We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

Tüm fareler Johns Hopkins Üniversitesi&#39;nde hayvan tesisi -accredited Laboratuar Hayvan Bakımı Akreditasyon Amerikan Derneği (AAALAC) muhafaza ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen prosedürlere uygun olarak muhafaza edildi. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tüm deneysel protokolleri onayladı. 1. Deneysel hazırlanması <ol><li> 60 dakika boyunca fosfat tamponlu çözelti içinde% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) (PBS) ile kaplayın 12 oyuklu plaka. </li><li> Kaplama çözeltisini çıkarın ve serum içermeyen vasat (SFM) ve 200 ul ilave edin. Medya film tüm yüzey alanı kaplamaktadır emin olmak için plakayı döndürdüm. </li></ol> 2. Cerrahi İşlemleri <ol><li> Tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon tarafından takip kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış protokol kullanılarak gebe fareler Euthanize. </li><li> Sprey ve% 70 ile fare göbek bölgesini temizlemeketanol. Kirlenmesini önlemek için sıkı steril teknikler koruyun. </li><li> Kullanım forseps ve makas göbek bölgesinde 0.5 cm 2 kesi yapmak için. </li><li> / Çimdik kesi altında ve üstünde cildi kapmak ve yavaşça zıt yönlerde (baş ve kuyruk) cilt çekmek için parmaklarınızı kullanın. </li><li> Göbek bölgesinde zarında bir başlangıç ​​kesi yapmak için forseps ve makas kullanın. Yavaşça böylece rahim ifşa her bir tarafında (2 x 1.5 cm2) üzerine overlere göbek V-şeklinde membran kesti. </li><li> Böylece yumurtalıktan rahim kurtararak, yumurtalık tarafında yumurtalık çimdik yumurtalık ve rahim makas bağlayan yumurtalık çimdik için forseps kullanabilir. </li><li> Yavaşça forseps yumurtalık tarafından rahim yukarı çekin ve makas ile mesane bölgeden serbest rahim kesti. </li><li> Forseps ile yumurta kanalı tarafından daha fazla yukarı rahim çekin ve böylece m rahim bırakmadan diğer tarafta makas ile yumurtalık kesmekouse. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer rahim ve Ca + 2 ve Mg + 2 ile birlikte, steril, soğuk PBS ve 20 ml ekleyin. PBS embriyo diseksiyonu sırasında Ca 2+ ve Mg 2+ içermelidir. </li><li> Yavaşça kan rahim yıkamak için 10 saniye boyunca tüp sallayın. </li><li> Forseps ile tüp rahim aktarın ve 10 ml çanak koyun ve uterus üzerine soğuk PBS 5 ml ekleyin. </li><li> Bir stereomikroskop altında rahim ile çanak yerleştirin. Not: 2,13-2,19 Stereomikroskopta gerektirir Adımları. </li><li> Yavaşça tek rahim itibaren embriyolar ile amniyotik keseler rahim açıp dışarı incelemek için forseps iki çift kullanın. <ol><li> Dikkatle embriyo çevreleyen amniyotik kese açmak için forseps iki çift kullanın tek forseps ile kesesini tutam ve yavaşça embriyo çıkarın, kesme ve embriyo amniyon kesesi serbest bırakmak için diğer forseps kullanabilir. Belirli bir genotip Gerekirse, genotipleme için amniyotik kese tutun. </li></ol></li><li> Yan embriyo yerleştirin ve kemer ve farenks kesenin (Şekil 1A &#39;&#39;) arasındaki kalbe posterior kemer nd 1 st ve 2 kesmek için forseps kullanabilir. </li><li> Yavaşça diğer tarafa çevirmek embriyo ve posterior kemer ve farenks kese arasındaki kalbe 1. ve 2. kemer kesmek için forseps kullanabilir. </li><li> Hala 1 st ve embriyoya 2. farengeal kemerli bağlanan kalp çıkış yolunu kesmek için forseps kullanabilir. Hala embriyodan, kelebeğin (Şekil 1B) şeklinde birbirine bağlı olan kemerler, çıkartın. </li><li> Çimdik için forseps kullanabilir ve kalan kalp çıkım yolu ve foregut endoderm 1 st farengeal kemerli bırakın (Şekil 1B &#39;* kesik çizgi ile gösterilen ve). </li><li> Çimdik için forseps kullanabilir ve kalan kalp çıkış yolundan 2. faringeal kemerler serbestve foregut endoderm (Şekil 1B &#39;kesikli çizgi