Name: in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
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This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

HINWEIS: Die folgenden Verfahren mit Gewebe von Labortieren entsprechen den AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren 2013 und wurden im Vorfeld von der Michigan State University IACUC zugelassen. 1. Gewebepräparation <ol><li> Anesthetize Forschungstier in einer Kammer, die 2,5% Isofluran in Sauerstoff oder indem 3-5 ml Flüssigkeit Isofluran auf ein saugfähiges Material, auf dem Boden der Kammer, so dass eine physikalische Barriere verhindert Tiere vor einem direkten Kontakt mit der Isofluran. Test für die Tiefe der Anästhesie durch Einklemmen der Fußballen. HINWEIS: Die Narkosetiefe wird als angemessen erachtet, wenn es keinen Rückzug Reflex der hinteren Gliedmaßen. Sobald angemessen betäubt, einschläfern die Maus durch Genickbruch </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage und reinigen Bauchhaut mit 70% Ethanol. Verwenden einer Pinzette, um Bauchhaut eingeklemmt an der Mittellinie und verwenden chirurgische Scheren, ein 6 cm Medien machenl Schnitt entlang der Linea alba, interne Verdauungsorgane aussetzen. </li><li> Verwenden stumpfen Pinzette zu finden und setzen den Ileum in das Bauchfell. Schneiden Sie das Ileum / Doppelpunkt Gekröse mit Schere und beginnen Entschlüsselung der Darm. </li><li> Sobald die Länge des Darms ausreichend aufgeklärt, schneiden den Darm distal zum Magen und proximal zum Blinddarm eine Ileum Zubereitung. Für eine Dickdarmvorbereitung, schneiden Sie den Doppelpunkt distal der Blinddarm und proximal des Mastdarms. </li><li> Schnelles Entfernen des Darmsegment und legen Sie sie in ein Becherglas mit DMEM / F12-Medium mit 3 uM Nicardipinhydrochlorid und 1 uM Scopolamin-Hydrochlorid ergänzt auf Eis (im Folgenden als &quot;Medien&quot; bezeichnet). Die Zugabe dieser Inhibitoren erleichtert Mikrodissektion und die anschließende Bildgebung durch Lähmung der Darm glatten Muskulatur. </li><li> Geschnittenen Segmentes von Interesse (zB, Jejunum, Ileum, distalen oder proximalen Kolon) basierend auf den bekannten anatomischen Markierungen. Typischerweise utilize Gewebe vom distalen Ileum oder distale Kolon. Allerdings haben das gleiche Verfahren, um in allen Darmabschnitten zu isolieren, Last und Bild myentericus Neuronen und Gliazellen. </li><li> Entfernen Sie ein kleines Segment (4-6 cm) der gewünschten Darmsegment und in ein Sylgard-beschichtete Petrischale mit Kalt Medien gefüllt. </li><li> Sichern Sie das proximale und distale Ende des Darmsegment mit Insekten Stifte und öffnen Sie das Darmrohr, indem Sie eine gerade, in Längsrichtung des mesenterialen Grenze geschnitten. </li><li> Pin Flachgewebe unter leichter Spannung mit Schleimhautseite nach oben und sorgfältig sezieren entfernt Schleimhautschicht mit feinen Pinzetten (# 5 und # 5/45 funktionieren am besten) und sehr feine Feder Schere. HINWEIS: Die Entfernung der Schleimhaut kann für die ENS ziemlich traumatisch sein, wenn nicht richtig gemacht. Zur Qualitätspräparate, achten Sie darauf, abrupten Entfernung der Schleimhaut durch Schälen oder Abschaben begrenzen. Die beste Vorgehensweise ist es, die Schleimhaut zu heben und unter schneiden mit einer feinen Schere. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Vorbereitungs (etwa 0,5 cm 2) und der Stift in die Abbildungsschalen (4 Ecken mit kreisförmigen Muskelschicht nach oben) auf Eis mit frischen Medien platziert. </li><li> Sorgfältig sezieren entfernt Ringmuskel durch Auseinander necken mit feinen Pinzette, um den Plexus myentericus aus. Vermeiden Sie übermäßige Dehnung. </li><li> Zeigen Bildschale wieder auf Eis und Veränderung Lösung durch frische Medien. </li><li> Planen 2 ml Enzymmischung pro Schale [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), Collagenase Typ II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) in Medium]. </li><li> Gerichte entfernen aus Eis und fügen Sie die Enzymmischung aus Schritt 1.13. </li><li> Geschirr Inkubieren bei RT für 15 min mit 5% CO 2/95% Luft. </li><li> Wash Gewebepräparaten mit Medien 3 Mal und wieder Stift Ecken. </li></ol> 2. Laden Fluo-4 Dye HINWEIS: Vermeiden Sie Photobleichung durch die Zusammenarbeit mit begrenztem Licht beim Umgang mit Fluoreszenzfarbstoffen und Gewebe mit Indikatorfarbstoffe geladen. <ol><li> Bereiten Sie 4 uM Fluo-4 Beladungslösung. <ol><li> 1,5 ml Medium und 1,2 ul einer 250 mM Probenecid Lager in ein 1,5-ul-Aliquot von 4 mM Fluo-4 auf Lager. Bis 50 &amp; mgr; g Fluo-4 AM; 4 mM Fluo-4 Lager wird durch Zugabe von 11,4 &amp; mgr; l Pluronic F-127 (0,25% Cremaphor-EL ergänzt 20% DMSO) hergestellt. </li></ol></li><li> Minipreps Inkubieren in Fluo-4 Aufgabelösung für 45 min in einem dunklen Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Von Inkubator ausziehen und Vorbereitungen mit Medien 3 mal. </li><li> Austauschmedium für Medien, enthaltend 200 uM Probenecid und Inkubation 15 min bei 37 ° C vor der Bilderzeugung. HINWEIS: Probenecid ist ein Medikament, das Multidrug-Resistenz-Transporter in Nervenzellen hemmt. Die Zugabe dieses Medikament hemmt die Fähigkeit der Neuronen Farbstoffe extrudieren und verbessert neuronalen Kennzeichnung. Massenladens von Ca 2+ Indikatorfarbstoffen in Abwesenheit von Probenecid produziert Gliazellen Belastung. Die Zugabe von Probenecid ermöglicht die Visualisierung der neuronalen und glialen Antworten. </li><li> Bereiten Geändert Krebs Puffer. <ol><li> Machen eine modifizierte Krebs-Puffer, so daß die Endkonzentrationen (in mM) der Komponenten sind wie folgt: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, 1 Brenztrauben Säure und 8 Glucose (pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt). In 3 uM Nicardipin und 1 uM Scopolamin zu Muskelkontraktionen während Ca 2+ hemmt Bildgebung und ganze-mount Dissektionen. </li></ol></li></ol> 3. Imaging and Analysis HINWEIS: Verwenden Sie zumindest ein grundbildgebende Anlage mit einer Leuchtstofflampe, Mikroskop, einer Qualität CCD-Kamera und entsprechende Erfassungssoftware. Variieren die Zugabe von anderen Komponenten in Abhängigkeit von der Lichtquelle und der spezifischen Anwendung. Ein Filterrad und Verschluss muss mit einem herkömmlichen Xenon-Bogenlichtquelle verwendet werden. Allerdings sind LED-Lichtquellen und Beleuchtungssysteme erfordern diese Komponenten. <ol><li> Positionieren Sie die recording Kammer unter dem Mikroskop und mit einem Schwerkraftfluss Perfusionssystem mit mehreren beheizten Spritze Reservoirs ein ständiger Perfusionsrate von 2-3 ml / min von 37 ° C Krebs-Puffer. Achten Sie