Nous remercions Kymberlee O&#39;Brien, Celia Moore, et Edward Tronick (Département de psychologie, Université du Massachusetts, Boston) pour fournir des échantillons de cheveux humains analysés dans cette étude, et Stephen Suomi et Amanda Dettmer (Laboratoire d&#39;éthologie comparée, NICHD) pour fournir des échantillons de cheveux de singe rhésus. Le développement initial et l&#39;utilisation continue de cette méthode a été soutenu par le NIH RR11122 à MAN

Une. Collecte et stockage des échantillons <ol><li> Cheveux humains <ol><li> Fixer la totalité de la longueur de la chevelure à échantillonner (jusqu&#39;à un crayon-largeur de diamètre) avec une bande de caoutchouc ou de ce plan. Coupe de cheveux au plus près du cuir chevelu que possible (en prenant soin de ne pas entailler la peau) avec une paire de ciseaux propres. Remarque: La zone d&#39;échantillonnage standard est le sommet postérieure du crâne. </li><li> Certains chercheurs ont signalé une baisse des niveaux de CORT de cheveux humains avec la distance du cuir chevelu 6, qui peut être dû au lavage d&#39;une exposition répétée à l&#39;eau et du shampoing 7 (bien voir Manenschijn et al. 8 et Thomson et al. 9 pour des résultats contraires à qui ne baisse segmentaire a été observée) Pour minimiser l&#39;impact de ce potentiel &quot;effet de lavage&quot;, nous vous recommandons de collecte des segments de cheveux proximale sur le cuir chevelu avec une longueur maximale de 3 cm (en supposant un taux de croissance moyen de 1 cm / mois 10, un 3 cm segment contient CTRO qui a été déposée sur environ les 3 derniers mois). Pour ce faire, utilisez une règle pour mesurer 3 cm de la première coupe et couper de nouveau pour obtenir l&#39;échantillon de 3 cm. Remarque: Une fois que les cheveux ont été coupés à la longueur, il n&#39;est plus nécessaire de maintenir les brins dans l&#39;alignement à moins que l&#39;étude consiste à couper l&#39;échantillon de 1 cm de longs segments distincts d&#39;établir un calendrier rétrospectif de dépôt CORT cours de la période de temps avant l&#39;échantillonnage 6. </li><li> Placer l&#39;échantillon de cheveux dans une pochette faite d&#39;une feuille d&#39;aluminium, une enveloppe de papier propre, ou un bouchon à vis en polypropylène tube à centrifuger de 15 ml du type utilisé pour l&#39;échantillon de lavage. Comme CORT est extrêmement stable dans les cheveux 2, les échantillons peuvent être conservés indéfiniment à -20 ° C et, si nécessaire, livré nuit à température ambiante. </li><li> La procédure de collecte de cheveux doit être pratiquée sur les bénévoles et les exemples de bonnes pratiques doivent être pesés avant d&#39;entreprendre une étude complète. Remarque: les échantillons de cheveux que small comme 5-10 mg peuvent être analysées en utilisant les méthodes décrites ici, mais il est souhaitable de recueillir des échantillons&gt; 10 mg pour minimiser la probabilité d&#39;obtenir des lectures EIE en dessous de la norme de CORT plus bas. </li></ol></li><li> poils de singe <ol><li> Raser les poils (100-250 mg) de la nuque à l&#39;aide d&#39;une tondeuse animal standard. Raser au plus près de la peau que possible, en faisant attention à ne pas entailler la peau et provoquer des saignements parce que les niveaux de CORT de sang sont très élevés par rapport à ceux trouvés dans les cheveux. Remarque: La région du cou a été choisi pour l&#39;échantillonnage de routine, car il est généralement une bonne source de cheveux et peut être facilement observée pour la repousse des cheveux avant rééchantillonnage. </li><li> Placer l&#39;échantillon de cheveux dans une pochette faite d&#39;une feuille d&#39;aluminium ou d&#39;un bouchon à vis en polypropylène tube à centrifuger de 15 ml. des échantillons de cheveux de singe doivent être stockés et transportés dans la même manière que celle décrite ci-dessus pour les échantillons de cheveux humains. </li><li> Parce que les cheveux de singe, la différence des cheveux de cuir chevelu humain, pousse à une certaine longueur, puis stops croissance 11, il n&#39;est généralement pas possible dans ce cas d&#39;utiliser la distance de la peau comme un calendrier pour le dépôt CORT. Toutefois, si un animal peut être échantillonné plus d&#39;une fois (par exemple, lors d&#39;examens de santé de routine périodiques), il est