This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

REMARQUE: Les procédures suivantes impliquant les tissus des animaux de laboratoire sont conformes aux directives de l&#39;AVMA sur l&#39;euthanasie des animaux de 2013 et ont été approuvés à l&#39;avance par l&#39;Université Michigan State IACUC. 1. Préparation des tissus <ol><li> Anesthésier des animaux de recherche dans une chambre contenant 2,5% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène ou en plaçant 3-5 ml d&#39;isoflurane liquide sur un matériau absorbant sur le sol de la chambre, assurant une barrière physique qui empêche les animaux de tout contact direct avec l&#39;isoflurane. Test de la profondeur de l&#39;anesthésie en pinçant le coussinet plantaire. NOTE: La profondeur de l&#39;anesthésie est jugée appropriée lorsqu&#39;il n&#39;y a pas réflexe de retrait de la patte postérieure. Une fois anesthésié appropriée, euthanasier la souris par dislocation cervicale </li><li> Placez l&#39;animal dans une position couchée et nettoyer la peau abdominale avec 70% d&#39;éthanol. Utilisez une pince pour pincer la peau abdominale ligne médiane et à utiliser des ciseaux chirurgicaux de faire un support de 6 cml incision le long de la ligne blanche pour exposer organes digestifs internes. </li><li> Utilisez une pince contondants pour localiser et d&#39;exposer l&#39;iléon à l&#39;intérieur du péritoine. Couper le mésentère iléal / colon avec des ciseaux et commencer à démêler l&#39;intestin. </li><li> Une fois que la longueur de l&#39;intestin est suffisamment démêlé, intercepte intestin distal de l&#39;estomac et le caecum proximal pour une préparation d&#39;iléon. Pour une grande préparation de l&#39;intestin grêle, le côlon distal couper le caecum et proximale au rectum. </li><li> Retirer rapidement le segment intestinal et le placer dans un bécher avec les médias DMEM / F12 complété avec le chlorhydrate de nicardipine 3 pm et 1 uM chlorhydrate de scopolamine (ci-après dénommé «médias») sur la glace. L&#39;ajout de ces inhibiteurs facilite microdissection avec ensuite une imagerie en paralysant l&#39;intestin muscle lisse. </li><li> segment Cut d&#39;intérêt (par exemple, le jéjunum, de l&#39;iléon, le côlon distal ou proximal) fondée sur des marqueurs anatomiques établies. Typiquement utilize tissu de l&#39;iléon distal ou le côlon distal. Cependant, utiliser la même procédure de base pour isoler, la charge et l&#39;image neurones et de la glie myentériques dans toutes les régions intestinales. </li><li> Retirer un petit segment (4-6 cm) du segment de l&#39;intestin désiré et le placer dans une boîte de Pétri Sylgard revêtu rempli avec les médias réfrigérés. </li><li> Fixez les extrémités proximales et distales du segment intestinal avec des épingles insectes et ouvrir le tube intestinal en faisant une ligne droite, la longueur couper le long de la frontière mésentérique. </li><li> Tissu à plat sous une légère tension avec le côté de la muqueuse et soigneusement disséquer couche muqueuse en utilisant une pince fine (# 5 et # 5/45 travail mieux) et très fines ciseaux à ressort Pin. REMARQUE: La suppression de la muqueuse peut être très traumatisant pour l&#39;ENS se est pas effectué correctement. Pour les préparations de qualité, prendre soin de limiter le retrait brusque de la muqueuse par déroulage ou grattage. La meilleure pratique consiste à soulever la muqueuse et couper en dessous avec des ciseaux fins. </li><li> Coupez le tissu en petits préparations (environ 0,5 