This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

HINWEIS: Die folgenden Verfahren mit Gewebe von Labortieren entsprechen den AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren 2013 und wurden im Vorfeld von der Michigan State University IACUC zugelassen. 1. Gewebepräparation <ol><li> Anesthetize Forschungstier in einer Kammer, die 2,5% Isofluran in Sauerstoff oder indem 3-5 ml Flüssigkeit Isofluran auf ein saugfähiges Material, auf dem Boden der Kammer, so dass eine physikalische Barriere verhindert Tiere vor einem direkten Kontakt mit der Isofluran. Test für die Tiefe der Anästhesie durch Einklemmen der Fußballen. HINWEIS: Die Narkosetiefe wird als angemessen erachtet, wenn es keinen Rückzug Reflex der hinteren Gliedmaßen. Sobald angemessen betäubt, einschläfern die Maus durch Genickbruch </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage und reinigen Bauchhaut mit 70% Ethanol. Verwenden einer Pinzette, um Bauchhaut eingeklemmt an der Mittellinie und verwenden chirurgische Scheren, ein 6 cm Medien machenl Schnitt entlang der Linea alba, interne Verdauungsorgane aussetzen. </li><li> Verwenden stumpfen Pinzette zu finden und setzen den Ileum in das Bauchfell. Schneiden Sie das Ileum / Doppelpunkt Gekröse mit Schere und beginnen Entschlüsselung der Darm. </li><li> Sobald die Länge des Darms ausreichend aufgeklärt, schneiden den Darm distal zum Magen und proximal zum Blinddarm eine Ileum Zubereitung. Für eine Dickdarmvorbereitung, schneiden Sie den Doppelpunkt distal der Blinddarm und proximal des Mastdarms. </li><li> Schnelles Entfernen des Darmsegment und legen Sie sie in ein Becherglas mit DMEM / F12-Medium mit 3 uM Nicardipinhydrochlorid und 1 uM Scopolamin-Hydrochlorid ergänzt auf Eis (im Folgenden als &quot;Medien&quot; bezeichnet). Die Zugabe dieser Inhibitoren erleichtert Mikrodissektion und die anschließende Bildgebung durch Lähmung der Darm glatten Muskulatur. </li><li> Geschnittenen Segmentes von Interesse (zB, Jejunum, Ileum, distalen oder proximalen Kolon) basierend auf den bekannten anatomischen Markierungen. Typischerweise utilize Gewebe vom distalen Ileum oder distale Kolon. Allerdings haben das gleiche Verfahren, um in allen Darmabschnitten zu isolieren, Last und Bild myentericus Neuronen und Gliazellen. </li><li> Entfernen Sie ein kleines Segment (4-6 cm) der gewünschten Darmsegment und in ein Sylgard-beschichtete Petrischale mit Kalt Medien gefüllt. </li><li> Sichern Sie das proximale und distale Ende des Darmsegment mit Insekten Stifte und öffnen Sie das Darmrohr, indem Sie eine gerade, in Längsrichtung des mesenterialen Grenze geschnitten. </li><li> Pin Flachgewebe unter leichter Spannung mit Schleimhautseite nach oben und sorgfältig sezieren entfernt Schleimhautschicht mit feinen Pinzetten (# 5 und # 5/45 funktionieren am besten) und sehr feine Feder Schere. HINWEIS: Die Entfernung der Schleimhaut kann für die ENS ziemlich traumatisch sein, wenn nicht richtig gemacht. Zur Qualitätspräparate, achten Sie darauf, abrupten Entfernung der Schleimhaut durch Schälen oder Abschaben begrenzen. Die beste Vorgehensweise ist es, die Schleimhaut zu heben und unter schneiden mit einer feinen Schere. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Vorbereitungs (etwa 0,5 cm 2) und der Stift in die Abbildungsschalen (4 Ecken mit kreisförmigen Muskelschicht nach oben) auf Eis mit frischen Medien platziert. </li><li> Sorgfältig sezieren entfernt Ringmuskel durch Auseinander necken mit feinen Pinzette, um den Plexus myentericus aus. Vermeiden Sie übermäßige Dehnung. </li><li> Zeigen Bildschale wieder auf Eis und Veränderung Lösung durch frische Medien. </li><li> Planen 2 ml Enzymmischung pro Schale [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), Collagenase Typ II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) in Medium]. </li><li> Gerichte