souhaitable d&#39;effectuer un rasage initiale pour définir un point de temps de référence, puis reshave la même zone après la période de temps désirée est écoulé. CORT dans le second échantillon a été déposé au cours de l&#39;intervalle de rasage-reshave, ce qui permet une attribution précise de la teneur en CORT de l&#39;échantillon à l&#39;activité HPA-dessus de cet intervalle 5. </li></ol></li></ol> 2. Lavage et séchage de l&#39;échantillon <ol><li> Laver <ol><li> Placer chaque échantillon de cheveux en un bouchon à vis en polypropylène tube à centrifuger de 15 ml. </li><li> Ajouter 5 ml de chromatographie en phase liquide à haute performance de l&#39;isopropanol (HPLC) de qualité pour chaque tube suivie d&#39;une inversion répétée pendant 3 min en utilisant un dispositif de rotation. </li><li> Décanter le isopropanol dans un conteneur à déchets, en tenant cne sont pas à perdre de l&#39;échantillon. </li><li> Répétez les étapes 2.1.2 et 2.1.3 une fois de plus. </li></ol></li><li> Séchage <ol><li> Sécher les cheveux pendant au moins 2-3 jours pour assurer une évaporation complète de l&#39;isopropanol. </li></ol></li></ol> 3. Rectification de l&#39;échantillon et CORT Extraction - Méthode 1 pour de grands échantillons <ol><li> broyage de l&#39;échantillon <ol><li> Placer un maximum de 250 mg de cheveux séchés dans un 10 ml en acier inoxydable pot de broyage avec une seule bille de broyage en acier inoxydable de 12 mm. </li><li> Broyer l&#39;échantillon pendant 6 minutes à une vitesse de 25 Hz en utilisant un broyeur à billes. </li><li> Peser jusqu&#39;à 50 mg de poudre de cheveux sur une balance analytique et puis le transférer à un polypropylène microtube propre 2,0 ml pour l&#39;extraction de CORT ultérieure. </li></ol></li><li> Extraction CORT <ol><li> Ajouter 1,0 ml de méthanol de qualité HPLC pour le tube à centrifuger contenant l&#39;échantillon en poudre. </li><li> Boucher le tube et incuber l&#39;échantillon pendant 18 à 24 h à la température ambiante avec des coInstant inversion en utilisant un dispositif de rotation. </li><li> Centrifuger les tubes à 14 000 rpm pendant 1 min à la température ambiante pour obtenir un culot des cheveux en poudre. </li><li> Transférer 0,6 ml du surnageant dans un tube de 1,5 ml microtubes propres, en prenant soin de ne pas perturber le culot de cheveux poudrés. </li></ol></li></ol> 4. Rectification de l&#39;échantillon et CORT Extraction - Méthode 2 pour de petits échantillons <ol><li> broyage de l&#39;échantillon <ol><li> Placez un maximum de 60 mg de cheveux en 2 ml microtube prépesé renforcé pour perle battre. </li><li> Peser à nouveau le flacon pour obtenir le poids de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter trois billes d&#39;acier de chrome de 3,2 mm à chaque flacon, puis broyer l&#39;échantillon pendant au moins 2 min dans une pile de billes. Si l&#39;inspection visuelle révèle que l&#39;échantillon n&#39;est pas suffisamment pulvérisé, puis effectuer un broyage supplémentaire pour 0,5 ou 1 min. Note: Pas de transfert de la chevelure de sol est nécessaire dans ce cas parce que l&#39;extraction CORT est réalisée dans le même flacon que le broyage. </li></ol&gt; </li><li> Extraction CORT <ol><li> Ajouter 1,5 ml de methanol de qualité HPLC pour le microtube contenant l&#39;échantillon de poudre. </li><li> Boucher le tube et incuber l&#39;échantillon pendant 18 à 24 h à la température ambiante avec inversion constante en utilisant un dispositif de rotation. </li><li> Centrifuger les tubes à 10 000 rpm pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot des cheveux en poudre. Remarque: Les billes d&#39;acier au chrome restent dans le tube avec les cheveux au cours des étapes d&#39;extraction et de centrifugation, qui représente la vitesse de centrifugation plus faible par rapport à la méthode 1. </li><li> Transférer 1,0 ml du surnageant dans un tube de 1,5 ml microtubes propres, en prenant soin de ne pas perturber le culot de cheveux poudrés. </li></ol></li></ol> 5. L&#39;évaporation de solvants et de reconstitution échantillon <ol><li> Sécher le bas le methanol ou l&#39;autre à l&#39;aide d&#39;un évaporateur sous vide ou d&#39;un courant d&#39;azote gazeux si un évaporateur sous vide n&#39;est pas disponible. Si un évaporateur à vide est utilisé, la vapeur de méthanol