We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

모든 마우스는 존스 홉킨스 대학의 동물 시설을 -accredited 실험 동물 관리의 인증을위한 미국 협회 (AAALAC) 유지 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설명 된 절차에 따라 수용했다. 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는 모든 실험 프로토콜을 승인했다. 1. 실험 준비 <ol><li> 60 분 동안 인산염 완충 용액에 10 % 태아 소 혈청 (FBS) (PBS)와 코트 12 웰 플레이트. </li><li> 코팅 용액을 제거하고 혈청이없는 미디어 (SFM)의 200 μl를 추가합니다. 미디어 막이 전체 표면 영역을 커버하는지 확인 접시 돌리기. </li></ol> 2. 외과 적 치료 <ol><li> 완전한 안락사을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 다음에 기관의 동물 관리위원회 승인 프로토콜을 사용하여 임신 쥐를 안락사. </li><li> 스프레이 70 %와 마우스의 배꼽 지역을 청소에탄올. 오염을 방지하기 위해 엄격한 무균 기술을 유지한다. </li><li> 사용 집게와 가위는 배꼽 부위에 0.5 cm (2) 절개를합니다. </li><li> / 핀치 절개 위 아래 피부를 잡아 부드럽게 반대 방향 (머리와 꼬리)에서 피부를 당겨 손가락을 사용합니다. </li><li> 배꼽 부위에 막에서 초기 절개를 집게와 가위를 사용합니다. 부드럽게하여 자궁을 드러내는, 각면 (2 × 1.5 cm 2)에 난소에 배꼽에서 V 자형의 막을 잘라. </li><li> 따라서 난소에서 자궁을 확보, 난소 측의 난관을 끼지 난소와 가위로 자궁을 연결하는 난관이 끼지 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 집게로 난관에 의한 자궁을 당겨 가위로 방광 지역에서 무료로 자궁을 잘라. </li><li> 집게로 난관에 의해 추가로 최대 자궁를 당기고하여 M에서 자궁을 해제, 다른 측면에서 가위로 난관을 잘라여러개. </li><li> 50 ML 튜브에 자궁을 전송하고 칼슘과 마그네슘 2+와 살균 차가운 PBS의 20 ㎖를 추가합니다. PBS는 배아 해부하는 동안 칼슘과 마그네슘을 2 + 포함해야합니다. </li><li> 조심스럽게 피를 자궁을 씻어 10 초 동안 튜브를 흔들. </li><li> 집게와 튜브에서 자궁을 전송하고 10 ml의 접시에 배치하고, 자궁의 상단에 차가운 PBS 5 mL를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 실체 현미경 하에서 자궁과 접시를 놓습니다. 참고 : 2.13-2.19는 실체 현미경을 필요로 단계. </li><li> 조심스럽게 하나 하나 자궁에서 태아와 양수 주머니를 자궁을 열고 밖으로 해부 포셉 두 쌍을 사용합니다. <ol><li> 조심스럽게 배아를 둘러싸고있는 양막을 열 포셉 두 쌍을 사용하여 하나의 집게로 주머니를 꼬집어 부드럽게 배아에서 분리, 절단 및 배아에서 양막 낭을 해제하기 위해 다른 집게를 사용합니다. 특정 유전자형이 필요한 경우, 유전자형에 대한 양막 낭을 유지. </li></ol></li><li> 측면에있는 배아를 놓고 아치와 인두 주머니 (그림 1A &#39;&#39;) 사이에 마음에 후방 아치 차 1 차 및 2를 잘라 집게를 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 다른 측면으로 배아를 뒤집어 뒤쪽 아치와 인두 주머니 사이의 심장에 1, 2 아치를 잘라 집게를 사용합니다. </li><li> 아직 1 차 및 배아에 2 차 인두 아치를 연결하는 심장 유출 관을 잘라 집게를 사용합니다. 여전히 배아에서 나비 (그림 1B)의 형태로 함께 부착 된 아치를 제거합니다. </li><li> 핀치 집게를 사용하고 나머지 심장 유출 관 및 foregut 내배엽에서 1 차 인두 아치를 해제 (그림 1B &#39;&#39;* 점선으로 표시하고). </li><li> 핀치 집게를 사용하고 나머지 심장 유출 관에서 2 차 인두 아치를 해제및 foregut의 내배엽 (그림 1B &#39;&#39;점선과 **로 표시). </li><li> 별도로 집게를 사용하여 아치의 각 쌍을 전송하고 잘 지정의 중간에 두 아치를 배치합니다. 별도의 우물에 플레이트 1 차와 2 차의 인두 아치. 아치 단계 1.2에 추가 된 미디어의 필름과 접촉에 있는지 확인하십시오. 그것은 그들이이 기간 동안 부착을위한 우물의 표면과 접촉을해야으로 아치가 매체에 의해 포함되지 않는 것이 중요합니다. </li></ol> 3. 보육 및 이미지 <ol><li> 아치 웰 표면적에 첨부 2 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 12 웰 플레이트에 도금 아치를 부화. </li><li> 부드럽게 잘 측면 아래로 37 ° C SFM 200 μl를 추가합니다. 아치가 부착 된 상태를 유지하는지 확인하고 / N을 O를 품어. </li><li> 다음 날, 시각적으로 인두 아치가 연결 부드럽게의 측면 아래로 37 ° C SFM 200 μl를 추가하고 있는지 확인잘. 아치가 부착되지 않은 부동 남아있는 경우, 부드럽게 전용 미디어의 필름이 남아 때까지 아치를 제거하지 않고 피펫 용지를 제거합니다. 잘 단계를 반복 3.1의 중앙에 아치를 배치 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 매일 모니터; 어떤 미디어를 증발 대체하기 위해 모든 2 일 미디어 ~ 100 ~ 200 μl를 추가합니다. 참고 : 셀을 마이그레이션 한 후 24 ~ 48 시간이 아치 주위에 표시하고 증식하고 다음 5-8일을 통해 아치에서 마이그레이션합니다. 구타 심근의 36-72 시간의 형성은 2 차 인두 아치 (그림 2B)에서 관찰 할 수 후. Myotube 형성은 첨부 파일 (그림 2A) 후 1 차 인두 아치 3~7일에서 관찰 할 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 비디오에서는, 우리는 분리하고 9.5 일 이전 마우스 배아의 첫 번째 문화와 두 번째 인두 아치하는 방법을 보여줍니다. 인두 아치, 첫 번째 아치 8에서 두 번째 아치와 머리 근육 전구 세포 -in 배아 10, 11시에 마음을 만들기 위해 멀티 강력한 심장 전구 세포 - 빌딩 블록을 포함하는 개발 배아 (9)의 craniolateral 측면에 표시 부푼를 과도 분할된다 . 인두 ...

