We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

Alle Mäuse wurden an einer amerikanischen Vereinigung für die Akkreditierung von Laboratory Animal Care (AAALAC) gehalten -accredited Tierhaltung an der Johns Hopkins University und in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschriebenen Verfahren untergebracht. Das Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) stimmten allen Versuchsprotokolle. 1. Versuchsvorbereitung <ol><li> Mantel 12-Well-Platte mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) für 60 min. </li><li> Entfernen Beschichtungslösung und mit 200 &amp; mgr; l serumfreien Medien (SFM). Wirbeln Platte, um sicherzustellen, dass ein Film von Medien deckt die gesamte Fläche. </li></ol> 2. Chirurgische Verfahren <ol><li> Euthanize schwangeren Mäusen mit Tierpflegeausschuss genehmigten Protokoll der Institution durch Genickbruch folgte, um eine vollständige Euthanasie zu gewährleisten. </li><li> Spray und reinigen Sie die Bauchregion des Maus mit 70%Ethanol. Strikte sterile Techniken, um Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> Verwenden einer Pinzette und Schere, ein 0,5 cm 2 Schnitt am Nabel Region zu machen. </li><li> Benutzen Sie die Finger zu klemmen / greifen die Haut über und unter dem Einschnitt und ziehen Sie die Haut in entgegengesetzte Richtungen (Kopf und Schwanz). </li><li> Verwenden einer Pinzette und Schere, um eine anfängliche Einschnitt in der Membran an der Nabelregion zu machen. Schneiden Sie vorsichtig die Membran in V-Form vom Nabel bis der Eierstöcke auf jeder Seite (2 x 1,5 cm 2), wodurch die Gebärmutter enthüllt. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Eileiter Anschluss der Gebärmutter auf die Eierstöcke und Scheren kneifen, um die Eileiter auf dem Eierstock Seite kneifen, so befreien die Gebärmutter aus dem Eierstock. </li><li> Ziehen Sie vorsichtig die Gebärmutter durch die Eileiter mit der Pinzette und schneiden die Gebärmutter kostenlos von der Blase Region mit einer Schere. </li><li> Ziehen die Gebärmutter weiter durch den Eileiter mit der Zange, und schneiden den Eileiter mit einer Schere an der anderen Seite, wodurch der Uterus Freigabe von der mOuse. </li><li> Übertragen Sie die Gebärmutter auf eine 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 20 ml kaltem sterilem PBS mit Ca 2+ und Mg 2+. PBS muss Ca 2+ und Mg 2+ bei Embryo Dissektion enthalten. </li><li> Schütteln Sie das Röhrchen für 10 Sekunden, um die Gebärmutter für die Blutwäsche. </li><li> Übertragen Sie die Gebärmutter aus dem Rohr mit einer Pinzette und legen Sie sie in einem 10 ml Schale und mit 5 ml kaltem PBS auf der Oberseite der Gebärmutter. </li><li> Die Schale mit der Gebärmutter unter einem Stereomikroskop. Hinweis: Die Schritte 2,13-2,19 erfordert ein Stereomikroskop. </li><li> Verwenden Sie zwei Paar Pinzette vorsichtig öffnen Sie die Gebärmutter und sezieren Fruchtblasen mit Embryonen aus der Gebärmutter einer nach dem anderen. <ol><li> Verwenden Sie zwei Paar Pinzette vorsichtig öffnen Sie die Fruchtblase, die den Embryo umgibt, kneifen den Sack mit einer Pinzette und entfernen Sie sie aus dem Embryo, verwenden Sie die andere Zange zu schneiden und lassen Sie die Fruchtblase aus dem Embryo. Wenn ein bestimmter Genotyp erforderlich, halten Fruchtblase für die Genotypisierung. </li></ol></li><li> Setzen Sie den Embryo auf der Seite und Verwenden einer Pinzette, um die 1 und 2. nach hinten wölben zum Herzen zwischen dem Bogen und dem Schlundtasche (1A &#39;&#39;) geschnitten. </li><li> Flip sanft den Embryo auf die andere Seite und verwenden Sie Zange um den 1. und 2. Bogen nach hinten, um das Herz zwischen dem Bogen und dem Schlundtasche abgeschnitten. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Herzausflusstrakt, die immer noch den Anschluss wird die 1. und 2. Schlundbögen für den Embryo zu schneiden. Entfernen der Bögen, die sich noch in der Form eines Schmetterlings (1B) miteinander verbunden sind, aus dem Embryo. </li><li> Verwenden einer Pinzette zu kneifen und lassen Sie die 1. Schlundbögen von der übrigen Herzausflusstrakt und Vorderdarm Endoderm (1B &#39;&#39; mit gestrichelten Linie angedeutet und *). </li><li> Verwenden einer Pinzette zu kneifen und lassen Sie die 2. Schlundbögen von der übrigen Herzausflusstraktund Vorderdarm Endoderm (1B &#39;&#39; mit gestrichelten Linie und ** angegeben). </li><li> Übertragen jedes Paar von Bögen einzeln mit einer Pinzette und legen Sie beide Bögen in der Mitte des ein gut bezeichnet. Platte 1 und 2. Schlundbögen in getrennten Vertiefungen. Sicherzustellen, daß die Bögen in Kontakt mit dem Film von Medien in Schritt 1.2 gegeben. Entscheidend ist, dass Bögen NICHT von Medium bedeckt, wie sie benötigen, um den Kontakt mit der Oberfläche der Bohrung zur Befestigung in dieser Periode zu machen. </li></ol> 3. Inkubation und Imaging <ol><li> Bogen in der Platte mit 12 Vertiefungen plattiert Inkubieren in 37 ° C / 5% CO 2 für 2 Stunden für Bögen zum Brunnen Oberfläche zu befestigen. </li><li> Vorsichtig mit 200 &amp; mgr; l von 37 ° C SFM an der Seite des Bohrlochs. Stellen Sie sicher, dass Bögen befestigt bleiben und Inkubation O / N. </li><li> Am nächsten Tag, visuell zu überprüfen, dass Schlundbögen befestigt und sanft mit 200 &amp; mgr; l von 37 ° C SFM an der Seite dergut. Wenn Bögen bleiben ungebunden und schwimm, entfernen Medien mit einer Pipette, ohne Bögen, bis nur noch ein Film von Medien überlassen. Verwenden Pipettenspitze auf Bögen in der Mitte der gut und wiederholen Sie Schritt 3.1 zu platzieren. </li><li> Überwachen Sie täglich; fügen ~ 100-200 ul Medium jeden 2. Tag jeder verdampft Medien zu ersetzen. Hinweis: 24-48 h nach der wandernden Zellen erscheinen rund um den Bogen und sich vermehren und wandern von Bogen in den nächsten 5-8 Tage. Nach 36-72 h Bildung schlagen Kardiomyozyten können aus der 2. Schlundbogen (2B) beobachtet werden. Myotube Bildung können vom 1. Schlundbogen 3-7 Tage nach der Befestigung (2A) zu beachten. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In diesem Video zeigen wir, wie man isolieren und Kultur ersten und zweiten Schlundbögen von 9,5 Tage alten Mausembryos. Schlundbögen sind vergänglich, segmentiert Ausbuchtungen, die auf der Seite des kraniolateral entwickelnden Embryonen 9, die multi-potenten Herzvorläuferzellen-Bausteine ​​enthalten, um das Herz während der Embryogenese 10,11 -in zweiten Bögen und Kopfmuskelvorläuferzellen in der ersten Bögen 8 erscheinen . Dissektion der Schlun...