peut être piégé au moyend&#39;un piège froid ou un piège chimique équipé d&#39;une cartouche de charbon actif. </li><li> Après élimination du méthanol, de l&#39;extrait de reconstituer CORT dans un volume approprié de tampon de dosage EIA (dosage de diluant). Si des valeurs relativement élevées de CORT sont prévus, puis d&#39;utiliser un volume tampon de 0,4 ml ou plus. Si des valeurs relativement faibles sont prévues, le volume peut être réduit à 0,2 ml ou moins pour augmenter la sensibilité. Note: 0,2 ml le volume est suffisant pour exécuter aliquotes en double de l&#39;échantillon au moins deux fois dans le cas d&#39;une reprise de l&#39;échantillon est nécessaire. </li><li> Soit doser l&#39;échantillon reconstitué immédiatement ou congeler à -20 ° C pour analyse ultérieure. Remarque: Si l&#39;échantillon reconstitué est congelé, il est important d&#39;éviter la sublimation au cours de la période de gel depuis un changement dans le volume de l&#39;échantillon conduit à une valeur de CORT faux quand les derniers calculs sont effectués. </li></ol> 6. CORT test et de conversion de données <ol><li> Doser les extraits de cheveux pourCORT l&#39;aide d&#39;un dosage immuno-enzymatique à haute sensibilité (EIE) du kit. Remarque: Si vous utilisez un kit salivaire commerciale CORT EIE, suivre les recommandations du fabricant, comme indiqué dans le kit insert sauf que les échantillons de test seront aliquotes en double de chaque extrait de cheveux reconstitué au lieu d&#39;échantillons de salive. </li><li> Préparer un contrôle de qualité (QC) extrait de cheveux pour une utilisation dans chaque dosage. <ol><li> Prélever un nombre d&#39;échantillons de cheveux supplémentaires et soit de les traiter individuellement comme dans les étapes 4.1 et 4.2 ou en commun leur grande pour le traitement de l&#39;échantillon comme dans les étapes 3.1 et 3.2. </li><li> Évaporer le solvant et reconstituer les extraits que dans les étapes 5.1 et 5.2, puis regrouper les extraits reconstitués à partir de plusieurs échantillons individuels ou groupés. </li><li> Aliquoter un volume approprié de l&#39;extrait reconstitué commun (par exemple 0,10 ml) dans des microtubes individuels et congeler pour une utilisation ultérieure. </li><li> Décongeler et exécuter un QC aliquote en double sur chaque d&#39;immunoessais en microplaques de fournir un référence valeur CORT pour vérifier la qualité de chaque course. </li><li> Un coefficient intra-essai de variation (CV; définie comme l&#39;écart type divisé par la moyenne d&#39;un ensemble de valeurs d&#39;échantillons) peut être calculée par l&#39;analyse de 10 à 12 QC puits dans la même course, alors qu&#39;un CV inter-essai peut être calculé en utilisant les valeurs de CQ à travers un groupe de pistes. Si son logiciel de lecteur de microplaques calcule un CV pour les puits en double représentant chaque extrait de cheveux, puis une autre méthode pour déterminer intra-essai CV consiste à calculer la moyenne de ces valeurs de CV individuels à travers toute la plaque. </li><li> Si l&#39;extrait de l&#39;échantillon donne une lecture supérieure à la norme de CORT plus élevé dans l&#39;EIE, puis une autre aliquote de l&#39;extrait est dilué avec une quantité appropriée de tampon de dosage et la lecture ultérieure EIE est corrigé pour le facteur de dilution. Des échantillons sont également régulièrement analysés de nouveau si le CV pour les deux puits est&gt; 10%. </li><li> Parce kits CORT EIE sont conçus pour mesurer CORT values dans des échantillons liquides, tels que de la salive ou du plasma, le signal de sortie du logiciel de lecteur de microplaque doit être convertie en quantité d&#39;CORT par unité de poids de poudre de cheveux. La formule suivante convertit la sortie de dosage en mg / dl à pg CORT par les cheveux mg: (A / B) * (C / D) * E * 10000 = F où A = ug / dl à partir de la sortie de test, B = poids (en mg) de cheveux soumis à une extraction, C = vol. (En ml) de methanol ajoutés à la poudre pour cheveux, D = vol. (En ml) de méthanol récupéré à partir de l&#39;extrait et on sèche ensuite vers le bas, E = vol. (En ml) de tampon d&#39;essai utilisée pour reconstituer l&#39;extrait séché, et F = valeur finale de la concentration de CORT de cheveux en pg / mg. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à déclarer.