ve ** ile gösterilir). </li><li> Ayrı ayrı forseps kullanarak kemerlerin her çift aktarın ve iyi belirlenmiş bir ortasında iki kemerler yerleştirin. Ayrı kuyularda Levha 1. ve 2. faringeal kemerler. Kemerler adım 1.2 ilave medya filmi ile temas içinde olduğundan emin olun. Onlar bu dönemde ek için kuyunun yüzeyi ile temas kurmaya gerek olarak kemerler, orta kapsamında DEĞİLDİR çok önemlidir. </li></ol> 3. Kuluçka ve Görüntüleme <ol><li> Kemerler iyi bir yüzey alanı eklemek için 2 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 içinde 12 oyuklu plaka kemerler inkübe edin. </li><li> Yavaşça kuyunun aşağı tarafı 37 ° C SFM 200 ul ekleyin. Kemerler bağlı kalır emin olun ve / N O kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Ertesi gün, görsel farengeal kemerler takılı ve hafifçe aşağı tarafı 37 ° C SFM 200 ul ekleyin olduğunu kontrol ediniyi. Kemerler bekâr ve yüzen kalırsa, yavaşça sadece medyanın film kalana kadar kemerleri çıkarmadan bir pipet ile ortamı çıkarın. Kuyu ve tekrar adım 3.1 ortasına kemerler yerleştirmek için pipet kullanın. </li><li> Günlük Monitör; herhangi bir medya buharlaştırılarak yerine 2 günde medya ~ 100-200 ul ekleyin. Not: hücrelerini göç sonra 24-48 saat kemer etrafında görünür ve çoğalırlar ve önümüzdeki 5-8 gün içinde kemer göç edecektir. Dayak kardiyomiyositlerde 36-72 saat oluşumu 2. faringeal kemer (Şekil 2B) den görülebilir sonra. Miyotüp formasyonu eki (Şekil 2A) sonra 1 st farenks kemer 3-7 gün görülebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu videoda, biz izole etmek ve 9.5 gün eski fare embriyolarının ilk kültür ve ikinci yutak kemerler nasıl gösterilmektedir. Farengeal kemerler, ilk kemerlerin 8 ikinci kemerli ve baş kas atalarıdır -in embriyogenez 10,11 sırasında kalbi yapmak için çok güçlü kalp progenitör hücrelerin bina blokları içeren gelişmekte olan embriyoların 9&#39;un craniolateral tarafında görünen çıkıntı geçici segmente edilmiş . Yutak kemerlerin diseksiyonu gelişmiş fare embriyo diseksiyon becerileri gerektirir. Kemerler başarıyla bu adım adım protokolü kullanılarak disseke ve önceden kaplanmış kuyuları aktarıldıktan sonra, bu kemerler alt bölgeye eklemek önemlidir. Bu protokol,% 10 FBS ile geri ceket kuyu gösterilmiş olmakla birlikte diğer kaplama malzemeleri (Matrigel, jelatin, fibronektin gibi) ve serum conta kullanılabilir, bağlanma ve kemerlerin&gt;% 75 büyüme elde SFM kültüre edilmesini, takibenadencilik ortamı. yutak kemerler geliştirme sırasında yapıların çok sayıda için primordia olarak hizmet vermektedir. Yutak kemerlerin ilk oluşumu (8 gün farelerde döllenme sonrası) sonra, TBM PA2 genişletmek ve böylece kalbi sürdürmek için gerekli hücrelerin tedarik TBM yenilenebilir bir kaynak olarak hizmet veren, kalp hücrelerine ayırt yerde kalp çıkış yolu göç Büyüme. Yutak kemerler zamansal gelişim yapıları (E8-11.5) ve çıkış yollarına TBM&#39;lerinin göçü yaklaşık E8-E10 meydana gelir) gibi bu tekniğin bazı sınırlamaları getiriyor. TBM çalışmalar için, biz, E9-10 arasında disseke faringeal kemerler kullanmanızı öneririz bu aşamada her PO2 yaklaşık 5-800 RFP + hücreler (Mesp1 linage iz) içerirler. Floresan etiketleme ile bu ex vivo kültür kardiyomiyositlerde veya miyotüpler i yenerek içine gelişmekte atalarıdır ve farklılaşma izlemek için bize izin verirn gerçek zamanlı. Buna ek olarak, bu ex vivo kültür sistemi, mevcut Cre / loxP çizgileri kullanılarak kalp / kas progenitör hücre çoğalması, göçü ve farklılaşmasını etkileyen hücre özerk ve mikro-çevresel faktörlerin rol incelemek için kullanılabilir. Bunun gibi, bu sistem kalp / kas oluşumu ve hastalığın daha iyi anlaşılmasına yol açabilir kalp / kas progenitör-niş çalışmaları kolaylaştırmak bekleniyor.