Rachen Mesodermzellen Anlass zu Teilen des Herzens und der Rachenmuskeln. Während der embryonalen Entwicklung, multiHerzVorläuferZellen aus dem zweiten Herzfeld wandern aus dem Rachen Mesoderm und bevölkern die Herzausflusstrakt und rechten Herzkammer und ihre abnorme Entwicklung ist eng mit angeborenem Herzfehler-die häufigste Ursache von Geburtsschäden und Geburtsdefekt zugeordnet bedingten Todesfälle beim Menschen 1-3. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Rachen-Mesoderm trägt zur Muskulatur Kopf, zusätzlich zu Herzen, was die Mesoderm ein kritischer Teil der Herz-Kreislauf-kraniofazialen Entwicklung 4. So sind die Entwicklungsprozesse einschließlich Induktion, Proliferation und Differenzierung von Kopf und Herz-Vorläufern in der Rachen Mesoderm aktiv untersucht 5-7. Bis vor kurzem blieb es unbekannt, ob Herzvorläuferzellen Expansion witho unterziehenut Differenzierung, was teilweise auf das Fehlen von Informationen über ihre zellulären Umgebung. Unsere aktuelle Studie legt nahe, dass Schlundbögen dienen als Mikroumgebung für die Erneuerung der Herz- und Muskelvorläuferzellen und kann über mehrere Wochen 8 ex vivo kultiviert werden. Das Explantat Verfahren bietet eine neue und einzigartige Möglichkeit, die Entwicklung von Herz-Kreislauf-kraniofaziale Vorläuferzellen ex vivo zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2 + Mg2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm petri plates</td>
			<td>Fishersci</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Serum Free Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% BSA (in PBS) &#224; (Invitrogen Cat#. P2489)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>P2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

Die Rachen Mesoderm der sich entwickelnden Embryonen trägt zur breiten Regionen von Kopf und Herzmuskulatur. Wir haben ein neues Verfahren, um Kopf und Herz-Vorläuferzellentwicklung mit Schlundbögen (auch als Kiemenbögen bekannt) ex vivo zu studieren entwickelt. Mit dieser Methode haben wir kürzlich beschrieben, dass die zweite Schlundbogen enthält selbst erneuernden Herzvorläuferzellen und dient als Mikroumgebung für die Expansion der Vorläuferzellen der Maus während der Herzentwicklung. Die Vorläuferzellen bleiben undifferenziert und expansive innerhalb des Bogens, aber schnell funktionelle Kardiomyozyten, als sie aus dem Bogen zu migrieren. Wir haben auch berichtet, dass erste Schlundbogen enthält Muskelvorläuferzellen, die zu Myotuben nach dem Verlassen des arch. Hier zeigen wir, das Verfahren für die Präparation und ex vivo Kultur der ersten und zweiten Schlundbögen aus Entwicklungs Maus-Embryonen. Das Verfahren ermöglicht es, Kopf und Herz-Vorläufer / Muskel dev studierenelopment, einschließlich Kardiomyozyten und Myotuben Bildung im Detail ex vivo.

Während der Entwicklung können Gesichtsmuskel und Herzvorläuferzellen zurückgeführt werden, wie sie sich vermehren und wandern aus dem 1. und 2. Schlundbogen, um Kopf und Herzmuskulatur, bzw. (1A, A &#39;und A&#39; &#39;) zu werden. Kultivieren Schlundbögen bietet eine einzigartige Möglichkeit, um Herz und Muskelentwicklung im Detail ex vivo zu studieren. Nach Präparation und Befestigung der Schlundbögen können von wandernden Zellen angebracht Bögen innerh...

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Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

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