darauf, die Luftblasenbildung sowohl in der Eingangs- und Saugleitung an eine Vakuumfalle verbunden zu verhindern. </li><li> Bringen Sie die gewünschten Plexus in den Fokus unter Hellfeldbeleuchtung. Vermeiden Sie eine Überbelichtung Gewebe, das auf ein Foto, Bleich führen kann. </li><li> Untersuchen Sie die Fluo-4 Belastung innerhalb Ganglien und wählen gesunden Ganglien für die Bildgebung. Ungesunde / beschädigt Ganglien wird Autofluoreszenz oder punktförmige Morphologie aufweisen und sollte nicht für die Bildgebung verwendet werden. </li><li> Sobald Ganglion ausgewählt ist, abzulenken Lichtweg zur Kamera und Livebild mit Bildaufnahme-Software zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Ganglien ist scharf und stellen Bildaufnahmerate und Belichtungszeiten. HINWEIS: Bildaufnahmeraten und Zeiten je nach den Ereignissen Ermittler aufnehmen möchten variieren. Für die meisten Experimente, Bilderwerden traditionell bei 0,5-1 Hz für Gliazellen und bis erworben 2-10 Hz für Neuronen aufgrund glial Ca 2+ Reaktionen sind nicht so schnell wie Ca 2+ Transienten in Neuronen. </li><li> Beginnen Sie experimentieren und zu etablieren Grundaktivität für 30 Sekunden. </li><li> Anwenden vorgewärmten Drogen von Interesse, wie Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der Schwerkraftströmung Perfusionssystem mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml / min. Folgen Anwendung von Agonisten / Antagonisten durch die Rückkehr zu einer normalen Perfusion von Puffer und ermöglichen eine Wäsche / Erholungszeit von mindestens 10 min. HINWEIS: Die Drug Application-Zeiten hängen von der einzelnen Verbindung und experimentelles Design variieren. Im Allgemeinen ist ein 20-30 sec Anwendung Agonist ausreichend G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Neuronen und Gliazellen aktivieren. Jedoch ligandengesteuerten Ionenkanäle (wie Nikotinacetylcholinrezeptoren) erfordern Anwendungszeiten von nicht mehr als 5-10 sec. Weitere Dauer Expositionen verursachen Liganden gesteuerte Ionenkanäle, schnell desensitize. Antagonisten sollte für ca. 3-15 Minuten angewendet werden, um eine vollständige Blockade des Rezeptors Wege zu gewährleisten. Dies ist jedoch eine grobe Verallgemeinerung und Ermittler sollten immer optimieren jede experimentelle Droge in ihrem jeweiligen Paradigma. </li><li> Stoppen Sie die Aufnahme und Ansicht Zeitraffer-Film des Experiments. Sorgfältig ausgewählte Regions of Interest (ROI) mit dem entsprechenden Bildanalyse-Software. </li><li> Verwenden Sie Software, um zu normalisieren und vergleichen ROI Fluoreszenzintensität gegen seine ursprüngliche Ausgangsfluoreszenzwert. Veränderungen normalisierten Fluoreszenz direkt proportional zu den Änderungen der [Ca2 +]. <ol><li> Verwenden einer Modifikation eines Verfahrens unter Verwendung &amp; Delta; F / F = ((F 1 - F 0) / F 0), die vorher beschrieben 26 ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) Hintergrund, wobei F1 die Fluoreszenz bei einer gegebenen Punkt und F0 ist die Grundlinie Fluoreszenz, um die Beurteilung Genauigkeit zu verbessern. Diese Modifikation Hilfsmittelbei der Verringerung der Lärm von Fluoreszenzänderungen in Gewebepräparaten, die Bewegung zu zeigen von der Muskelschicht der Plexus myentericus zugrunde liegen. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