Faringeal mezoderm hücreleri kalp parça ve yutak kas yol açmaktadır. Embriyonik gelişim sırasında, ikinci kalp alanından multipotent kalp progenitör hücrelerin yutak mezodermden göç ve kardiyak çıkış yolunu ve sağ ventrikül doldurmak ve onların anormal gelişim yakından doğum kusurları ve doğum defect- konjenital kalp hastalığı lideri nedeni ile ilişkilidir İnsanlarda 1-3 benzer ölümler. Son çalışmalar yutak mezoderm mezoderm kardiyo-Kraniofasiyal gelişim 4 kritik bir parçası yaparak, kalp ek olarak, kas kafa katkıda bulunduğunu göstermiştir. Böylece, indüksiyon, çoğalması ve yutak mezoderm baş ve kalp atalarıdır farklılaşma dahil gelişimsel süreçleri etkin soruşturma 5-7 altındadır. Yakın zamana kadar, kardiyak progenitör hücreler genişleme witho tabi olup olmadığı bilinmeyen kaldıkendi cep çevre hakkında bilgi eksikliği kısmen ut farklılaşma. Bizim yeni bir çalışma faringeal kemerler kalp ve kas atalarıdır yenilenmesi için bir mikroçevresinin olarak hizmet ve birkaç hafta üzerinde 8 ex vivo kültüre olabileceğini düşündürmektedir. Bu eksplant yöntemi kardiyo-kraniofasial atalarıdır ex vivo gelişimini incelemek için yeni ve eşsiz bir fırsat sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Ca&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; + Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri plates</td><td>Fishersci</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum Free Media:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Cellgro</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>N2-SUPPLEMENT</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27-retinoic acid</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489)</td><td>Life Sciences</td><td>P2489</td><td></td></tr><tr><td>100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

Gelişmekte olan embriyoların faringeal mezoderm baş ve kalp kaslarının geniş bölgelere katkıda bulunur. Biz (aynı zamanda brankiyal kemerli olarak da bilinir) farenks kemerli baş ve kalp progenitör hücre gelişimini ex vivo çalışma için yeni bir yöntem geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak, biz son zamanlarda ikinci faringeal kemer kendini yenileyen kalp atalarıdır içeren ve fare kalp gelişimi sırasında atalarıdır genişletilmesi için bir mikro olarak hizmet ettiğini tarif var. progenitör hücrelerin kemerin içinde farklılaşmamış ve geniş kalır, ancak hızlı bir şekilde kemer dışarı göç gibi fonksiyonel kardiyomiyositler olur. Biz de ilk faringeal kemer kemer ayrıldıktan sonra miyotüplerinin sebebiyet veren kas atalarıdır içerdiğini bildirdi. Burada, biz diseksiyon ve fare embriyoları geliştirmekten birinci ve ikinci faringeal kemerler ex vivo kültür prosedürü göstermektedir. yöntem baş ve kalp progenitör / kas dev incelemek için birini sağlayankardiyomiyosit ayrıntılı ex vivo miyotüp formasyonu da dahil olmak üzere elopment.

