We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

Toutes les souris ont été maintenus à une association américaine pour l&#39;accréditation de laboratoire Animal Care (AAALAC) accrédité par l&#39;animalerie de l&#39;Université Johns Hopkins et logés conformément aux procédures décrites dans le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Le Comité de protection et d&#39;utilisation des animaux institutionnel (IACUC) a approuvé l&#39;ensemble des protocoles expérimentaux. 1. Préparation expérimentale <ol><li> Manteau de plaque à 12 puits avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans la solution tamponnée au phosphate (PBS) pendant 60 min. </li><li> Enlever la solution de revêtement et ajouter 200 ul de médias sans sérum (SFM). Twirl plaque pour veiller à ce que un film des médias couvre la totalité de la surface. </li></ol> 2. Interventions chirurgicales <ol><li> Euthanasier les souris enceintes utilisant le protocole approuvé par le Comité de protection des animaux de l&#39;institution suivie par dislocation cervicale pour assurer l&#39;euthanasie complète. </li><li> Pulvériser et nettoyer la région du ventre de la souris avec 70%l&#39;éthanol. Maintenir techniques stériles strictes pour éviter la contamination. </li><li> Utiliser des pinces et des ciseaux pour faire une incision de 0,5 cm 2 à la région du nombril. </li><li> Utilisez les doigts pour pincer / saisir la peau au-dessus et en dessous de l&#39;incision et tirez doucement la peau dans des directions opposées (de tête et de queue). </li><li> Utiliser des pinces et des ciseaux pour faire une incision initiale dans la membrane de la région du nombril. Couper délicatement la membrane en forme de V entre le nombril et les ovaires de chaque côté (2 x 1,5 cm 2), révélant ainsi l&#39;utérus. </li><li> Utilisez une pince pour pincer l&#39;oviducte reliant l&#39;utérus à l&#39;ovaire et des ciseaux pour pincer l&#39;oviducte sur le côté de l&#39;ovaire, libérant ainsi l&#39;utérus de l&#39;ovaire. </li><li> Tirez doucement l&#39;utérus par l&#39;oviducte avec la pince et couper l&#39;utérus libre de la région de la vessie avec des ciseaux. </li><li> Tirer l&#39;utérus en outre par l&#39;oviducte avec la pince, et couper avec des ciseaux l&#39;oviducte de l&#39;autre côté, en libérant ainsi l&#39;utérus de la mouse. </li><li> Transfert de l&#39;utérus à un tube de 50 ml et ajouter 20 ml de PBS froid stérile avec du Ca 2+ et Mg 2+. PBS doit contenir Ca 2+ et Mg 2+ au cours de la dissection embryon. </li><li> Secouer doucement le tube pendant 10 sec pour laver l&#39;utérus de sang. </li><li> Transfert de l&#39;utérus à partir du tube avec une pince et placez-le dans un plat de 10 ml et ajouter 5 ml de PBS froid sur le dessus de l&#39;utérus. </li><li> Placez le plat avec l&#39;utérus sous un stéréomicroscope. Remarque: Les étapes 2.13 à 2.19 nécessite une loupe binoculaire. </li><li> Utiliser deux paires de pinces pour ouvrir doucement l&#39;utérus et disséquer sacs amniotiques embryons avec de l&#39;utérus, un par un. <ol><li> Utilisez deux paires de pinces à ouvrir avec précaution le sac amniotique qui entoure l&#39;embryon, pincer le sac avec une pince et doucement retirer de l&#39;embryon, utiliser les autres pince à couper et à libérer le sac amniotique de l&#39;embryon. Si un génotype spécifique nécessaire, garder sac amniotique pour le génotypage. </li></ol></li><li> Placez l&#39;embryon sur le côté et utiliser une pince pour couper le 1 er et 2 ème arc postérieur au cœur entre la voûte et la poche pharyngée (figure 1A &#39;&#39;). </li><li> Retourner doucement à l&#39;embryon de l&#39;autre côté et utiliser une pince pour couper le 1er et le 2ème arc postérieur au cœur entre la voûte et la poche pharyngée. </li><li> Utilisez une pince pour couper la voie d&#39;éjection cardiaque qui est encore connecte le 1 er et 2 ème pharyngés arches à l&#39;embryon. Retirez les arches, qui sont encore attachés ensemble sous la forme d&#39;un papillon (figure 1B), à partir de l&#39;embryon. </li><li> Utilisez une pince pour pincer et libérer les 1 er pharyngés arches du reste cardiaque voies de sortie et l&#39;endoderme intestin antérieur (figure 1B &#39;&#39; indiqué par une ligne pointillée et *). </li><li> Utilisez une pince pour pincer et de libérer les arches 2 ème pharyngés de la sortie cardiaque restant voieset endoderme intestin antérieur (figure 1B &#39;&#39; indiqué par une ligne pointillée et **). </li><li> Transférer chaque paire d&#39;arcs séparément à l&#39;aide des pinces et placer les deux arches en plein milieu d&#39;un bien désigné. Planche 1 er et 2 ème pharyngés arcs dans des réservoirs séparés. Assurez-vous que les arches sont en contact avec le film de support a été ajoutée à l&#39;étape 1.2. Il est crucial que les arcs ne sont PAS couverts par le milieu, car ils ont besoin de prendre contact avec la surface du puits pour la fixation au cours de cette période. </li></ol> 3. Incubation et imagerie <ol><li> Incuber arcs métallisés dans la plaque à 12 puits à 37 ° C / 5% de CO2 pendant 2 h pour les arcs se fixer à la surface du puits. </li><li> Ajouter délicatement 200 pi de 37 ° C GDF sur le côté du puits. Assurez-vous que les arcs restent attachés et incuber O / N. </li><li> Le lendemain, vérifier visuellement que arcs pharyngés sont attachés et ajouter doucement 200 pi de 37 ° C GDF sur le côté de labien. Si arches restent seules et flottante, retirez délicatement les médias avec une pipette sans enlever arcs jusqu&#39;à ce que seul un film des médias est à gauche. Utilisez pointe de la pipette pour placer des arcs dans le milieu du bien et répétez l&#39;étape 3.1. </li><li> Daily Monitor; ajouter ~ 100-200 pi des médias tous les 2 jours pour remplacer tout support évaporé. Remarque: 24-48 heures après la migration des cellules apparaissent autour de l&#39;arc et proliférer et migrer d&#39;arc au cours des 5-8 prochains jours. Après la formation de 36-72 heures de cardiomyocytes battant peut être observée à partir de la 2 ème pharyngée arc (figure 2B). Formation Myotubes peut être observée à partir des 1 er pharyngée arc 3-7 jours après la fixation (figure 2A). </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dans cette vidéo, nous démontrons comment isoler et de la culture premier et deuxième arcs pharyngés de 9,5 jours anciens embryons de souris. Arcs pharyngés sont transitoires, renflements qui apparaissent sur ​​le côté craniolateral d&#39;embryons en développement 9, qui contiennent plusieurs puissants blocs-de construction des cellules progénitrices cardiaques à faire le cœur pendant l&#39;embryogenèse 10,11 -en deuxième arcs et des progéniteurs tête musculaires dans 8</sup...