cm 2) et broches dans des plats d&#39;imagerie (4 coins avec couche de muscle circulaire vers le haut) placé sur la glace avec des milieux frais. </li><li> Disséquer soigneusement loin muscle circulaire par les taquineries dehors avec des pincettes fines pour exposer le plexus myentérique. Évitez un étirement excessif. </li><li> Placez plat imagerie retour sur la solution de la glace et le changement du milieu frais. </li><li> Préparez 2 ml de mélange d&#39;enzymes par plat [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), la collagénase de type II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) dans les médias]. </li><li> Retirer les plats du glace et ajouter le mélange d&#39;enzymes de l&#39;étape 1.13. </li><li> Incuber à température ambiante pendant plats 15 min avec 5% de CO2 / 95% d&#39;air. </li><li> Préparations de tissus laver les médias 3 fois et coins re-Pin. </li></ol> 2. Chargement Fluo-4 Dye REMARQUE: Eviter photoblanchiment en travaillant avec la lumière limitée lors de la manipulation des colorants fluorescents et des tissus chargés de colorants indicateurs. <ol><li> Préparer 4 uM Fluo-4 solution de chargement. <ol><li> Ajouter 1,5 ml de milieu et 1,2 pi d&#39;une probénécide stocks 250 mM à une aliquote de 1,5 pl de 4 mM Fluo-4 stock. 4 mM de fluo-4 mère est préparée en ajoutant 11,4 pi de Pluronic F-127 (20% dans le DMSO; supplémenté avec 0,25% Cremaphor EL) à 50 pg de Fluo-4 AM. </li></ol></li><li> Incuber préparations Fluo-4 dans la solution de charge pendant 45 min dans un incubateur obscurité à 37 ° C. </li><li> Retirer de l&#39;incubateur et laver préparations médias 3 fois. </li><li> médias d&#39;échange pour les médias contenant 200 uM probénécide et incuber 15 min à 37 ° C avant l&#39;imagerie. NOTE: Le probénécide est un médicament qui inhibe les transporteurs de résistance multidrogue dans les neurones. L&#39;addition de ce médicament inhibe la capacité des neurones à extruder colorants et améliore étiquetage neuronale. Chargement en masse de Ca 2+ colorants indicateurs, en l&#39;absence de probénécide produit principalement gliale chargement de la cellule. L&#39;addition de probénécide permet la visualisation de réponses neuronales et gliales. </li><li> Préparer modification Kretampon de bs. <ol><li> Faire un tampon Krebs modifié de telle sorte que les concentrations finales (en mm) des composants sont comme suit: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, une pyruvique 8 glucose et acide (pH ajusté à 7,4 avec NaOH). Ajouter 3 uM nicardipine et 1 uM scopolamine à inhiber les contractions musculaires durant Ca 2+ imagerie et toute-monter dissections. </li></ol></li></ol> 3. imagerie et d&#39;analyse REMARQUE: Utilisez au moins une plate-forme d&#39;imagerie de base avec une source de lumière fluorescente, microscope, une caméra CCD de qualité et un logiciel d&#39;acquisition appropriée. Varier l&#39;addition d&#39;autres composants en fonction de la source de lumière et de l&#39;application spécifique. Une roue de filtre et l&#39;obturateur doit être utilisé avec une source de lumière classique à arc au xénon. Cependant, les sources de lumière à LED et des systèmes d&#39;éclairage ne nécessitent pas ces composants. <ol><li> Placez le recchambre au microscope ording et en utilisant un système de perfusion à écoulement par gravité avec plusieurs réservoirs de seringue chauffée à établir un taux de perfusion en continu de 3.2 ml / min de 37 ° C tampon Krebs. Assurez-vous que pour éviter la formation de bulles d&#39;air à la fois dans la ligne d&#39;entrée et d&#39;aspiration reliée à un piège à vide. </li><li> Apportez le plexus souhaités dans le foyer sous un éclairage sur fond clair. Évitez les tissus, ce qui peut conduire à la photo blanchiment surexposition. </li><li> Examinez le Fluo-4 loading sein ganglions et sélectionnez ganglions sains pour l&#39;imagerie. Ganglions malsains / endommagées présenteront autofluorescence ou ponctuée morphologie et ne doivent pas être utilisés pour l&#39;imagerie. </li><li> Une fois ganglion est sélectionné, détourner trajet de la lumière à la caméra et obtenir des images en direct avec le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image. Assurez-vous que ganglion est en discussion et régler taux d&#39;acquisition d&#39;image et temps d&#39;exposition. Note: l&#39;image tarifs et les délais d&#39;acquisition varient selon les événements enquêteurs souhaitent enregistrer. Pour la plupart des expériences, des imagessont traditionnellement acquis à 0,5-1 Hz pour les cellules gliales et jusqu&#39;à 2-10 Hz pour les neurones, car les réponses des cellules gliales Ca ne sont pas aussi rapides que Ca 2 + transitoires dans les neurones. </li><li> Commencez expérience et d&#39;établir l&#39;activité de base pendant 30 secondes. </li><li> Appliquer médicaments préchauffées d&#39;intérêt tels que les agonistes et antagonistes des récepteurs utilisant le système de perfusion d&#39;écoulement par gravité à une vitesse de 2-3 ml / min. Suivre application de agonistes / antagonistes en revenant à une perfusion du tampon normal et permettre une période d&#39;au moins 10 min de lavage / récupération. NOTE: Les heures d&#39;application du médicament peut varier en fonction du composé particulier et de la conception expérimentale. En général, une application de 20 à 30 sec agoniste est suffisante pour activer G récepteurs couplés aux protéines dans les neurones et les cellules gliales. Cependant, les canaux ioniques ligand-dépendants (tels que les récepteurs nicotiniques de l&#39;acétylcholine) nécessitent des temps d&#39;application ne dépassant pas 5 à 10 sec. D&#39;autres expositions de durée causeront ligand canaux ioniques à ceux-ci rapidementnsitize. Antagonistes devraient être appliquées pendant environ 3-15 min pour assurer le blocage complet de voies des récepteurs. Cependant, ce est une généralisation grossière et les enquêteurs devraient toujours optimiser tout médicament expérimental dans leur paradigme particulier. </li><li> Arrêter l&#39;enregistrement et vue film accéléré de l&#39;expérience. Sélectionnez soigneusement les régions d&#39;intérêt (de ROI) en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image appropriée. </li><li> Utilisez un logiciel de normaliser et de comparer ROI intensité fluorescente contre sa valeur initiale de base fluorescente. Les variations de fluorescence normalisée sont directement proportionnelles aux variations de [Ca2 +]. <ol><li> Utiliser une modification d&#39;un procédé décrit précédemment en utilisant 26 AF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) de fond, où F1 est la fluorescence à ne importe quel donné Point et F0 est la fluorescence de base, pour améliorer la précision de l&#39;évaluation. Cette modification aidesen réduisant le bruit de la variation de fluorescence dans des préparations de tissus qui présentent mouvement de la couche musculaire sous-jacent le plexus myentérique. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

Le système nerveux entérique (SNE) est organisé en deux plexus ganglionated intégrées dans la paroi du tube digestif 1. Ces circuits de neurones par voie intramusculaire, le plexus myentérique (MP) et la sous-muqueuse plexus (SMP), sont composés de neurones et de cellules gliales entérique (figure 1) 2. Le député et SMP réglementent gastro-intestinaux (GI) des fonctions telles que la motilité intestinale et l&#39;absorption épithéliale et la sécrétion, respectivement 3. Glie entérique sont situés à proximité de neurones dans les ganglions mais les populations de cellules gliales entériques existe également dans l&#39;interconnexion des faisceaux de fibres et des portions extra-ganglionnaires de la paroi intestinale 3,4. Glie entériques on croyait à l&#39;origine pour fournir qu&#39;une aide nutritive pour les neurones. Cependant, des études récentes suggèrent fortement que les interactions neurone-glie sont essentiels pour les fonctions ENS 5,6. Par exemple, les données montrent que les cellules gliales entériques &quot;écouter&quot; à l&#39;activité neuronale 7et de moduler les circuits neuronaux 6,8, protéger les neurones entériques du stress oxydatif et 9 sont capables de générer de nouveaux neurones entériques en réponse à des blessures 10,11. Le protocole présenté dans cette revue technique fournit une méthode simple et robuste pour examiner l&#39;interaction complexe entre les neurones et les cellules gliales entériques utilisant in situ intracellulaire de Ca 2+ imagerie. Ca 2+ est une molécule de signalisation omniprésente dans les cellules excitables et joue un rôle essentiel dans les événements de signalisation synaptiques dans le système nerveux 12. L&#39;excitation des neurones ou des cellules gliales entériques provoque une élévation de la concentration en Ca2 + cytoplasmique soit par influx par Ca2 + Les canaux -permeable ou Ca 2+ libération de réserves de calcium intracellulaire. Imagerie Ca 2 + transitoires dans les neurones et les cellules gliales avec des colorants fluorescents est établi et technique largement utilisée pour étudier l&#39;organisation et la dynamique des fonctionnellel&#39;ENS 13-17. Ca de l&#39;imagerie a été montré pour être un outil important dans l&#39;étude de segments de tissu IG intactes pour élucider la propagation de l&#39;excitabilité à travers les réseaux de stimulateur de la CPI et 18 intestin muscle lisse 19,20. Il permet aux chercheurs de sonder un large éventail de paramètres physiologiques et fournit des informations à la fois sur leur répartition spatiale et dynamique temporelle. Les cellules peuvent être efficacement colorées de manière mini-invasive en utilisant des indicateurs fluorescents membrane perméable et protocoles de coloration optimisés 21. Ceci offre la possibilité de contrôler un grand nombre de neurones et les cellules gliales dans des préparations entériques fonctionnellement conservés 14-16,22, ainsi que in vivo 23. -Monter entiers préparations de tissus sont en vrac chargés avec une haute affinité Ca 2+ colorant indicateur comme Fluo-4 qui augmente sa fluorescence lorsqu&#39;il est lié à Ca 2+. Les variations de fluorescence sont enregistrées par une caméra CCD et analysées numériquement 6. L&#39;avènement de Ca2 + a été l&#39;occasion de surveiller neurones et cellules gliales interactions, la réactivité aux différents stimuli, et la participation de ces types de cellules dans les processus gastro-intestinaux en temps réel. In situ de l&#39;imagerie Ca a donné une grande perspicacité dans les mécanismes de signalisation des neurones entériques et de la glie et possède plusieurs avantages distincts par rapport aux modèles de culture cellulaire 6,24. Tout d&#39;abord, in situ préparations maintenir l&#39;environnement de la matrice native de neurones et cellules gliales et laissent l&#39;essentiel de leurs connexions à cibler tissu intact. Deuxièmement, la génétique et la morphologie des cellules gliales entériques cultivées sont sensiblement modifiées par rapport à 6,24 in vivo. Troisièmement, de nombreuses interactions hétérotypiques sont perdus dans la culture de cellules primaires, ce qui limite l&#39;évaluation des interactions entre les cellules. Bien que les cellules cultivées sont bien adaptés pour l&#39;étude des propriétés fondamentales, leur usefulness pour étudier les interactions complexes entre les cellules gliales et neurones entériques est limité. Enquête interaction neurone-glie en utilisant une approche in situ est plus physiologiquement pertinente que les voies synaptiques demeurent intacts 25. Par rapport aux approches de culture cellulaire, une approche in situ offre de meilleures conditions pour comprendre systématiquement les interactions complexes entre les neurones et les cellules gliales entériques. En outre, l&#39;organisation planaire du plexus ganglionated dans des préparations entières montage est idéal pour l&#39;imagerie de fluorescence de Ca2 + intracellulaire transitoires et cette technique offre une approche simple pour évaluer l&#39;activité des neurones-glie dans l&#39;ENS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="764">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:391px;">Name</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">BubbleStop Syringe Heater&#160;</td>
			<td style="width:245px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10-4-35-G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">CaCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">C3306</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:245px;">Gibco</td>
			<td style="width:128px;">17101-015</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dispase</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">42613-33-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:245px;">Roboz&#160;</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">DMSO</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">D5879</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fixed-stage microscope</td>
			<td style="width:245px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BX51WI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fluo-4 AM dye</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">F-14201</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Glucose</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">G8270</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Insect pins</td>
			<td style="width:245px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:128px;">Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Andor iQ3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">KCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">P3911</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">MgCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M9272</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S8282</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Neo sCMOS camera</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Neo 5.5 sCMOS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Nicardipine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">N7510</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Perfusion chamber</td>
			<td style="width:245px;">Custom</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:128px;">Model 720</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Pluronic F-127&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">P3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Probenecid</td>
			<td style="width:245px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:128px;">P36400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Scopolamine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S1013&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sutter Lambda DG-4</td>
			<td style="width:245px;">Sutter</td>
			<td style="width:128px;">DG-4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sylgard&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:128px;">184</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Temperature Controller</td>
			<td style="width:245px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:128px;">TC-344C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

Bonne utilisation de cette technique permet aux enquêteurs de mesurer avec précision intracellulaire de Ca 2+ [Ca2 +] i transitoires dans les neurones entériques et de la glie dans l&#39;ensemble du montage des préparations de tissus. Un exemple représentatif d&#39;un agoniste-évoqué Ca 2+ réponses dans les cellules gliales dans un ganglion mésentérique du côlon de la souris est montré dans la vidéo 1. Les résultats suivants sont destinés à illustrer certains résultats représentatifs que nous avons obtenus en utilisant cette méthode. Tout d&#39;abord, la figure 2 illustre les résultats d&#39;une expérience de mesure gliale entérique [Ca2 +] i change en réponse à une stimulation par l&#39;ATP à l&#39;intérieur du côlon Guinée porcs longitudinal plexus myentérique musculaire (LMMP préparations). Plus précisément, cette figure montre la méthode pour analyser correctement le protocole expérimental ci-dessus y compris le contour du ganglion et les astérisques indiquant l&#39;emplacement des neurones entériques myentérique analysé. Ces résultats ont également illustrate la dose optimale de cent micromolaire ATP sur la mobilisation de [Ca 2+] i dans les cellules gliales myentérique cochon Guinée. Cette réponse peut être utilisé pour étalonner la stimulation des cellules gliales entériques et normaliser les réponses aux stimuli tester. Ensuite, la Figure 3 met en lumière comment sélectionner correctement régions d&#39;intérêt (ROI) entourant les cellules gliales, montré avec entourant cercles jaunes. Ces résultats montrent également les changements de fluorescence souhaités dans des conditions basales et en réponse à des stimuli pharmacologiques. Enfin, la figure 4 montre les considérations spatiales pour choisir les cellules gliales et neurones entériques pour [Ca2 +] i réponses dans des préparations entières-monter. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Figure 1. Organisation de l&#39;ENS. L&#39;ENS contient deux grands plexus ganglionated. Le plexus myentérique est situé entre le longitudinal couches musculaires et circulaires. Le plexus sous-muqueux est situé entre la muqueuse et la couche musculaire circulaire. L&#39;ENS est exclusivement composée de neurones et cellules gliales entériques. faisceaux de fibres nerveuses relient les ganglions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Figure 2. entérique cellules gliales dans le cochon Guinée colique plexus myentérique répondre à l&#39;ATP in situ. (A) Fluo-4 fluorescence dans un ganglion mésentérique (délimitée par la ligne pointillée) dans des conditions basales. Les flèches indiquent épais faisceaux de fibres interganglionic. (B) Lors de la stimulation avec 100 pmol / L ATP, les cellules gliales, mais pas les neurones, augmentent rapidement Fluo-4 fluorescence indiquant une augmentation de [Ca 2+] <sub&gt; i. Notez que les cellules répondant sont petites et entourent les neurones beaucoup plus grandes (espaces sombres marquées par des astérisques). (C) des cellules gliales entériques répondre à l&#39;ATP d&#39;une manière dose-dépendante avec 1 mmol / L déclencher des réponses maximales 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Figure 3. murin S-100 cellules GFP + dans le plexus myentérique du côlon répondent à l&#39;ATP in situ. (A) S-100-GFP + cellules gliales (vert) dans un ganglion mésentérique du côlon de la souris (décrites par la ligne pointillée). Six régions d&#39;intérêt (ROI) entourant les cellules gliales dans les ganglions sont présentés sous forme de cercles jaunes. Les flèches indiquent des faisceaux de fibres épaisses menant dans le ganglion. Astérisques dLieu de enote de deux neurones entériques. (B) Même ganglion montrant Rhod-2 fluorescence dans des conditions basales. (C) Suite à la stimulation avec 100 pmol / L ATP, les cellules gliales répondent à une augmentation [Ca 2+] i comme indiqué par l&#39;augmentation Rhod- 2 fluorescence. (D) traces correspondant à chaque ROI montré dans l&#39;A-C. (E) en moyenne réponse (moyenne ± SEM) des six ROI indiquées dans D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Figure 4. En imagerie in situ de la communication entérique neurone-glie à. (A) Des images représentatives (de pseudocolored) d&#39;une expérience d&#39;imagerie Ca 2+ où l&#39;ensemble du montagepréparation du plexus myentérique a été contestée avec le neuronale agoniste du récepteur P2X7 BzATP (100 uM, 30 sec). Notez que l&#39;agoniste neuronale entraîne une augmentation de Fluo4 fluorescence dans le neurone (A &#39;) avant les cellules environnantes entériques gliales (A &quot;). (B) Analyse de la variation de fluorescence au cours du temps dans les cellules gliales (bleu) et les neurones (rouge ) après l&#39;application de l&#39;agoniste neuronal, BzATP. (C) et les réponses neuronales gliales dans le tampon de BzATP normale (traits pleins) et dans un tampon contenant faible Ca 2+ et Mg 2+ (lignes en pointillés) de potentialiser récepteurs P2X7 13 neuronales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Vidéo 1. agoniste évoqué Ca 2+ réponse dans les cellules gliales entériques danssitu. Cette vidéo montre un ganglion mésentérique du côlon distal de la souris chargé avec le Ca de l&#39;indicateur colorant, Fluo-4. L&#39;agoniste des cellules gliales, ADP, est ajouté au bain lorsque cela est indiqué. ADP provoque une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca 2+ dans les cellules gliales entériques comme observé par l&#39;élévation transitoire de Fluo-4 fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a>

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In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

De l&#39;imagerie in situ de Ca du système nerveux entérique

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K vues.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Vidéo: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

Administration orale de la roténone en utilisant un Gavage et analyse d&#39;images d&#39;alpha-synucléine inclusions dans le système nerveux entérique

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Recherche

Neurosciences

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp mesures de capacité et de Ca 2 + Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.