La procédure de CORT des cheveux décrite ci-dessus est simple à réaliser, est relativement peu coûteux, rend l&#39;utilisation de produits chimiques facilement disponibles, des réactifs et des fournitures, et nécessite un équipement qui, à une exception près, est susceptible d&#39;être présent dans un laboratoire d&#39;analyse typique. L&#39;exception est un appareil de broyage tel qu&#39;un broyeur à billes ou d&#39;un mini-BeadBeater. Nous notons que certains groupes de recherche mâché échantillons de ...

Mesure de CORT dans le plasma, la salive, ou de temps en temps dans l&#39;urine ou les matières fécales a été utilisée comme un indice de stress physiologique depuis la découverte par Selye du rôle de l&#39;axe HPA en une contrainte. Bien que de nombreux articles ont été publiés concernant l&#39;activité HPA à des situations stressantes aiguë, le champ a été entravée par l&#39;absence d&#39;un indice simple et fiable de stress physiologique chronique. Ce problème se pose parce que le plasma et la salive à la fois rendement estimations «ponctuelles» de l&#39;activité HPA qui sont soumis à variation circadienne et peuvent être confondus par des perturbations environnementales. Échantillons urinaires et fécaux donnent des mesures de CORT et / ou élimination des métabolites qui couvrent un nombre d&#39;heures jusqu&#39;à une journée complète dans certains cas. Collection de multiples échantillons en utilisant l&#39;une de ces matrices peuvent fournir un indice composite rugueux de niveaux CORT au fil du temps, cependant, aucune de ces approches fournit un indice vraiment à long terme de l&#39;activité HPA et la réactivité de ce sysouches de stress chronique. Mesure CORT dans les cheveux a commencé à répondre à ce besoin important dans la littérature sur le stress. Les premières études par plusieurs laboratoires ont démontré la présence de CORT dans les cheveux humains mais n&#39;ont pas enquêté si les niveaux de CORT de cheveux ont changé en fonction de la contrainte 2. Comme notre laboratoire s&#39;intéresse depuis de nombreuses années dans la régulation de l&#39;axe HPA singe rhésus par divers facteurs sociaux et comportementaux 3, nous avons décidé d&#39;établir et de valider des méthodes pour l&#39;extraction et l&#39;analyse des cheveux de singe rhésus 4. Basé sur le principe que CORT le sang est lente et continue incorporé dans les cheveux de plus en plus, le but de cette nouvelle méthode a été d&#39;utiliser des niveaux de CORT de cheveux dérivé comme un indice intégrée de l&#39;activité HPA sur des périodes de plusieurs semaines à plusieurs mois. Plusieurs défis méthodologiques ont été rencontrées dans le développement du présent protocole. Premièrement, des études précédentes ont montré que de petites quantités of circulation CORT sont excrétés dans la sueur et le sébum et donc pouvait manteau de l&#39;extérieur de la tige du cheveu 2. Afin d&#39;éliminer ce facteur de confusion potentiel, nous avons développé une procédure de lavage doux qui semble enlever CORT externe tout en ayant un effet minime sur CORT présent dans l&#39;arbre de la croissance des cheveux. Ainsi, les poils de singe soumis à cette procédure (ie deux lavages de 3 min avec de l&#39;isopropanol) ont perdu environ 7-8% de la teneur totale en