cellules du mésoderme pharyngiens donnent lieu à des parties du coeur et les muscles pharyngés. Au cours du développement embryonnaire, multipotentes cellules progénitrices cardiaques de la deuxième champ cardiaque migrent du mésoderme pharyngé et peuplent la voie d&#39;éjection cardiaque et le ventricule droit, et de leur développement anormal est étroitement associée à la maladie du coeur congénitale principale cause de malformations congénitales et la naissance defect- décès liés à l&#39;homme 1-3. Des études récentes ont démontré que le mésoderme pharyngé contribue à la tête de muscles, en plus du coeur, ce qui rend le mésoderme un élément essentiel du développement de la cardio-craniofaciale 4. Ainsi, les processus de développement, y compris l&#39;induction, la prolifération et la différenciation des progéniteurs cardiaques tête et dans le mésoderme pharyngé sont sous enquête active 5-7. Jusqu&#39;à récemment, il est resté inconnu si les cellules progénitrices cardiaques subissent l&#39;expansion withodifférenciation ut, en partie en raison de l&#39;absence d&#39;informations sur leur environnement cellulaire. Notre étude récente suggère que les arcs pharyngiens servent un micro pour le renouvellement de progéniteurs cardiaques et musculaires et peuvent être cultivées ex vivo sur plusieurs semaines 8. Cette méthode des explants offre une occasion nouvelle et unique d&#39;étudier le développement des progéniteurs cardio-craniofaciale ex vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2 + Mg2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm petri plates</td>
			<td>Fishersci</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Serum Free Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% BSA (in PBS) &#224; (Invitrogen Cat#. P2489)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>P2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

Le mésoderme pharyngé d&#39;embryons en développement contribue à de larges régions de la tête et le cœur musculature. Nous avons développé une nouvelle méthode pour étudier tête et le cœur le développement des cellules progénitrices avec des arcs pharyngés (aussi connu comme arcs branchiaux) ex vivo. En utilisant cette méthode, nous avons récemment décrit que le deuxième arc pharyngien contient progéniteurs cardiaques auto-renouvellement et sert un micro pour l&#39;expansion des progéniteurs pendant le développement du cœur de souris. Les cellules progénitrices restent indifférencié et expansive intérieur de l&#39;arc, mais deviennent rapidement cardiomyocytes fonctionnels comme ils migrent hors de l&#39;arche. Nous avons également signalé que le premier arc pharyngien contient progéniteurs musculaires donnant lieu à des myotubes après avoir quitté l&#39;arc. Ici, nous démontrons la procédure pour la dissection et ex vivo culture de premier et deuxième arcs pharyngés de développement des embryons de souris. La méthode permet d&#39;étudier une tête et le cœur géniteur / dev musculaireeloppement, y compris les cardiomyocytes et myotube formation en détail ex vivo.

Au cours du développement, musculaires et cardiaques progéniteurs du visage peuvent être tracées comme ils prolifèrent et migrent de la 1 ère et 2 ème pharyngée arc, à devenir la tête et le cœur musculature, respectivement (figure 1A, A &#39;et A&#39; &#39;). Cultivant arcs pharyngés offre un moyen unique d&#39;étudier le développement du cœur et des muscles en détail ex vivo. Après dissection et la fixation des arcs pharyngés, migration ...

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Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Culture ex vivo des pharyngée Arches pour étudier cardiaques et musculaires progéniteurs et leur niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

ex-vivo-culture-pharyngeal-arches-to-study-heart-muscle-progenitors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.7K vues.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.