entfernen aus Eis und fügen Sie die Enzymmischung aus Schritt 1.13. </li><li> Geschirr Inkubieren bei RT für 15 min mit 5% CO 2/95% Luft. </li><li> Wash Gewebepräparaten mit Medien 3 Mal und wieder Stift Ecken. </li></ol> 2. Laden Fluo-4 Dye HINWEIS: Vermeiden Sie Photobleichung durch die Zusammenarbeit mit begrenztem Licht beim Umgang mit Fluoreszenzfarbstoffen und Gewebe mit Indikatorfarbstoffe geladen. <ol><li> Bereiten Sie 4 uM Fluo-4 Beladungslösung. <ol><li> 1,5 ml Medium und 1,2 ul einer 250 mM Probenecid Lager in ein 1,5-ul-Aliquot von 4 mM Fluo-4 auf Lager. Bis 50 &amp; mgr; g Fluo-4 AM; 4 mM Fluo-4 Lager wird durch Zugabe von 11,4 &amp; mgr; l Pluronic F-127 (0,25% Cremaphor-EL ergänzt 20% DMSO) hergestellt. </li></ol></li><li> Minipreps Inkubieren in Fluo-4 Aufgabelösung für 45 min in einem dunklen Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Von Inkubator ausziehen und Vorbereitungen mit Medien 3 mal. </li><li> Austauschmedium für Medien, enthaltend 200 uM Probenecid und Inkubation 15 min bei 37 ° C vor der Bilderzeugung. HINWEIS: Probenecid ist ein Medikament, das Multidrug-Resistenz-Transporter in Nervenzellen hemmt. Die Zugabe dieses Medikament hemmt die Fähigkeit der Neuronen Farbstoffe extrudieren und verbessert neuronalen Kennzeichnung. Massenladens von Ca 2+ Indikatorfarbstoffen in Abwesenheit von Probenecid produziert Gliazellen Belastung. Die Zugabe von Probenecid ermöglicht die Visualisierung der neuronalen und glialen Antworten. </li><li> Bereiten Geändert Krebs Puffer. <ol><li> Machen eine modifizierte Krebs-Puffer, so daß die Endkonzentrationen (in mM) der Komponenten sind wie folgt: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, 1 Brenztrauben Säure und 8 Glucose (pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt). In 3 uM Nicardipin und 1 uM Scopolamin zu Muskelkontraktionen während Ca 2+ hemmt Bildgebung und ganze-mount Dissektionen. </li></ol></li></ol> 3. Imaging and Analysis HINWEIS: Verwenden Sie zumindest ein grundbildgebende Anlage mit einer Leuchtstofflampe, Mikroskop, einer Qualität CCD-Kamera und entsprechende Erfassungssoftware. Variieren die Zugabe von anderen Komponenten in Abhängigkeit von der Lichtquelle und der spezifischen Anwendung. Ein Filterrad und Verschluss muss mit einem herkömmlichen Xenon-Bogenlichtquelle verwendet werden. Allerdings sind LED-Lichtquellen und Beleuchtungssysteme erfordern diese Komponenten. <ol><li> Positionieren Sie die recording Kammer unter dem Mikroskop und mit einem Schwerkraftfluss Perfusionssystem mit mehreren beheizten Spritze Reservoirs ein ständiger Perfusionsrate von 2-3 ml / min von 37 ° C Krebs-Puffer. Achten Sie darauf, die Luftblasenbildung sowohl in der Eingangs- und Saugleitung an eine Vakuumfalle verbunden zu verhindern. </li><li> Bringen Sie die gewünschten Plexus in den Fokus unter Hellfeldbeleuchtung. Vermeiden Sie eine Überbelichtung Gewebe, das auf ein Foto, Bleich führen kann. </li><li> Untersuchen Sie die Fluo-4 Belastung innerhalb Ganglien und wählen gesunden Ganglien für die Bildgebung. Ungesunde / beschädigt Ganglien wird Autofluoreszenz oder punktförmige Morphologie aufweisen und sollte nicht für die Bildgebung verwendet werden. </li><li> Sobald Ganglion ausgewählt ist, abzulenken Lichtweg zur Kamera und Livebild mit Bildaufnahme-Software zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Ganglien ist scharf und stellen Bildaufnahmerate und Belichtungszeiten. HINWEIS: Bildaufnahmeraten und Zeiten je nach den Ereignissen Ermittler aufnehmen möchten variieren. Für die meisten Experimente, Bilderwerden traditionell bei 0,5-1 Hz für Gliazellen und bis erworben 2-10 Hz für Neuronen aufgrund glial Ca 2+ Reaktionen sind nicht so schnell wie Ca 2+ Transienten in Neuronen. </li><li> Beginnen Sie experimentieren und zu etablieren Grundaktivität für 30 Sekunden. </li><li> Anwenden