CORT-cheveux, et un troisième lavage retiré à moins de 1% de plus de stéroïdes de l&#39;échantillon 4. Il semble y avoir plus CORT externe dans les cheveux humains, depuis la même procédure retiré une moyenne de 27% de teneur en CORT totale des échantillons (K. Rosenberg et J. Meyer, non publiées). Comme les cheveux de singe, cependant, un lavage supplémentaire contenait beaucoup moins CORT (environ 7%) que les deux premiers lavages. Par conséquent, les résultats de deux de singe et de cheveux humains soutiennent l&#39;opinion que la plupart (sinon tous) CORT externe peut être retiré tout en conservant une fraction importantetion de CORT sein de la matrice capillaire interne. Deuxièmement, nos études pilotes ont également montré que le broyage des cheveux avant l&#39;extraction de récupération augmenté de manière significative à partir de l&#39;échantillon CORT, vraisemblablement ouvert en rompant la matrice protéique complexe de la tige du cheveu ainsi que l&#39;augmentation de la surface disponible pour la pénétration du solvant. Deux méthodes de broyage différentes ont été développées, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients. Méthode 1, qui utilise un broyeur à billes, présente l&#39;avantage de produire de la poudre fine. Cependant, un broyeur à boulets est un article d&#39;équipement relativement coûteux et, si elle est utilisée avec des pots et des billes de broyage classiques, on est capable de broyage seulement deux échantillons à la fois. De petits échantillons sont également difficiles à traiter à l&#39;aide d&#39;un broyeur à boulets avec des bols de broyage classiques. Méthode 2, qui utilise un BeadBeater, est moins efficace dans sa capacité de meulage. Par conséquent, la récupération de CORT moyenne est d&#39;environ 10% inférieure à l&#39;aide de cette méthode par rapport au broyeur à boulets (données non publiées). D&#39;autre part, un BeadBeaterest beaucoup moins cher qu&#39;un broyeur à billes, 16 à 24 échantillons peuvent être broyés à la fois en fonction du modèle, et le procédé est bien adapté pour de petits échantillons. En raison de la récupération de différentiel mentionné ci-dessus, il est conseillé d&#39;utiliser la même méthode de meulage pour tous les échantillons dans une étude particulière. Une fois que les échantillons de cheveux ont été traités, ils sont extraits avec du methanol et CORT dans les extraits est analysée au moyen d&#39;un kit EIA du commerce sensible et spécifique à l&#39;origine conçu pour mesurer CORT salivaire. Les procédures d&#39;extraction et d&#39;analyse ont été validées en partie en démontrant que des dilutions en série d&#39;extraits des échantillons de cheveux de singe ont donné des lectures de l&#39;EIE qui ressemblent beaucoup aux lectures obtenues à partir des normes de CORT authentiques. Nous avons ensuite montré que CORT de cheveux (en plus de plasma et la salive CORT) était sensible à la majeure stress de la vie d&#39;une réinstallation mandat administratif des singes à de nouveaux quartiers d&#39;habitation 4,5. La présentationt document fournit un compte rendu détaillé des méthodes utilisées en routine dans notre laboratoire à traiter des échantillons de cheveux humains et de singe et d&#39;extraire et d&#39;analyser CORT de ces échantillons.