Das enterische Nervensystem (ENS) ist in zwei ganglionated Plexus in der Wand des Verdauungstraktes 1 eingebettet organisiert. Diese intramuskuläre neuronalen Schaltkreise, die Plexus myentericus (MP) und submuköse Plexus (SMP), werden von Neuronen und Glia magensaftresistenten (Abbildung 1) 2 zusammen. Die MP und SMP Regulierung gastrointestinale (GI) Funktionen wie Motilität und epithelialen Absorption und Sekretion bzw. 3. Magensaftresistente Gliazellen sind in unmittelbarer Nähe zu Neuronen im Ganglion aber Populationen von magensaftresistenten Glia befindet Darüber hinaus bestehen innerhalb verbindenden Faserbahnen und außerGangLien Teile der Darmwand 3,4. Magensaftresistente Gliazellen wurden ursprünglich angenommen, dass nur nutritive Unterstützung Neuronen liefern. Doch neuere Studien deuten stark darauf hin, dass Neuron-Glia Interaktionen sind für die ENS-Funktionen 5,6. Zum Beispiel Daten zeigen, dass enterische Glia &quot;hören&quot; neuronale Aktivität 7und Modulieren neuronaler Schaltkreise 6,8, enterischen Neuronen zu schützen vor oxidativem Stress 9 und sind in der Lage zur Erzeugung von neuen enterischen Neuronen in Reaktion auf eine Verletzung 10,11. Die in diesem Beitrag vorgestellten Protokoll bietet eine einfache und robuste Methode, um das komplexe Zusammenspiel von Neuronen und Glia enterische Verwendung von in situ intrazellulären Ca 2+ Bildgebung zu untersuchen. Ca 2+ ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül in erregbaren Zellen und spielt eine wesentliche Rolle bei der synaptischen Signalereignisse im Nervensystem 12. Die Anregung der Neuronen oder Gliazellen ente löst eine Erhebung in cytoplasmatischen Ca 2+ -Konzentration entweder durch Einstrom durch Ca 2+ durchlässige Kanäle oder Ca 2+ -Freisetzung aus intrazellulären Kalziumspeichern. Imaging Ca 2+ Transienten in Neuronen und Glia mit fluoreszierenden Farbstoffen ist eine etablierte und weit verbreitete Technik, um die funktionelle Organisation und Dynamik zu studierendie ENS 13-17. Ca2 + Imaging hat sich gezeigt, ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung intakt GI Gewebesegmente, um die Ausbreitung der Erregbarkeit durch ICC Schrittmacher Netzwerke 18 und Darm der glatten Muskulatur 19,20 aufzuklären sein. Es ermöglicht es Forschern, ein breites Spektrum von physiologischen Parametern zu untersuchen und liefert Informationen über sowohl die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik. Die Zellen können effizient in einem minimal-invasiven Weise unter Verwendung membranpermeable Fluoreszenzindikatoren und optimierte Färbeprotokollen 21 gefärbt werden. Dies bietet die Möglichkeit, eine große Anzahl von Neuronen und Glia ente in funktionell erhaltenen Zubereitungen 14-16,22 überwachen, sowie in vivo 23. Whole-mount Gewebezubereitungen Masse mit einer hochaffinen Ca 2+ Indikatorfarbstoff beladen, wie Fluo-4, das seine Fluoreszenz steigt, wenn Ca 2+ gebunden. Veränderungen in der Fluoreszenz werden durch eine CCD-Kamera und ana zeichnetensiert digital 6. Das Aufkommen von Ca 2+ bot die Gelegenheit, Neuronen und Gliazellen Zell-Interaktionen, Reaktionsfähigkeit auf verschiedene Reize zu überwachen und die Beteiligung dieser Zelltypen im Magen-Darm-Prozesse in Echtzeit. In situ ist Ca2 + Imaging großen Einblick in die Signalmechanismen von enterischen Neuronen und Glia ergab und besitzt mehrere deutliche Vorteile gegenüber Zellkulturmodellen 6,24. Zum einen in situ Vorbereitungen halten die native Matrix-Umgebung von Neuronen und Glia und lassen den Großteil ihrer Verbindungen zu Gewebe intakt Ziel. Zweitens werden die Genetik und die Morphologie der kultivierten ente Glia signifikant verändert im Vergleich zu in vivo 6,24. Drittens werden viele hetero Wechselwirkungen in primären Zellkultur verloren, und diese Grenzen der Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen. Obwohl kultivierten Zellen sind gut für die Untersuchung der fundamentalen Eigenschaften, die usefulne geeignetss für die Untersuchung komplexer Interaktionen zwischen enterischen Gliazellen und Neuronen ist begrenzt. Untersuchung von Neuron-Glia-Wechselwirkung mit einem in situ Ansatz ist physiologisch relevant wie die synaptischen Bahnen intakt 25 bleiben. Im Vergleich zu Zellkulturansätzen, eine in-situ-Ansatz bietet bessere Bedingungen für die systematische Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Gliazellen ente. Darüber hinaus ist die planare Organisation der ganglionated Plexus ganz Montage Präparate ideal für Fluoreszenz-Bildgebung des intrazellulären Ca 2+ Transienten und diese Technik bietet eine einfache Methode zur Bewertung Neuron-Glia-Aktivität im ENS.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Syringe Heater&amp;nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, powder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Fixed-stage microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