vorgewärmten Drogen von Interesse, wie Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der Schwerkraftströmung Perfusionssystem mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml / min. Folgen Anwendung von Agonisten / Antagonisten durch die Rückkehr zu einer normalen Perfusion von Puffer und ermöglichen eine Wäsche / Erholungszeit von mindestens 10 min. HINWEIS: Die Drug Application-Zeiten hängen von der einzelnen Verbindung und experimentelles Design variieren. Im Allgemeinen ist ein 20-30 sec Anwendung Agonist ausreichend G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Neuronen und Gliazellen aktivieren. Jedoch ligandengesteuerten Ionenkanäle (wie Nikotinacetylcholinrezeptoren) erfordern Anwendungszeiten von nicht mehr als 5-10 sec. Weitere Dauer Expositionen verursachen Liganden gesteuerte Ionenkanäle, schnell desensitize. Antagonisten sollte für ca. 3-15 Minuten angewendet werden, um eine vollständige Blockade des Rezeptors Wege zu gewährleisten. Dies ist jedoch eine grobe Verallgemeinerung und Ermittler sollten immer optimieren jede experimentelle Droge in ihrem jeweiligen Paradigma. </li><li> Stoppen Sie die Aufnahme und Ansicht Zeitraffer-Film des Experiments. Sorgfältig ausgewählte Regions of Interest (ROI) mit dem entsprechenden Bildanalyse-Software. </li><li> Verwenden Sie Software, um zu normalisieren und vergleichen ROI Fluoreszenzintensität gegen seine ursprüngliche Ausgangsfluoreszenzwert. Veränderungen normalisierten Fluoreszenz direkt proportional zu den Änderungen der [Ca2 +]. <ol><li> Verwenden einer Modifikation eines Verfahrens unter Verwendung &amp; Delta; F / F = ((F 1 - F 0) / F 0), die vorher beschrieben 26 ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) Hintergrund, wobei F1 die Fluoreszenz bei einer gegebenen Punkt und F0 ist die Grundlinie Fluoreszenz, um die Beurteilung Genauigkeit zu verbessern. Diese Modifikation Hilfsmittelbei der Verringerung der Lärm von Fluoreszenzänderungen in Gewebepräparaten, die Bewegung zu zeigen von der Muskelschicht der Plexus myentericus zugrunde liegen. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

Das enterische Nervensystem (ENS) ist in zwei ganglionated Plexus in der Wand des Verdauungstraktes 1 eingebettet organisiert. Diese intramuskuläre neuronalen Schaltkreise, die Plexus myentericus (MP) und submuköse Plexus (SMP), werden von Neuronen und Glia magensaftresistenten (Abbildung 1) 2 zusammen. Die MP und SMP Regulierung gastrointestinale (GI) Funktionen wie Motilität und epithelialen Absorption und Sekretion bzw. 3. Magensaftresistente Gliazellen sind in unmittelbarer Nähe zu Neuronen im Ganglion aber Populationen von magensaftresistenten Glia befindet Darüber hinaus bestehen innerhalb verbindenden Faserbahnen und außerGangLien Teile der Darmwand 3,4. Magensaftresistente Gliazellen wurden ursprünglich angenommen, dass nur nutritive Unterstützung Neuronen liefern. Doch neuere Studien deuten stark darauf hin, dass Neuron-Glia Interaktionen sind für die ENS-Funktionen 5,6. Zum Beispiel Daten zeigen, dass enterische Glia &quot;hören&quot; neuronale Aktivität 7und Modulieren neuronaler Schaltkreise 6,8, enterischen Neuronen zu schützen vor oxidativem Stress 9 und sind in der Lage zur Erzeugung von neuen enterischen Neuronen in Reaktion auf eine Verletzung 10,11. Die in diesem Beitrag vorgestellten Protokoll bietet eine einfache und robuste Methode, um das komplexe Zusammenspiel von Neuronen und Glia enterische Verwendung von in situ intrazellulären Ca 2+ Bildgebung zu untersuchen. Ca 2+ ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül in erregbaren Zellen und spielt eine wesentliche Rolle bei der synaptischen Signalereignisse im Nervensystem 12. Die Anregung der Neuronen oder Gliazellen ente löst eine Erhebung in cytoplasmatischen Ca 2+ -Konzentration entweder durch Einstrom