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	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade isopropanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A451</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade methanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Salivary cortisol assay kits</td>
			<td style="width:116px;">Salimetrics</td>
			<td style="width:119px;">1-3002</td>
			<td>See manufacturer&#39;s kit insert for information on assay sensitivity and specificity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Max Scientific</td>
			<td>10-9151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0-ml XXTuff reinforced microvials</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>330TX</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.2-mm chrome-steel beads</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>11079132c</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10-ml stainless steel grinding jars</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">02.462.0061</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm stainless steel grinding balls</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">05.368.0037</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant activated carbon cartridge</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DTK120R</td>
			<td>Use with Savant chemical trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for 15-ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>S02135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>NC9854190&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MM 200 mixer mill</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Beadbeater 16&#160;</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant DNA Speedvac</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DNA120-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant refrigerated vapor trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>RVT400-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant chemical trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>SCT120</td>
			<td>Alternative to refrigerated vapor trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate washer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate mixer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Multichannel pipetter</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair

Le cortisol, l&#39;hormone du stress (CORT) est lentement incorporé dans la tige du cheveu de plus en plus d&#39;êtres humains, les primates non humains et d&#39;autres mammifères. Nous avons développé et validé une méthode pour l&#39;extraction et l&#39;analyse de CORT cheveux de singe rhésus et ensuite adapté cette méthode pour une utilisation avec des cheveux de cuir chevelu humain. Contrairement aux échantillons CORT &quot;ponctuelles&quot; obtenus à partir du plasma ou de la salive, des cheveux CORT fournit une mesure intégrée de l&#39;activité du système hypothalamique-pituitaire-surrénale (HPA), et donc le stress physiologique, au cours de la période d&#39;incorporation hormone. Parce que les cheveux de cuir chevelu humain croît à un taux moyen de 1 cm / mois, les niveaux CORT obtenus à partir de segments de cheveux plusieurs cm de longueur peuvent potentiellement servir de biomarqueur de stress vécu sur un certain nombre de mois. Dans notre procédé, chaque échantillon de cheveux sont d&#39;abord lavés deux fois dans de l&#39;isopropanol pour éliminer tout CORT de l&#39;extérieur de la tige du cheveu qui a été déposée à partir de la sueur ou le sébum. Après séchage, l&#39;échantillon est broyé en une poudre fine pour briser la matrice protéique du cheveu et augmenter la surface d&#39;extraction. CORT de l&#39;intérieur de la tige du cheveu est extrait dans le methanol, on évapore le méthanol, et l&#39;extrait est reconstitué dans du tampon d&#39;essai. Extrait CORT, ainsi que des normes et des contrôles de qualité, est ensuite analysée à l&#39;aide d&#39;une enzyme disponible dans le commerce immunologique sensible et spécifique (EIE) du kit. Lecture de l&#39;EIE est converti en pg CORT par mg de poids de cheveux poudrés. Cette méthode a été utilisée dans notre laboratoire pour analyser CORT de cheveux chez l&#39;homme, plusieurs espèces de singes macaques, ouistitis, les chiens et les ours polaires. De nombreuses études à la fois de notre laboratoire et d&#39;autres groupes de recherche ont démontré la large applicabilité de CORT de cheveux pour évaluer l&#39;exposition au stress chronique naturel ainsi que les paramètres de laboratoire.

La figure 1 montre l&#39;impression d&#39;un ensemble représentatif d&#39;échantillons de cheveux humains (mâles adultes et des sujets humains de sexe féminin) traitées selon la méthode 2 broyage et d&#39;extraction. Logiciels On a utilisé pour générer la sortie de données et pour adapter une courbe sigmoïde à 4 paramètres aux normes CORT (Figure 2). Les CV entre-bien de cette plaque variaient de 0,01 à 5,73% avec un CV moyen de 1,34% intra-essai. Le CV inter-essai déterm...

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Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Cortisol (CORT) s&#39;accumule dans l&#39;arbre de la croissance des cheveux de l&#39;homme et les primates non humains. Nous décrivons des méthodes pour extraire et analyser CORT de cheveux avec une grande précision et sensibilité. Mesure de cheveux CORT est particulièrement bien adapté pour évaluer le stress chronique sur des périodes de plusieurs semaines à plusieurs mois.

Extraction et analyse de cortisol de l&#39;homme et de singe cheveux

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.1K vues.  University of Massachusetts, Amherst.  Cortisol (CORT) s'accumule dans l'arbre de la croissance des cheveux de l'homme et les primates non humains. Nous décrivons des méthodes pour extraire et analyser CORT de cheveux avec une grande précision et sensibilité. Mesure de cheveux CORT est particulièrement bien adapté pour évaluer le stress chronique sur des périodes de plusieurs semaines à plusieurs mois. 

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Recherche

Biologie

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Une technique non invasive cheveux d&#39;échantillonnage pour obtenir l&#39;ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extraction de prostaglandine et de l&#39;analyse en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

Extraction de Venom et Venom Gland Microdissections des araignées pour protéomique et transcriptomique Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Une nouvelle technique pour l&#39;analyse quantitative de la perte de cheveux chez la souris Utilisation de l&#39;analyse des niveaux de gris

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Flux de travail complet pour l&#39;analyse des histones modifications post-traductionnelles utilisant la spectrométrie de masse Bottom-up: De Histone Extraction à l&#39;analyse des données

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Extraction de chromatine à partir de tissu hépatique chimérique congelé pour l’analyse de l’immunoprécipitation de la chromatine

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

Prélèvement de tissus et extraction d’ARN de l’articulation ostéoarthritique humaine du genou

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

Extraction, marquage et purification de cellules spécifiques à la lignée à partir de follicules antraux humains

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...