We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

Tutti i topi sono stati mantenuti a una Associazione americana per l&#39;accreditamento di laboratorio Animal Care (AAALAC) -accredited stabulario dell&#39;Università Johns Hopkins e alloggiati in conformità con le procedure descritte nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. La cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) ha approvato tutti i protocolli sperimentali. Preparazione 1. sperimentale <ol><li> Coat 12-pozzetti con 10% siero fetale bovino (FBS) in tampone fosfato Solution (PBS) per 60 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di rivestimento e aggiungere 200 ml di media siero-free (SFM). Twirl piastra per assicurarsi che un film di supporto copre l&#39;intera superficie. </li></ol> 2. Procedure chirurgiche <ol><li> Euthanize topi in gravidanza che utilizzano il protocollo comitato approvato la cura degli animali dell&#39;istituzione seguita da dislocazione cervicale per garantire la completa eutanasia. </li><li> Spray e pulire la regione pancia del mouse con il 70%etanolo. Mantenere rigorose tecniche sterili per evitare la contaminazione. </li><li> Utilizzare pinze e forbici per rendere l&#39;0,5 cm 2 incisione alla regione ombelicale. </li><li> Usare le dita per pizzicare / afferrare la pelle sopra e sotto l&#39;incisione e tirare delicatamente la pelle in direzioni opposte (testa e coda). </li><li> Utilizzare pinze e forbici per fare un&#39;incisione iniziale nella membrana in corrispondenza della zona dell&#39;ombelico. Tagliare delicatamente la membrana a forma di v dall&#39;ombelico alle ovaie su ciascun lato (2 x 1,5 cm 2), rivelando così l&#39;utero. </li><li> Utilizzare pinze per pizzicare la ovidotto che collega l&#39;utero per l&#39;ovaio e forbici per pizzicare il ovidotto sul lato ovaio, liberando così l&#39;utero dall&#39;ovaio. </li><li> Tirare delicatamente l&#39;utero dal ovidotto con le pinze e tagliare l&#39;utero libera dalla regione della vescica con le forbici. </li><li> Estrarre l&#39;utero ulteriormente dalla oviduct con la pinza, e tagliare il oviduct con le forbici sull&#39;altro lato, liberando così l&#39;utero dal mouse. </li><li> Trasferire l&#39;utero di un tubo da 50 ml e aggiungere 20 ml di freddo PBS sterile con Ca 2 + e Mg 2+. PBS deve contenere Ca 2+ e Mg 2+ durante embrione dissezione. </li><li> Agitare delicatamente il tubo per 10 secondi per lavare l&#39;utero di sangue. </li><li> Trasferire l&#39;utero dal tubo con una pinza e posizionarlo in un piatto da 10 ml e aggiungere 5 ml di PBS freddo sulla parte superiore dell&#39;utero. </li><li> Porre la capsula con l&#39;utero allo stereomicroscopio. Nota: I passaggi 2,13-2,19 richiede uno stereomicroscopio. </li><li> Utilizzare due coppie di pinze per aprire delicatamente l&#39;utero e sezionare fuori cavità amniotiche con embrioni dall&#39;utero uno per uno. <ol><li> Utilizzare due coppie di pinze per aprire con attenzione il sacco amniotico che circonda l&#39;embrione, pizzicare la sacca con una pinza e delicatamente rimuoverlo dal embrione, utilizzare le altre pinze per tagliare e rilasciare il sacco amniotico dall&#39;embrione. Se un genotipo specifico necessario, tenere sacco amniotico per la genotipizzazione. </li></ol></li><li> Posizionare l&#39;embrione sul lato e utilizzare pinze per tagliare il 1 ° e 2 ° arco posteriormente al cuore tra l&#39;arco e la sacca faringea (Figura 1A &#39;&#39;). </li><li> Capovolgere delicatamente l&#39;embrione verso l&#39;altro lato e utilizzare pinze per tagliare il 1 ° e 2 ° arco posteriormente al cuore tra l&#39;arco e la sacca faringea. </li><li> Utilizzare pinze per tagliare il tratto di efflusso cardiaco che ancora collega il 1 ° e 2 ° faringei archi per l&#39;embrione. Rimuovere gli archi che sono ancora attaccati insieme nella forma di una farfalla (Figura 1B), dall&#39;embrione. </li><li> Utilizzare pinze per stringere e rilasciare il 1 ° archi faringei dal rimanente tratto di efflusso cardiaco e foregut endoderma (Figura 1B &#39;&#39; indicata con la linea tratteggiata e *). </li><li> Utilizzare pinze per pizzicare e rilasciare gli archi 2 ° faringei dal rimanente tratto di efflusso cardiacoe foregut endoderma (Figura 1B &#39;&#39; indicata con la linea tratteggiata e **). </li><li> Trasferire ogni coppia di archi separatamente utilizzando una pinza e inserire entrambe le arcate nel bel mezzo di un designato bene. Piastra 1 ° e 2 ° faringei archi in pozzetti separati. Assicurarsi che gli archi sono in contatto con la pellicola di supporto aggiunti nel passaggio 1.2. È fondamentale che gli archi non sono coperti da medium, in quanto hanno bisogno di entrare in contatto con la superficie del pozzetto per attacco durante questo periodo. </li></ol> 3. Incubazione e Imaging <ol><li> Incubare archi placcati in 12-pozzetti in 37 ° C / 5% di CO 2 per 2 ore per archi di allegare alla superficie bene. </li><li> Aggiungere delicatamente 200 ml di 37 ° C SFM lungo il lato del pozzo. Assicurarsi che gli archi rimangono attaccati e incubare O / N. </li><li> Il giorno dopo, controllare visivamente che archi faringei sono attaccati e aggiungere delicatamente 200 ml di 37 ° C SFM lungo il lato dellabene. Se archi restano distaccato e variabile, rimuovere delicatamente i media con una pipetta senza rimuovere archi fino a che solo un film di supporto è a sinistra. Utilizzare puntale per posizionare archi al centro del pozzo e ripetere il punto 3.1. </li><li> Monitorare quotidianamente; aggiungere ~ 100-200 ml di mezzi ogni 2 giorni per sostituire qualsiasi supporto evaporato. Nota: 24-48 ore dopo la migrazione delle cellule appaiono intorno l&#39;arco e si proliferare e migrare da arco per i prossimi 5-8 giorni. Dopo 36-72 ore la formazione di cardiomiociti battendo può essere osservato dal 2 faringeo arco (Figura 2B). Formazione myotube può osservare dal 1 ° arco faringeo 3-7 giorni dopo il collegamento (Figura 2A). </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In questo video, dimostriamo come isolare e cultura prima e seconda faringei archi di 9,5 giorni antichi embrioni di topo. Archi branchiali sono transitori, rigonfiamenti che appaiono sul lato craniolateral di embrioni in via di sviluppo 9, che contengono blocchi cardiaco progenitrici delle cellule di costruzione multi-potenti per rendere il cuore durante l&#39;embriogenesi 10,11 -in secondo arco e progenitori testa muscolari prime arcate 8 segmentati . La di...