durch Ca 2+ durchlässige Kanäle oder Ca 2+ -Freisetzung aus intrazellulären Kalziumspeichern. Imaging Ca 2+ Transienten in Neuronen und Glia mit fluoreszierenden Farbstoffen ist eine etablierte und weit verbreitete Technik, um die funktionelle Organisation und Dynamik zu studierendie ENS 13-17. Ca2 + Imaging hat sich gezeigt, ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung intakt GI Gewebesegmente, um die Ausbreitung der Erregbarkeit durch ICC Schrittmacher Netzwerke 18 und Darm der glatten Muskulatur 19,20 aufzuklären sein. Es ermöglicht es Forschern, ein breites Spektrum von physiologischen Parametern zu untersuchen und liefert Informationen über sowohl die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik. Die Zellen können effizient in einem minimal-invasiven Weise unter Verwendung membranpermeable Fluoreszenzindikatoren und optimierte Färbeprotokollen 21 gefärbt werden. Dies bietet die Möglichkeit, eine große Anzahl von Neuronen und Glia ente in funktionell erhaltenen Zubereitungen 14-16,22 überwachen, sowie in vivo 23. Whole-mount Gewebezubereitungen Masse mit einer hochaffinen Ca 2+ Indikatorfarbstoff beladen, wie Fluo-4, das seine Fluoreszenz steigt, wenn Ca 2+ gebunden. Veränderungen in der Fluoreszenz werden durch eine CCD-Kamera und ana zeichnetensiert digital 6. Das Aufkommen von Ca 2+ bot die Gelegenheit, Neuronen und Gliazellen Zell-Interaktionen, Reaktionsfähigkeit auf verschiedene Reize zu überwachen und die Beteiligung dieser Zelltypen im Magen-Darm-Prozesse in Echtzeit. In situ ist Ca2 + Imaging großen Einblick in die Signalmechanismen von enterischen Neuronen und Glia ergab und besitzt mehrere deutliche Vorteile gegenüber Zellkulturmodellen 6,24. Zum einen in situ Vorbereitungen halten die native Matrix-Umgebung von Neuronen und Glia und lassen den Großteil ihrer Verbindungen zu Gewebe intakt Ziel. Zweitens werden die Genetik und die Morphologie der kultivierten ente Glia signifikant verändert im Vergleich zu in vivo 6,24. Drittens werden viele hetero Wechselwirkungen in primären Zellkultur verloren, und diese Grenzen der Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen. Obwohl kultivierten Zellen sind gut für die Untersuchung der fundamentalen Eigenschaften, die usefulne geeignetss für die Untersuchung komplexer Interaktionen zwischen enterischen Gliazellen und Neuronen ist begrenzt. Untersuchung von Neuron-Glia-Wechselwirkung mit einem in situ Ansatz ist physiologisch relevant wie die synaptischen Bahnen intakt 25 bleiben. Im Vergleich zu Zellkulturansätzen, eine in-situ-Ansatz bietet bessere Bedingungen für die systematische Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Gliazellen ente. Darüber hinaus ist die planare Organisation der ganglionated Plexus ganz Montage Präparate ideal für Fluoreszenz-Bildgebung des intrazellulären Ca 2+ Transienten und diese Technik bietet eine einfache Methode zur Bewertung Neuron-Glia-Aktivität im ENS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="764">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:391px;">Name</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">BubbleStop Syringe Heater&#160;</td>
			<td style="width:245px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10-4-35-G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">CaCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">C3306</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:245px;">Gibco</td>
			<td style="width:128px;">17101-015</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dispase</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">42613-33-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:245px;">Roboz&#160;</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">DMSO</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">D5879</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fixed-stage microscope</td>
