に感謝し、スティーブン·スオミとアマンダDettmer（比較動物行動学、NICHDの研究室）のためのアカゲザルの毛のサンプルを提供。この方法の最初の開発と継続的な使用は、人類にNIH RR11122によってサポートされています

1。サンプル収集と保管<ol><li>人間の髪の毛<ol><li>輪ゴムやクリップ（直径鉛筆幅まで）サンプリングする、髪の全体の長さを確保。できるだけ頭皮に近いカット髪きれいなハサミで（しないニック肌に注意しながら）。注：標準のサンプリング領域は、頭蓋骨の後部頂点である。 </li><li>一部の研究者は、しかし参照Manenschijn ら 8（水やシャンプー7への反復暴露からウォッシュアウトが原因である可能性があり、頭皮6からの距離で人間の髪の毛のCORTレベルの低下を報告し、逆の結果を得るためにThomson ら 9を持っている全く分節下落がこの潜在的な「ウォッシュアウト効果」の影響を最小限に抑えるために）見られなかった、我々は、1cm /月10の平均成長率を想定した3センチメートル（、より大きくない長さの頭皮に近位ヘアセグメントを収集することをお勧め3センチメートルセグメントは、Cが含まれていますおよそ過去3ヶ月の間に堆積されているORT）。これを達成するために、最初のカットから3センチメートルを測定し、3センチメートルサンプルを得るために再びカットする定規を使用しています。注：毛髪の長さに切断された後の研究は、前のサンプリング期間にわたってCORT沈着の遡及カレンダーを確立するために別個の1cmの長さのセグメントに試料を切断することを含むない限り、配向ストランドを保持する必要がなくなりまし6。 </li><li>アルミ箔、きれいな紙封筒、またはサンプル洗浄に使用されるタイプの15ミリリットルスクリューキャップポリプロピレン遠心管で作られたポーチに毛髪試料を配置します。 CORTは、毛髪2で非常に安定であるように、必要に応じて、サンプルを周囲温度で一晩出荷され、-20℃で無期限に保存することができる。 </li><li>毛採取手順は、ボランティアで実施されるべきであると実践サンプルは完全な調査に着手する前に検討しなければならない。注：SMAなどの毛髪サンプルをそれは最低のCORT以下EIA規格の読みを得る可能性を最小限にするために、&gt; 10 mgのサンプルを収集することが望ましいが、5〜10mgのは、ここに記載される方法を用いて分析することができるようにllの。 </li></ol></li><li>猿の毛<ol><li>標準的な動物クリッパーを使用して、首のうなじから毛（100から250 mg）を剃る。 、できるだけ肌に近い剃る肌ではないニックに注意しながら、血液CORTレベルは、髪に見られるものと比較して極めて高いため出血を引き起こす。注意：一般的に髪の良い情報源であり、容易に前にリサンプリングに毛の再生のために観察することができるため、首の領域は、日常的サンプリングのために選択した。 </li><li>アルミホイルまたは15ミリリットルスクリューキャップポリプロピレン遠心管で作られたポーチに毛髪試料を配置します。猿の毛のサンプルが保存され、人間の髪の毛のサンプルに対して上記と同様に出荷されるべきである。 </li><li>猿の毛は、人間の頭髪とは異なり、ST、その後、一定の長さに成長し、ので、11を成長させるのopは、CORT堆積のためのカレンダーとして皮膚から距離を使用するには、この場合には一般に不可能である。動物（例えば、周期的なルーチン健康診断時）を複数回サンプリングすることができる場合は、それがベースライン時点を設定し、時間が経過した所望の時間後に同じ領域をreshaveするための初期シェービングを行うことが望ましい。第二の試料中のCORTは、その区間5以上、HPA活性に対するサンプルのCORTの内容の正確な帰属が可能に剃る-reshave間隔の間に堆積した。 </li></ol></li></ol> 2。サンプル洗浄と乾燥<ol><li>洗濯<ol><li> 15ミリリットルのスクリューキャップポリプロピレン製遠心管に各毛髪試料を配置します。 </li><li>ローテーターを用いて3分間繰り返し反転続い各チューブに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレードのイソプロパノールを5ml加える。 </li><li> cとしながら、廃棄物容器にイソプロパノールをデカントサンプルのいずれかを失うことはありません。 </li><li>繰り返します2.1.2および2.1.3をもう一度繰り返します。 </li></ol></li><li>乾燥<ol><li>完全イソプロパノール蒸発を確実にするために、少なくとも2〜3日間髪を乾かす。 </li></ol></li></ol> 3。サンプル研削、CORTの抽出 - 大型サンプル用のメソッドの1 <ol><li>サンプルの粉砕<ol><li>ステンレス鋼は、単一の12ミリメートルのステンレス鋼の研削ボールと一緒に瓶を粉砕する10ミリリットルに乾燥した毛髪の250ミリグラムまで入れます。 </li><li>ボールミルを用いて25ヘルツの速度で6分間、試料を挽く。 </li><li>化学天秤で粉末状の毛の50ミリグラムまで秤量し、その後のCORTの抽出のためのクリーン2.0ミリリットルポリプロピレン製マイクロ遠心チューブに移す。 </li></ol></li><li> CORT抽出<ol><li>粉末試料を含有するマイクロチューブをHPLCグレードのメタノール1.0ミリリットルを追加します。 </li><li>チューブに蓋をして、COを用いて、室温で18〜24時間、サンプルをインキュベート回転子を使用してnstant反転。 </li><li>粉末状毛髪をペレット化し、室温で1分間、14,000 rpmで管を遠心分離する。 </li><li>粉末状の毛のペレットを乱さないように注意しながら、新しい1.5 mlのマイクロチューブに上清の0.6ミリリットルを転送します。 </li></ol></li></ol> 4。サンプル研削とCORT抽出 - 少量のサンプルのための方法2 <ol><li>サンプルの粉砕<ol><li>ビーズビーティングの鉄筋予め秤量した2ミリリットルの微量遠心チューブに毛の60ミリグラムまで入れます。 </li><li>試料重量を得るために、バイアルを再び秤量。 </li><li>各バイアルを3 3.2ミリメートルクロム鋼ビーズを追加し、ビーズビーター中で少なくとも2分間、試料を研削。目視検査は、サンプルが十分に粉砕されていることが明らかになった場合には、0.5または1分間の追加の研削を行う。注意：CORT抽出を研削と同じバイアル中で実行されるので、地毛権移転は、この場合必要ありません。 </li></ol&gt; </li><li> CORT抽出<ol><li>粉末試料を含有するマイクロチューブをHPLCグレードのメタノール1.5ミリリットルを追加します。 </li><li>チューブに蓋をし、回転子を用いて一定反転しながら室温で18〜24時間、サンプルをインキュベートする。 </li><li>粉末状毛髪をペレット化し、室温で5分間、10,000 rpmで管を遠心分離する。注：クロム鋼ビーズ法1と比較してより低い遠心分離速度を占める、抽出と遠心分離のステップの間に髪をチューブ内に残っている。 </li><li>粉末状の毛のペレットを乱さないように注意しながら、新しい1.5 mlのマイクロチューブに上清の1.0ミリリットルを転送します。 </li></ol></li></ol> 5。