Die richtige Anwendung dieser Technik können Forscher die genaue Messung der intrazellulären Ca 2+ [Ca2 +] i-Transienten in enterischen Neuronen und Glia ganz-mount Gewebezubereitungen. Ein repräsentatives Beispiel für einen Agonisten hervorgerufene Ca 2+ Antworten in Gliazellen in einem myentericus Ganglion von der Maus Doppelpunkt bei Video 1 gezeigt. Die folgenden Ergebnisse sind dazu gedacht, einige repräsentative Ergebnisse, die wir unter Verwendung dieses Verfahrens zu illustrieren. Erstens, Figur 2 zeigt die Ergebnisse eines Experiments Messente glial [Ca 2+] i im Ansprechen auf eine Stimulation durch ATP in Meerschweinchen colonic Längsmuskel-Plexus myentericus (LMMP) Zubereitungen. Insbesondere zeigt diese Figur die Methode für die korrekte Analyse der Versuchsprotokoll vor, einschließlich der Umriss des analysierten myentericus Ganglien und Sternchen bezeichnet die Lage des enterischen Neuronen aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen auch illustrate die optimale Dosis von hundert mikromolaren ATP über die Inanspruchnahme des [Ca 2+] i in Meerschweinchen myentericus Gliazellen. Diese Antwort kann verwendet werden, um enterische Glia-Stimulation zu kalibrieren und zu normalisieren Reaktionen auf Reize zu testen. Nächstes Bild 3 verdeutlicht, wie man richtig wählen Regions of Interest (ROIs) umgeben Gliazellen, mit umgebenden gelben Kreisen gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen auch die gewünschten Fluoreszenzänderungen unter basalen Bedingungen und in Reaktion auf pharmakologische Stimuli. Schließlich Abbildung 4 zeigt die räumliche Überlegungen für die Wahl enterischen Gliazellen und Neuronen für [Ca 2+] i Antworten ganz-Mount-Präparaten. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Organisation der ENS. Die ENS enthält zwei Haupt ganglionated Plexus. Der Plexus myentericus zwischen dem l liegtongitudinal und Kreismuskelschichten. Die submuköse Plexus zwischen der Schleimhaut und der Ringmuskelschicht entfernt. Die ENS ist ausschließlich von Neuronen und Glia ente zusammen. Nervenfaserbahnen verbinden den Ganglien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Enteric Glia im Meerschweinchen Kolon Plexus myentericus reagieren auf in situ ATP. (A) Fluo-4 Fluoreszenz in einem myentericus Ganglien unter basalen Bedingungen (durch eine gestrichelte Linie umrandet). Pfeile zeigen auf dicken interganglionic Faserbahnen. (B) Nach der Stimulation mit 100 mmol / L ATP, Gliazellen, aber nicht Nervenzellen, schnell zu erhöhen Fluo-4 Fluoreszenz, die eine Zunahme der [Ca 2+] <sub&gt; i. Beachten Sie, dass reagierenden Zellen klein sind und umgeben die viel größer Neuronen (durch Sternchen markiert dunklen Räumen). (C) Magensaft Glia ATP reagieren in einer Dosis-abhängige Weise mit 1 mmol / L entlocken Maximalreaktionen 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Murine S-100-GFP + Zellen in der Darm Plexus myentericus reagieren auf in situ ATP. (A) S-100-GFP + Gliazellen (grün) in einem Maus Kolon myentericus Ganglien (durch eine gestrichelte Linie umrandet). Sechs Regionen von Interesse (ROIs) umgeben Gliazellen in den Ganglien werden als gelbe Kreise dargestellt. Die Pfeile zeigen die dicken Faserbahnen, die in die Ganglien. Sternchen denote Speicherort 2 enterischen Neuronen. (B) Das gleiche Ganglion zeigt Rhod-2 Fluoreszenz unter basalen Bedingungen. (C) nach Stimulation mit 100 &amp; mgr; mol / l ATP, Gliazellen reagieren mit erhöhter [Ca 2+] i, wie durch erhöhte Rhod- gezeigten 2 Fluoreszenz. (D) Traces auf jede in A-C gezeigt ROI entspricht. (E) Mittelwert der Reaktion (Mittelwert ± SEM) der 6 in D 24 gezeigt ROIs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Die In-situ-Bildgebung von magensaft Neuron-to-Glia-Kommunikation. (A) Repräsentative Bilder (pseudocolored) von einem Ca 2+ Imaging Experiment, bei dem eine ganze-mountHerstellung des Plexus myentericus wurden mit der neuronalen P2X7-Rezeptor-Agonist BzATP (100 &amp; mgr; M, 30 sec) in Frage gestellt. Man beachte, dass die neuronale Agonisten verursacht eine Erhöhung Fluo4 Fluoreszenz in dem Neuron (A &#39;) vor der umgebenden ente glial Zellen (A &quot;). (B) Analyse der Änderung in der Fluoreszenz mit der Zeit in der Glia (blau) und Neuronen (rote ) bei der Anwendung der neuronalen Agonist BzATP. (C), neuronale und gliale antwortet BzATP in normaler Puffer (durchgezogene Linien) und in einem Puffer mit niedrigem Ca 2+ und Mg 2+ (gestrichelte Linien), die neuronale P2X7-Rezeptoren 13 potenzieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Video 1 Agonist hervorgerufene Ca 2+ Reaktion in magensaftresistenten Glia insitu. Dieses Video zeigt eine myentericus Ganglien von der Maus distalen Kolon mit dem Ca 2+ Indikatorfarbstoff Fluo-4 beladen. Die Gliazellen Agonisten, ADP, wird dem Bad zugesetzt, wenn angegeben. ADP ruft eine Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ in enterischen Glia durch den vorübergehenden Anstieg in Fluo-4 Fluoreszenz beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a>

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In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K Aufrufe.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Serie: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Forschung

Biochemie

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurowissenschaften

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

In vivo Visualisierung des Trigeminusganglion der Ratte mit Calciumindikatoren

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

Autor im Rampenlicht: Erforschung peripherer Mechanismen neuropathischer Schmerzen bei Verletzungen des Trigeminusnervs 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

In Situ Ca ²⁺ Imaging des enterischen Nervensystems

Zusammenfassung

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli