We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

واستمرت كل الفئران في والجمعية الأمريكية لاعتماد المختبرات رعاية الحيوان (AAALAC) -accredited منشأة الحيوان في جامعة جونز هوبكنز ويضم وفقا للإجراءات المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) جميع البروتوكولات التجريبية. 1. إعداد التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف لوحة 12-جيدا مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في الفوسفات مخزنة الحل (PBS) لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل طلاء وإضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الحرة المصل (SFM). برم لوحة للتأكد من أن الفيلم من وسائل الاعلام يغطي مساحة بأكملها. </li></ol> 2. العمليات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران الحوامل باستخدام بروتوكول رعاية الحيوان وافقت عليها لجنة المؤسسة تليها خلع عنق الرحم للتأكد من القتل الرحيم كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش وتنظيف المنطقة بطن الفأر مع 70٪الإيثانول. الحفاظ على تقنيات معقمة صارمة لتجنب التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط ومقص لتقديم 0.5 سم 2 شق في منطقة السرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأصابع لقرصة / انتزاع الجلد فوق وتحت شق وسحب بلطف الجلد في اتجاهين متعاكسين (الرأس والذيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط ومقص لإجراء شق الأولي في الغشاء في منطقة السرة. خفض بلطف الغشاء في V-شكل من السرة إلى المبيضين على كل جانب (2 × 1.5 سم 2)، وبالتالي الكشف عن الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقرصة قناة البيض ربط الرحم إلى المبيض ومقص لقرصة قناة البيض على الجانب المبيض، وبالتالي تحرير الرحم من المبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بلطف صعودا الرحم بواسطة قناة البيض مع ملقط وقطع الرحم خال من منطقة المثانة مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الرحم زيادة بنسبة قناة البيض مع ملقط، وقطع قناة البيض مع مقص على الجانب الآخر، وبالتالي الإفراج عن الرحم من م[أوس]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرحم إلى أنبوب 50 مل وإضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة عقيمة مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. PBS يجب أن يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ خلال تشريح الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف الأنبوب لمدة 10 ثانية لغسل الرحم للدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرحم من الأنبوب مع ملقط ووضعه في طبق 10 مل وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة على الجزء العلوي من الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق مع الرحم تحت stereomicroscope. ملاحظة: الخطوات 2،13-2،19 يتطلب stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اثنين من أزواج من ملقط لفتح بلطف الرحم وتشريح خارج الحويصلات السلوي مع الأجنة من الرحم واحدا تلو الآخر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اثنين من أزواج من ملقط لفتح بعناية الكيس الأمنيوسي الذي يحيط الجنين، قرصة الكيس مع واحد ملقط وبلطف إزالته من الجنين، استخدام الملقط أخرى لخفض والافراج عن الكيس الذي يحيط بالجنين من الجنين. إذا كان النمط الجيني المحددة اللازمة، والحفاظ على الكيس السلوي لالتنميط الجيني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين على الجانب واستخدام ملقط لقطع شارع 1 و 2 الثانية قوس خلفي للقلب بين القوس والحقيبة البلعوم (الشكل 1A &#39;&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه بلطف الجنين إلى الجانب الآخر واستخدام ملقط لقطع 1 و 2 قوس خلفي للقلب بين القوس والحقيبة البلعوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقطع المسالك تدفق القلب الذي لا يزال يربط بين شارع 1 و 2 الثانية البلعوم الأقواس إلى الجنين. إزالة الأقواس، والتي لا تزال تعلق معا في شكل فراشة (الشكل 1B)، من الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقرصة والافراج عن 1 أقواس الحادي والبلعوم مما تبقى من القلب المسالك تدفق والمعى الأمامي الأديم الباطن (الشكل 1B &#39;&#39; وأشار مع خط متقطع و*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقرصة والافراج عن الأقواس 2 الثانية البلعوم مما تبقى من القلب تدفق المجاريوالمعى الأمامي الأديم الباطن (الشكل 1B &#39;&#39; وأشار مع خط متقطع و**). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل زوج من الأقواس بشكل منفصل باستخدام ملقط ووضع حد سواء الأقواس في منتصف المعين جيدا. لوحة 1 و 2 ش الثانية البلعوم الأقواس في آبار منفصلة. تأكد من أن الأقواس على اتصال مع الفيلم وسائل الإعلام المضافة في الخطوة 1.2. ومن الأهمية بمكان أن الأقواس غير مشمولة المتوسطة، لأنها تحتاج إلى إجراء اتصالات مع سطح البئر لمرفق خلال هذه الفترة. </li></ol> 3. الحضانة والتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأقواس مطلي في 12 لوحة جيدا في 37 ° C / 5 CO 2٪ لمدة 2 ساعة لالأقواس لنعلق على منطقة السطح جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إضافة 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية SFM أسفل الجانب من البئر. تأكد من أن الأقواس لا تزال تعلق واحتضان O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، والتحقق بصريا أن الأقواس البلعومية وترد وتضيف بلطف 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية SFM أسفل الجانب منحسنا. إذا ظلت الأقواس غير مرتبط والعائمة، وإزالة بلطف وسائل الاعلام مع ماصة دون إزالة الأقواس حتى يتم ترك الفيلم من وسائل الإعلام فقط. استخدام ماصة لوضع الأقواس في منتصف البئر وكرر الخطوة 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة يوميا؛ إضافة ~ 100-200 ميكرولتر من وسائل الإعلام كل يوم 2 لاستبدال أي وسائط تبخرت. ملاحظة: 24-48 ساعة بعد الخلايا المهاجرة تظهر حول قوس وسوف تتكاثر وتهاجر من قوس خلال الأيام المقبلة 5-8. بعد 36-72 ساعة من تشكيل العضلية الضرب ويمكن ملاحظة من 2 الثانية البلعوم القوس (الشكل 2B). ويمكن ملاحظة تكوين myotube مركزيا من 1 الحادي والبلعوم اللدود 3-7 أيام بعد التعلق (الشكل 2A). </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذا الفيديو، ونحن لشرح كيفية عزل والثقافة أولا والبلعوم الثاني أقواس 9.5 أيام أجنة الفئران القديمة. وعابرة، مجزأة الأقواس البلعومية الانتفاخات التي تظهر على الجانب craniolateral الأجنة النامية 9، والتي تحتوي على كتل بناء الخلايا الاصلية قلبية متعددة فعالة لجعل ال?...