溶媒の蒸発とサンプルの再構成<ol><li>真空蒸着装置が利用できない場合、真空蒸発又は窒素ガス流のいずれかを用いてメタノールをドライダウン。真空蒸着装置を使用する場合、メタノール蒸気を用いて捕捉することができるコー​​ルドトラップや活性炭カートリッジを搭載した化学トラップの。 </li><li>メタノールを除去した後、EIAアッセイ緩​​衝液（アッセイ希釈剤）適切な容量のCORT抽出物を再構成する。比較的高いCORT値が予想される場合には、0.4ミリリットル以上のバッファ量を使用しています。比較的低い値が予想される場合には、ボリュームは感度を高める0.2 ml以下にすることができる。注：0.2mlの試料の再実行が必要な場合に、少なくとも二回重複した試料のアリコートを実行するのに十分な量である。 </li><li>どちらかは、すぐに再構成されたサンプルを分析するか、後の分析のために-20℃で、それを凍結する。注：再構成した試料を凍結している場合、最終的な計算が実行されるときに試料体積の変化が偽CORT値につながるので、凍結期間中に昇華を回避することが重要である。 </li></ol> 6。 CORTアッセイおよびデータ変換<ol><li>毛髪抽出物をアッセイする高感度酵素イムノアッセイ（EIA）キットを用いてCORT。注：商業唾液CORT EIAキットを使用する場合は、試験サンプルが重複し、各再構成されたヘアエッセンスの分量の代わりに、唾液サンプルであることを除いて、キット文書に記載されているメーカーの推奨に従ってください。 </li><li>すべてのアッセイで使用するための品質管理（QC）のヘアエッセンスを準備します。 <ol><li>余分な毛のサンプル数を収集し、いずれかのステップ4.1および4.2のように個々に処理したり、ステップ3.1と3.2との大きなサンプル処理のためにそれらをプールする。 </li><li>溶剤を蒸発させて、ステップ5.1および5.2のように、抽出物を再構成し、いくつかの個々のまたはプールされたサンプルから再構成された抽出液をプールする。 </li><li>個々のマイクロ遠心チューブにプールし再構成した抽出液（ 例えば 0.10ミリリットル）の適切な量を分取し、後で使用するために凍結する。 </li><li> REFEを提供するために、各免疫測定マイクロプレート上で重複して1 QCアリコートを解凍し、実行します各実行の品質をチェックするためCORT値をrence。 </li><li>アッセイ内変動係数（CV、サンプル値の組の平均値で割った標準偏差として定義される）は、アッセイ間CVを算出することができるのに対し、同じランで10-12 QCウェルを分析することによって計算することができる。ランのグループ全体QC値を用いて。自分のマイクロプレートリーダーソフトウェアは、各ヘアエッセンスを表す連のウェルのためのCVを算出する場合には、アッセイ内CVを決定するための別の方法は、プレート全体を横切るそれらの個々のCV値の平均を計算することである。 </li><li>任意のサンプル抽出物はEIAの最高CORT標準よりも大きい読み出しをもたらす場合には、抽出物の別のアリコートを、アッセイ緩​​衝液の適切な量で希釈され、その後のEIAの読み取りを希釈係数について補正される。連のウェルのためのCVは、&gt; 10％であればサンプルも日常再分析している。 </li><li> CORT EIAキットはCORT VAを測定するように設計されているので梅毒、唾液または血漿のような液体試料中の、マイクロプレートリーダーソフトウェアの出力は、粉末状毛髪の単位重量当たりのCORT量に変換しなければならない。次の式はmgの毛ごとのPG CORTにμgの/ DLにおけるアッセイ出力を変換します。 （A / B）*（C / D）* E * F =万 ここで、Aアッセイ出力から=μgの/ DL;抽出し、髪のB =重量（mg単位）、C =巻。メタノール（中には）、粉末、髪に追加D =巻。抽出液から回収し、その後を乾燥し、メタノール（ML）であり、E =巻。乾燥した抽出物を再構成するために使用されるアッセイ用緩衝液（ML）で、PG / mgのヘアCORT濃度のFを=最終値。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Selye, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+the+general+adaptation+syndrome.">Stress and the general adaptation syndrome.</a> Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).</li><li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Hair+cortisol:+A+novel+biomarker+of+hypothalamic-+pituitary-adrenocortical+activity.">Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li><li>Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+neurochemistry+of+self-injurious+behavior:+A+nonhuman+primate+model.">The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model.</a> Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).</li><li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques.">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).</li><li>Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+monkey+model+of+self+injury:+Effects+of+relocation+stress+on+behavior+and+neuroendocrine+function.">A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function.</a> Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).</li><li>Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+as+a+retrospective+calendar+of+cortisol+production+-+Increased+cortisol+incorporation+into+hair+in+the+third+trimester+of+pregnancy.">Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy.</a> Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).</li><li>Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shampoo+and+water+washing+on+hair+cortisol+concentrations.">Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations.</a> Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).</li><li>Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+method+to+measure+long+term+cortisol+levels.">Evaluation of a method to measure long term cortisol levels.</a> Steroids. 76, 1032-1036 (2011).</li><li>Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+provides+a+historical+record+of+cortisol+levels+in+Cushing&#8217;s+syndrome.">Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing&#8217;s syndrome.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).</li><li>LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variations+in+growth+rate+and+sample+collection+on+interpreting+results+of+segmental+analyses+of+hair.">The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair.</a> Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).</li><li>Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+hair+growth+in+Macaca+mulatta.">Variability of hair growth in Macaca mulatta.</a> Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).</li><li>Sauv&#233;, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cortisol+in+human+hair+as+a+biomarker+of+systemic+exposure.">Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure.</a> Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).</li><li>Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+cortisol+analysis+in+hair+and+its+clinical+applications.">An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications.</a> Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).</li><li>Bechsh&#248;ft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortisol+levels+in+hair+of+East+Greenland+polar+bears.">Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears.</a> Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).</li><li>Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Society+of+Hair+Testing+guidelines+for+drug+testing+in+hair.">Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair.</a> Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).</li><li>Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hair+follicles+display+a+functional+equivalent+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+(HPA)+axis+and+synthesize+cortisol.">Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol.</a> FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).</li><li>Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol+as+a+biological+marker+of+chronic+stress:+Current+status,+future+directions+and+unanswered+questions.">Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions.</a> Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).</li><li>Stalder, T., Kirschbaum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cortisol+in+hair+-+State+of+the+art+and+future+directions.">Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions.</a> Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).</li><li>Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol,+stress+exposure,+and+mental+health+in+humans:+A+systematic+review.">Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review.</a> Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).</li></ol>

著者らは、宣言する特別の利害関係はありません。

上述の毛髪CORT手順、実行が簡単であり、比較的安価であり、容易に入手可能な化学物質、試薬および消耗品を利用して、1つの例外を除いて、典型的な分析実験室に存在する可能性が高い、装置を必要とする。例外は、例えばボールミルまたはミニビードビーターのような研削装置である。我々はいくつかの研究グループは、長さ12内のおよそ1ミリメートルの小さな断片に毛髪サンプ...

血漿、唾液、または時々尿や糞中におけるCORTの測定は、ストレス1におけるHPA系の役割のセリエの発見以来、生理的ストレスの指標として用いられてきた。多くの論文が、急性ストレスの多い状況にHPA活性を関連する公開されているが、フィールドは、慢性生理的ストレスの簡単で信頼性の高い指標の欠如によって妨げられてきた。この問題は、日内変動を受けやすく、環境障害により混乱することができ、HPA活動の血漿および唾液降伏両方「点」の見積りために生じる。尿と糞便サンプルは、場合によっては一日までの時間数をまたがるCORTおよび/または代謝物の排泄を測定した結果を得ることができます。これらの行列のいずれかを使用して、複数のサンプルの収集経時CORTレベルの大まかな複合インデックスを提供することができるが、これらのアプローチのいずれも、HPA活性の真の長期的なインデックスと、このSYの応答性を提供しない慢性的なストレス要因に由来する。 髪にCORTを測定することは、ストレスの文献でこの重要なニーズを満たすために始めている。いくつかの研究室による初期の研究では、ヒトの毛髪CORTの存在を示したが、毛CORTレベルはストレス2の関数として変更されたかどうか調査していませんでした。私たちの研究室では、様々な社会的、行動要因3でアカゲザルHPA系の調節に何年も前から興味があったように、我々は、アカゲザルの毛4の抽出と分析のための方法を確立し、検証するために設定してください。血液媒介CORTをゆっくりと連続的に成長する毛に組み込まれていることを前提とし、この新たな方法の目的は、数週間から数ヶ月の期間にわたってHPA活性の指標として統合された毛髪由来CORTのレベルを使用することであった。 いくつかの方法論的な課題を、本プロトコールを開発する際に遭遇した。まず、これまでの研究では、その少量Oを示していたF汗や皮脂中に排泄されるCORT循環ので、コートの毛軸2の外側を可能性があります。この潜在的な交絡を排除するために、我々は成長している毛幹内に存在CORTにはほとんど影響を持ちながら、外部CORTを取り除くように見える穏やかな洗浄手順を開発しました。このように、この手順（イソプロパノールすなわち 2つの3分間の洗浄）を行うサルの毛は、総毛CORTコンテンツの約7から8パーセントを失い、3回目の洗浄は、サンプル4から1％未満、よりステロイドを削除しました。同じ手順で（未発表K.ローゼンバーグとJ.マイヤー、）サンプルから27％、総CORTコンテンツの平均を削除するので、ヒトの毛髪の外部CORTがあるように見える。サルの毛と同様に、しかしながら、付加的な洗浄が最初の2回の洗浄よりもはるかに少ないCORT（約7％）を含有した。そのため、サルと人間の髪の毛の両方から得られた結果は、主要なFRACを維持しながら、ほとんどの（すべ​​てではない）外部のCORTを取り外すことができるという主張を支持内部毛母内CORTのTiONから。第二に、我々の予備的研究はまた、前に有意に抽出し、髪を研削すると、おそらく毛幹の複雑なタンパク質性マトリックスをこじ開け、ならびに溶媒の浸透のために利用可能な表面積を増加させることにより、試料からCORT回復を増加することを示した。二つの異なる研削方法は、利点と欠点とをそれぞれ開発された。ボールミルを用いる方法1は、最高の粉末を生成するという利点を有する。しかしながら、ボールミル、比較的高価な装備アイテムであり、標準的な研削ジャー及びボールを使用する場合には、一度に二つの試料を粉砕することができる。少量の試料は、標準粉砕ジャーとをボールミルを用いて処理することは困難である。ビードビーターを用いる方法2は、その研削能力があまり効果的である。その結果、平均CORTの回復はボールミル（未発表データ）と比較してこの方法を使用して約10％低い。一方、ビードビーター試料16〜24は、モデルに応じて、一度に粉砕することができ、この方法は少量の試料に適している、ボールミルよりもかなり安価である。そのため、上記の差動回復するのではなく、特定の研究内のすべてのサンプルで同じ粉砕方法を使用することをお勧めします。 毛髪サンプルが処理されると、それらはもともと唾液CORTを測定するように設計され高感度で特異的な商業的EIAキットにより分析される抽出物中のメタノールおよびCORTで抽出する。抽出と分析手順は、猿の毛のサンプルからの抽出物の段階希釈が密接に本物のCORT標準から得た測定値を並列EIAの測定値が得られていることを実証することによって部分的に検証された。次に、（血漿および唾液CORTに加えて）ヘアCORTは新設住宅四半期4,5にサルの管理上義務付けられた移転の主要な生活ストレスに敏感であることを示した。 PRESENTペーパーは、ヒトとサルの毛髪試料を処理するために、そのようなサンプルからCORTを抽出し、分析するために、我々の研究室で日常的に使用される方法の詳細な説明を提供しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade isopropanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A451</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade methanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Salivary cortisol assay kits</td>
			<td style="width:116px;">Salimetrics</td>
			<td style="width:119px;">1-3002</td>
			<td>See manufacturer&#39;s kit insert for information on assay sensitivity and specificity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Max Scientific</td>
			<td>10-9151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0-ml XXTuff reinforced microvials</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>330TX</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.2-mm chrome-steel beads</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>11079132c</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10-ml stainless steel grinding jars</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">02.462.0061</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm stainless steel grinding balls</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">05.368.0037</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant activated carbon cartridge</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DTK120R</td>
			<td>Use with Savant chemical trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for 15-ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>S02135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>NC9854190&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MM 200 mixer mill</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Beadbeater 16&#160;</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant DNA Speedvac</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DNA120-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant refrigerated vapor trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>RVT400-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant chemical trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>SCT120</td>
			<td>Alternative to refrigerated vapor trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate washer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate mixer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Multichannel pipetter</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair

ストレスホルモンのコルチゾール（CORT）をゆっくりヒト、非ヒト霊長類、および他の哺乳動物の毛髪成長軸に組み込まれる。私たちは、開発および検証アカゲザル髪からCORT抽出および分析のための方法を、その後、人間の頭髪で使用するためにこの方法を適応。血漿または唾液から得CORT「サンプル点」、毛髪CORTは、視床下部 - 下垂体 - 副腎皮質の統合された尺度を提供する（HPA）系活性、およびホルモンの取り込み期間中にこのようにして生理的ストレスとは対照的である。人間の頭髪が1cm /月の平均速度で成長しているので、長さが数センチ髪のセグメントから得CORTレベルは、潜在的に数ヶ月もかけて経験したストレスのバイオマーカーとして機能することができます。 本手法では、それぞれの毛髪サンプルは、第汗や皮脂から堆積された毛幹の外側から任意CORTを除去し、イソプロパノールで2回洗浄する。乾燥させた後、試料は、毛髪のタンパク質基質を破壊し、抽出のための表面積を増加させるために微細な粉末に粉砕される。毛幹の内部からCORTをメタノール中に抽出し、メタノールを蒸発させ、抽出物をアッセイ緩​​衝液中で再構成されている。抽出CORT、標準および品質管理と共に、次いで高感度かつ特異的な市販の酵素イムノアッセイ（EIA）キットを用いて分析される。 EIAからの読み出しはmgの粉末状毛髪重量当たりの視聴のCORTに変換される。この方法は、ヒトでマカクザル、マーモセット、イヌ、およびホッキョクグマのいくつかの種を髪のCORTを分析するために我々の研究室で使用されてきた。私たちの研究室から他の研究グループからの両方の多くの研究では、自然の中で慢性的ストレス曝露を評価するだけでなく、実験室の設定のためのヘアCORTの幅広い適用性を実証している。

図1に、方法2の粉砕·抽出を使用して処理人間の髪の毛のサンプル（成人男性と女性被験者）の代表的なセットからのプリントアウトを示しています。コンピュータソフトウェアは、データ出力を生成し、CORT規格（ 図2）を4 -パラメーターシグモイド曲線に適合させるために使用した。このプレートからの間のウェルCVは1.34％、平均アッセイ内CVの0.01から5.73パーセン...

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Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

コルチゾール（CORT）は、ヒトとヒト以外の霊長類の成長毛幹に蓄積する。我々は、高精度と感度で髪のCORTを抽出して分析するための方法が記載されている。毛髪CORTの測定は、数週間から数ヶ月の期間にわたって慢性ストレスを評価するために特に適している。

ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.1K ビュー.  University of Massachusetts, Amherst. コルチゾール（CORT）は、ヒトとヒト以外の霊長類の成長毛幹に蓄積する。我々は、高精度と感度で髪のCORTを抽出して分析するための方法が記載されている。毛髪CORTの測定は、数週間から数ヶ月の期間にわたって慢性ストレスを評価するために特に適している。 

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

生物学

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

プロテオームとトランスクリプトーム解析のための蜘蛛から毒の抽出と毒液腺Microdissections

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

グレースケール解析を用いたマウスの抜け毛の定量分析のための新たな手法

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

ヒト変形性膝関節からの組織採取とRNA抽出

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

ヒト胞状卵胞からの系統特異的細胞の抽出、標識、精製

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...