Cellule mesoderma faringei danno origine a parti del cuore e dei muscoli faringei. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule progenitrici multipotenti cardiache dal secondo campo cuore migrano dal mesoderma faringeo e popolano il tratto di efflusso cardiaco e ventricolo destro, e il loro sviluppo anormale è strettamente associata con la malattia-cuore congenita principale causa di difetti alla nascita e nascita-difetto decessi correlati nell&#39;uomo 1-3. Recenti studi hanno dimostrato che faringea mesoderma contribuisce a testa muscoli, oltre al cuore, rendendo il mesoderma una parte critica della cardio-craniofacciale sviluppo 4. Così, i processi di sviluppo, tra cui l&#39;induzione, la proliferazione e la differenziazione di testa e del cuore progenitori del mesoderma faringea sono sotto inchiesta attivi 5-7. Fino a poco tempo fa, è rimasto sconosciuto se le cellule progenitrici cardiache subiscono espansione without differenziazione, in parte a causa della mancanza di informazioni sul loro ambiente cellulare. Il nostro recente studio suggerisce che archi branchiali fungono da microambiente per il rinnovo dei progenitori cardiaci e muscolari e possono essere coltivate ex vivo per diverse settimane 8. Questo metodo espianto offre un&#39;opportunità nuova e unica per studiare lo sviluppo dei progenitori cardio-cranio-facciale ex vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2 + Mg2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm petri plates</td>
			<td>Fishersci</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Serum Free Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% BSA (in PBS) &#224; (Invitrogen Cat#. P2489)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>P2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

Il mesoderma faringeo di embrioni in via di sviluppo contribuisce ad ampie regioni della testa e la muscolatura cardiaca. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per studiare la testa e il cuore lo sviluppo delle cellule progenitrici con archi faringei (noto anche come archi branchiali) ex vivo. Utilizzando questo metodo, abbiamo recentemente descritto che il secondo arco faringeo contiene progenitori cardiaci auto-rinnovamento e serve come un microambiente per l&#39;espansione dei progenitori durante lo sviluppo del cuore del mouse. Le cellule progenitrici rimangono indifferenziate ed espansivo dentro l&#39;arco, ma rapidamente diventano cardiomiociti funzionali mentre migrano fuori dell&#39;arco. Abbiamo anche segnalato che il primo arco faringeo contiene progenitori muscolari che danno luogo a miotubi dopo aver lasciato l&#39;arco. Qui, dimostriamo la procedura per la dissezione e ex vivo cultura del primo e del secondo archi faringei da embrioni di topo in via di sviluppo. Il metodo permette di studiare la testa e il cuore progenitore / dev muscolareelopment, compresi cardiomiociti e myotube formazione in dettaglio ex vivo.

Durante lo sviluppo, muscolo e cuore progenitori facciali possono essere rintracciati in quanto proliferano e migrano dal 1 ° e 2 ° arco faringeo, per diventare capo e la muscolatura del cuore, rispettivamente (Figura 1A, A &#39;e A&#39; &#39;). Coltura archi faringei offre un modo unico per lo studio del cuore e sviluppo muscolare in dettaglio ex vivo. Dopo la dissezione e l&#39;attaccamento di archi faringei, cellule che migrano da archi collegati poss...

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Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Cultura Vivo del faringea Archi allo Studio cuore e muscoli Progenitori e la loro nicchia

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.7K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.