خلايا الأديم المتوسط ​​البلعوم تؤدي إلى أجزاء من القلب وعضلات البلعوم. أثناء التطور الجنيني، الخلايا الاصلية القلب متعددة القدرات من الميدان قلبية ثانية تهاجر من الأديم المتوسط ​​البلعوم وتعبئة المسالك تدفق القلب والبطين الأيمن، ويرتبط ارتباطا وثيقا تنميتها غير طبيعية مع مرض القلب الخلقي السبب الرئيسي للالعيوب الخلقية وdefect- الولادة الوفيات المرتبطة في البشر 1-3. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن البلعوم الأديم المتوسط ​​يساهم في رأس العضلات، بالإضافة إلى القلب، مما يجعل من الأديم المتوسط ​​جزء هام من التنمية القلب القحفي 4. وبالتالي، فإن العمليات التنموية بما في ذلك الاستقراء، والانتشار، والتفريق بين الرأس والقلب الأسلاف في الأديم المتوسط ​​البلعوم هي قيد التحقيق النشط 5-7. حتى وقت قريب، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت الخلايا الاصلية القلب تخضع witho التوسعالتحرير التمايز، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم توافر معلومات عن بيئتهم الخلوية. تشير دراستنا الأخيرة أن الأقواس البلعومية بمثابة المكروية لتجديد الأسلاف القلب والعضلات ويمكن تربيتها خارج الجسم الحي على مدى عدة أسابيع 8. يوفر هذا الأسلوب يزدرع فرصة جديدة وفريدة من نوعها لدراسة تطوير الأسلاف القلب والقحفي خارج الحي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2 + Mg2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm petri plates</td>
			<td>Fishersci</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Serum Free Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% BSA (in PBS) &#224; (Invitrogen Cat#. P2489)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>P2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

الأديم المتوسط ​​البلعوم الأجنة النامية يساهم في مناطق واسعة من الرأس وعضلات القلب. قمنا بتطوير طريقة جديدة لدراسة الرأس والسلف القلب تنمية الخلايا مع الأقواس البلعومية (المعروف أيضا باسم الأقواس خيشومي) خارج الحي. باستخدام هذه الطريقة، التي وصفناها في الآونة الأخيرة أن القوس البلعومية الثاني يحتوي الأسلاف القلب تجديد الذات وبمثابة المكروية لتوسيع الأسلاف خلال تطوير الماوس القلب. تبقى الخلايا الاصلية غير متمايزة واسعة داخل القوس، ولكن سرعان ما تصبح العضلية وظيفية تهاجر خارج القوس. ذكرنا أيضا أن أول القوس البلعومية يحتوي الأسلاف العضلات مما أدى إلى myotubes بعد خروجه من القوس. هنا، علينا أن نظهر إجراء تشريح الجسم الحي وخارج ثقافة الأولى والثانية الأقواس البلعومية من تطوير أجنة الفئران. طريقة تمكن واحد لدراسة الرأس والقلب السلف / ديف العضلاتelopment، بما في ذلك cardiomyocyte وتشكيل myotube مركزيا في التفاصيل خارج الحي.

خلال التنمية، الوجه العضلات والقلب الأسلاف يمكن أن تعزى لأنها تتكاثر وتهاجر من شارع 1 و 2 الثانية البلعوم القوس، ليصبح الرأس وعضلات القلب، على التوالي (الشكل 1A، A &#39;و&#39; &#39;). زراعة الأقواس البلعومية يوفر وسيلة فريدة لدراسة القلب والعضلات التنمية ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

ex-vivo-culture-pharyngeal-arches-to-study-heart-muscle-progenitors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.8K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Video: Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

فيفو السابقين الثقافة من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

النخابية ثمرة ثقافة الفحص و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; تقييم هجرة الخلايا المشتقة النخابية-

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

تطبيق التحفيز المزمن لدراسة التعديلات المظهرية الهيكل العظمى والعضلات الهوس الفئران التي يسببها النشاط

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is a pre-requisite for cell-based cardiac therapies and disease modeling. We have recently shown that Id genes are both necessary and sufficient to specify first heart field progenitors during vertebrate development. This differentiation protocol leverages these findings and uses Id1 overexpression in combination with Activin A as potent specifying cues to produce first heart field-like (FHF-L) progenitors. Importantly, resulting progenitors efficiently differentiate (~70&#8211;90%) into ventricular-like cardiomyocytes. Here we describe a detailed method to 1) generate Id1-overexpressing hPSCs and 2) differentiate scalable quantities of cryopreservable FHF-L progenitors and ventricular-like cardiomyocytes.

Here we describe a scalable method, using a simple combination of Activin A and lentivirus-mediated Id1-overexpression, to generate first heart field-like cardiac progenitors and ventricular-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells.

الجيل الأول قلب مثل حقل المتكفل القلب و Cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

السابقين فيفو Perfusion من المشيمة القوارض

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.