Onlar çoğalır ve baş ve kalp kas, sırasıyla (Şekil 1A, A &#39;ve A&#39; &#39;) olmak üzere, 1. ve 2. faringeal kemer göç olarak gelişimi sırasında, yüz kası ve kalp atalarıdır izlenebilmektedir. Yutak kemerlerin Kültürleme detaylı ex vivo kalp ve kas gelişimini incelemek için benzersiz bir yol sunuyor. Diseksiyon ve yutak kemerlerin bağlanması sonrasında, ekli kemerli göç hücrelerin kültür 24-48 saat içinde görülebilir. Kültür miyotüp oluşumu 3 gün içinde 1. farenks kemerler ve 2. faringeal kemerler gelen kardiyomiyosit oluşumu (Şekil 2A ve 2B) den izlenebilir. Kardiyomiyosit oluşumu görsel olarak kendiliğinden değiştiren hücrelerin ve / veya belirli bir kardiyomiyosit markerlerinin analizi kümeleri sözleşme ile teyit edilebilir (örneğin, Kardiyak troponin). Myotu/ yüz kas oluşumu görsel olarak uzun bir kendiliğinden seğirmesi hücreler ve / veya belirli bir kas belirteçleri (örneğin, Myogenin) analizi (uzunluğu 500 um kadar) uzatılmış gözlemlenebilmektedir edilebilir. Farelerde CRE-lox sistemi kullanarak, mezoderm döl ex vivo kültür (Şekil 2A &#39;ve 2B&#39;) döneminde CRE ifade üzerine floresan gazetecilere tarafından izlenebilmektedir. Benzer şekilde, bu yöntem ile bu ilgi, belirli bir genin koşullu elendikçe veya daha önce tarif edildiği gibi başka şekilde 8 erken dönemde embriyo öldürücülüğü yol açacak olan, aşırı ifade edildiği döl kaderini incelemek mümkündür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52876/52876fig1.jpg" /> Şekil 1: Fare embriyo (Mesp1 CRE, AI9) 9.5 gün sonra döllenme (E.9.5 </strong<html> &gt;). (A) embriyonun tarafına bıraktı. (PA: Faringeal Arch, OT: Çıkım yolu, LV.:. Sol ventrikül (A &#39;) Mesp1 linage-iz; RFP Mesp1 + hücreleri ve bunların soyu işaretleri Ok belirten RFP + OT ile sürekli PA2 içinde Mesp1-soy. (A &#39;&#39;) kesikli çizgi kalbe PA1 ve PA2 posterior kesmek için nereye işaret embriyo diseksiyonu sonra (B) Kelebek gibi sağ ve sol PA1 ve pA2 FE.:. Önbağırsak endoderm (B. &#39;), RFP işaretleri döl Mesp1 . PA1 ve PA2 (B &#39;&#39;) * ve ** nerede kesip OT ve FE Ölçek bardan PA1 ve pA2 serbest gösterir kesikli çizgiler ile birlikte.:. 500 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52876/52876fig1large.jpg" target="_blank">tıklayınız bu daha büyük bir versiyonunu görmek için rakam.</a> / 52.876 / 52876fig2.jpg &quot;upload /&gt; Şekil 2:. Kültür farengeal kemerler (A) Kültür PA1 (kültür 3 gün). (A &#39;) RFP PA1 içinde Mesp1 döl işaretler. Oklar ve *, erken miyotüp oluşumunu göstermektedir. (A &#39;&#39;) PA1 içinde RFP ifade Yerleşimi. (B) Yetiştirme PO2 (kültür 8 gün). (B &#39;) RFP işaretleri PA2 olarak soy Mesp1. Oklar ve ** (Shenje ark. 8 değiştirilmiş) kardiyomiyositlerin alanını yenerek göstermektedir. (B &#39;), PA2 RFP ifade Kaplama. Ölçek çubuğu:. 250 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52876/52876fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

ex-vivo-culture-pharyngeal-arches-to-study-heart-muscle-progenitors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.8K Görüntüleme.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Video: Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Gelişim Biyolojisi

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Mühendislik

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart disease. To study the formation of PAAs, we developed a protocol using whole-mount immunofluorescence coupled with benzyl alcohol/benzyl benzoate (BABB) tissue clearing, and confocal microscopy. This allows for the visualization of the pharyngeal arch endothelium at a fine cellular resolution as well as the 3D connectivity of the vasculature. Using software, we have established a protocol to quantify the number of endothelial cells (ECs) in PAAs, as well as the number of ECs within the vascular plexus surrounding the PAAs within pharyngeal arches 3, 4, and 6. When applied to the whole embryo, this methodology provides a comprehensive visualization and quantitative analysis of embryonic vasculature.