			<td style="width:245px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BX51WI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fluo-4 AM dye</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">F-14201</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Glucose</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">G8270</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Insect pins</td>
			<td style="width:245px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:128px;">Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Andor iQ3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">KCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">P3911</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">MgCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M9272</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S8282</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Neo sCMOS camera</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Neo 5.5 sCMOS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Nicardipine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">N7510</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Perfusion chamber</td>
			<td style="width:245px;">Custom</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:128px;">Model 720</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Pluronic F-127&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">P3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Probenecid</td>
			<td style="width:245px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:128px;">P36400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Scopolamine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S1013&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sutter Lambda DG-4</td>
			<td style="width:245px;">Sutter</td>
			<td style="width:128px;">DG-4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sylgard&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:128px;">184</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Temperature Controller</td>
			<td style="width:245px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:128px;">TC-344C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

Die richtige Anwendung dieser Technik können Forscher die genaue Messung der intrazellulären Ca 2+ [Ca2 +] i-Transienten in enterischen Neuronen und Glia ganz-mount Gewebezubereitungen. Ein repräsentatives Beispiel für einen Agonisten hervorgerufene Ca 2+ Antworten in Gliazellen in einem myentericus Ganglion von der Maus Doppelpunkt bei Video 1 gezeigt. Die folgenden Ergebnisse sind dazu gedacht, einige repräsentative Ergebnisse, die wir unter Verwendung dieses Verfahrens zu illustrieren. Erstens, Figur 2 zeigt die Ergebnisse eines Experiments Messente glial [Ca 2+] i im Ansprechen auf eine Stimulation durch ATP in Meerschweinchen colonic Längsmuskel-Plexus myentericus (LMMP) Zubereitungen. Insbesondere zeigt diese Figur die Methode für die korrekte Analyse der Versuchsprotokoll vor, einschließlich der Umriss des analysierten myentericus Ganglien und Sternchen bezeichnet die Lage des enterischen Neuronen aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen auch illustrate die optimale Dosis von hundert mikromolaren ATP über die Inanspruchnahme des [Ca 2+] i in Meerschweinchen myentericus Gliazellen. Diese Antwort kann verwendet werden, um enterische Glia-Stimulation zu kalibrieren und zu normalisieren Reaktionen auf Reize zu testen. Nächstes Bild 3 verdeutlicht, wie man richtig wählen Regions of Interest (ROIs) umgeben Gliazellen, mit umgebenden gelben Kreisen gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen auch die gewünschten Fluoreszenzänderungen unter basalen Bedingungen und in Reaktion auf pharmakologische Stimuli. Schließlich Abbildung 4 zeigt die räumliche Überlegungen für die Wahl enterischen Gliazellen und Neuronen für [Ca 2+] i Antworten ganz-Mount-Präparaten. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Organisation der ENS. Die ENS enthält zwei Haupt ganglionated Plexus. Der Plexus myentericus zwischen dem l liegtongitudinal und Kreismuskelschichten. Die submuköse Plexus zwischen der Schleimhaut und der Ringmuskelschicht entfernt. Die ENS ist ausschließlich von Neuronen und Glia ente zusammen. Nervenfaserbahnen verbinden den Ganglien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Enteric Glia im Meerschweinchen Kolon Plexus myentericus reagieren auf in situ ATP. (A) Fluo-4 Fluoreszenz in einem myentericus Ganglien unter basalen Bedingungen (durch eine gestrichelte Linie umrandet). Pfeile zeigen auf dicken interganglionic Faserbahnen. (B) Nach der Stimulation mit 100 mmol / L ATP, Gliazellen, aber nicht Nervenzellen, schnell zu erhöhen Fluo-4 Fluoreszenz, die eine Zunahme der [Ca 2+] <sub&gt; i. Beachten Sie, dass reagierenden Zellen klein sind und umgeben die viel größer Neuronen (durch Sternchen markiert dunklen Räumen). (C) Magensaft Glia ATP reagieren in einer Dosis-abhängige Weise mit 1 mmol / L entlocken Maximalreaktionen 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Murine S-100-GFP + Zellen in der Darm Plexus myentericus reagieren auf in situ ATP. (A) S-100-GFP + Gliazellen (grün) in einem Maus Kolon myentericus Ganglien (durch eine gestrichelte Linie umrandet). Sechs Regionen von Interesse (ROIs) umgeben Gliazellen in den Ganglien werden als gelbe Kreise dargestellt. Die Pfeile zeigen die dicken Faserbahnen, die in die Ganglien. Sternchen denote Speicherort 2 enterischen Neuronen. (B) Das gleiche Ganglion zeigt Rhod-2 Fluoreszenz unter basalen Bedingungen. (C) nach Stimulation mit 100 &amp; mgr; mol / l ATP, Gliazellen reagieren mit erhöhter [Ca 2+] i, wie durch erhöhte Rhod- gezeigten 2 Fluoreszenz. (D) Traces auf jede in A-C gezeigt ROI entspricht. (E) Mittelwert der Reaktion (Mittelwert ± SEM) der 6 in D 24 gezeigt ROIs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Die In-situ-Bildgebung von magensaft Neuron-to-Glia-Kommunikation. (A) Repräsentative Bilder (pseudocolored) von einem Ca 2+ Imaging Experiment, bei dem eine ganze-mountHerstellung des Plexus myentericus wurden mit der neuronalen P2X7-Rezeptor-Agonist BzATP (100 &amp; mgr; M, 30 sec) in Frage gestellt. Man beachte, dass die neuronale Agonisten verursacht eine Erhöhung Fluo4 Fluoreszenz in dem Neuron (A &#39;) vor der umgebenden ente glial Zellen (A &quot;). (B) Analyse der Änderung in der Fluoreszenz mit der Zeit in der Glia (blau) und Neuronen (rote ) bei der Anwendung der neuronalen Agonist BzATP. (C), neuronale und gliale antwortet BzATP in normaler Puffer (durchgezogene Linien) und in einem Puffer mit niedrigem Ca 2+ und Mg 2+ (gestrichelte Linien), die neuronale P2X7-Rezeptoren 13 potenzieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Video 1 Agonist hervorgerufene Ca 2+ Reaktion in magensaftresistenten Glia insitu. Dieses Video zeigt eine myentericus Ganglien von der Maus distalen Kolon mit dem Ca 2+ Indikatorfarbstoff Fluo-4 beladen. Die Gliazellen Agonisten, ADP, wird dem Bad zugesetzt, wenn angegeben. ADP ruft eine Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ in enterischen Glia durch den vorübergehenden Anstieg in Fluo-4 Fluoreszenz beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a>

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In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.0K Aufrufe.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Serie: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

Die orale Verabreichung von Rotenon mit einem Gavage und Bildanalyse von Alpha-Synuclein Einschlüsse in den enterischen Nervensystem

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...