인두 중배엽 세포는 심장의 부분과 인두 근육 일으킨다. 배아 개발하는 동안, 두 번째 심장 분야에서 다 능성 심장 전구 세포는 인두 중배엽에서 마이그레이션 및 심장 유출 관과 우심실을 채우고, 그 이상 개발은 밀접하게 출생 결함과 출생 defect-의 선천성 심장 질환의 주요 원인과 관련된 인간 1-3 관련 사망. 최근의 연구는 인두 중배엽은 중배엽 심장 - 두개 안면 개발 4의 중요한 부분 만들기, 마음뿐만 아니라, 근육을 머리에 기여하고 있음을 증명하고있다. 따라서, 유도, 증식 및 인두 중배엽에서 머리와 심장 전구 세포의 분화를 포함하여 개발 프로세스가 활성화 조사 5-7 받고있다. 최근까지, 심장 전구 세포가 팽창 witho를 받아야하는지 여부 알려지지그들의 셀룰러 환경에 대한 정보의 부족으로 인해 부분적 UT 분화. 우리의 최근의 연구는 인두 아치가 심장과 근육 조상의 갱신을위한 미세 역할을하고 몇 주에 걸쳐 8 생체 전 배양 될 수 있음을 시사한다. 이 이식편 방법은 심장 - 두개 안면 전구 세포 생체의 개발을 연구하는 새롭고 독특한 기회를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2 + Mg2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm petri plates</td>
			<td>Fishersci</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Serum Free Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% BSA (in PBS) &#224; (Invitrogen Cat#. P2489)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>P2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

개발 배아의 인두​​ 중배엽은 머리와 심장 근육의 넓은 지역에 기여한다. 우리는 (또한 아가미 아치로 알려진) 인두 아치와 머리와 심장 전구 세포 개발 생체를 연구하는 새로운 방법을 개발했다. 이 방법을 사용하여, 우리는 최근 두 번째 인두 아치 자기 갱신 심장 전구 세포를 포함하고 마우스 심장 개발하는 동안 조상의 확장을위한 미세 역할을한다는 설명했다. 전구 세포는 아치 내부 분화와 광대 남아 있지만 신속하게 아치에서 마이그레이션 할 기능 심근된다. 우리는 또한 첫 번째 인두 아치는 아치를 떠난 후 myotubes에 상승을주는 근육 전구 세포를 포함보고했다. 여기, 우리는 해부와 마우스 배아 개발에서 제 1 및 제 2 인두 아치의 체외 배양 과정을 보여줍니다. 이 방법은 머리와 심장 전구 / 근육 dev에 공부를 할 수 있습니다심근 및 세부 생체에 myotube 형성을 포함 elopment.

그들은 증식과 머리와 심장 근육, 각각 (그림 1A, &#39;과&#39;을 &#39;)되고, 1 차와 2 차의 인두 아치에서 마이그레이션으로 개발하는 동안, 얼굴 근육과 심장 전구 세포는 추적 할 수 있습니다. 인두 아치를 배양하는 세부 생체 심장과 근육 발달을 연구하는 독특한 방법을 제공합니다. 해부 및 인두 아치의 부착 후, 부착 아치에서 마이그레이션 세포 배양의 24 ~ 48 시...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

ex-vivo-culture-pharyngeal-arches-to-study-heart-muscle-progenitors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.7K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.