Here, we describe a protocol to visualize and analyze the pharyngeal arch arteries 3, 4, and 6 of mouse embryos using whole-mount immunofluorescence, tissue clearing, confocal microscopy, and 3D reconstruction.

Tüm montaj immünohistokimya ve 3D Rekonstrüksiyon u kullanarak Faringeal Arch Arterlerin Görselleştirilmesi ve Analizi

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in vitro. Developing more efficient organ-like platforms that can model complex in vivo phenotypes, such as organoids and organs-on-a-chip, will enhance the ability to study human heart development and disease. This paper describes a protocol to generate highly complex human heart organoids (hHOs) by self-organization using human pluripotent stem cells and stepwise developmental pathway activation using small molecule inhibitors. Embryoid bodies (EBs) are generated in a 96-well plate with round-bottom, ultra-low attachment wells, facilitating suspension culture of individualized constructs.
The EBs undergo differentiation into hHOs by a three-step Wnt signaling modulation strategy, which involves an initial Wnt pathway activation to induce cardiac mesoderm fate, a second step of Wnt inhibition to create definitive cardiac lineages, and a third Wnt activation step to induce proepicardial organ tissues. These steps, carried out in a 96-well format, are highly efficient, reproducible, and produce large amounts of organoids per run. Analysis by immunofluorescence imaging from day 3 to day 11 of differentiation reveals first and second heart field specifications and highly complex tissues inside hHOs at day 15, including myocardial tissue with regions of atrial and ventricular cardiomyocytes, as well as internal chambers lined with endocardial tissue. The organoids also exhibit an intricate vascular network throughout the structure and an external lining of epicardial tissue. From a functional standpoint, hHOs beat robustly and present normal calcium activity as determined by Fluo-4 live imaging. Overall, this protocol constitutes a solid platform for in vitro studies in human organ-like cardiac tissues.

Here, we describe a protocol to create developmentally relevant human heart organoids (hHOs) efficiently using human pluripotent stem cells by self-organization. The protocol relies on the sequential activation of developmental cues and produces highly complex, functionally relevant human heart tissues.

Pluripotent Kök Hücrelerden Elde Edilen Kendi Kendine Monte Edilen İnsan Kalbi Organoidlerinin Üretilmesi

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Biyokimya

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Kuş Embriyonik Kapak Progenitör Hücreler izolasyonu ve Kültür

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Biyoloji

A Label-free Xenograft Model for Investigating the Behavior of Human Stem Cell Spheroids in Chick Embryos

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell migration, differentiation, and morphogenesis, with unique instructive signals and germ layer identity that are often absent from adult xenograft models. In addition, embryonic models cannot discriminate self versus non-self tissues, eliminating the risk of rejection of the graft and the need for immune suppression of the host. This paper presents a methodology for transplantation of spheroids of human cells into chicken embryos, which are accessible, amenable to manipulation, and develop at 37 &#176;C. 
Spheroids allow the selection of a specific region of the embryo for transplantation. After being grafted, the cells become integrated into the host tissue, allowing the follow-up of their migration, growth, and differentiation. This model is flexible enough to allow the utilization of different adherent populations, including heterogeneous primary cell populations and cancer cells. To circumvent the need for prior cell labeling, a protocol for the identification of donor cells through hybridization of human-specific Alu probes is also described, which is particularly important when investigating heterogeneous cell populations. Furthermore, DNA probes can be easily adapted to identify other donor species. This protocol will describe the general methods for preparing spheroids, grafting into chicken embryos, fixing and processing tissue for paraffin sectioning, and finally identifying the human cells using DNA in situ hybridization. Suggested controls, examples of interpretation of results and various cell behaviors that can be assayed will be discussed in addition to the limitations of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Civciv Embriyolarında İnsan Kök Hücre Sferoidlerinin Davranışının İncelenmesi İçin Etiketsiz Bir Ksenogreft Modeli

Here, we describe a method to transplant and identify human cell spheroids into chick embryos. This xenograft model uses the embryonic microenvironment as a source of instructive signals to assay cell migration, differentiation, and tropism and is especially suited for the study of primary and/or heterogeneous cell populations.

Civciv Embriyolarında İnsan Kök Hücre Sferoidlerinin Davranışının İncelenmesi İçin Etiketsiz Bir Ksenogreft Modeli

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell ...

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler

Tüm montaj immünohistokimya ve 3D Rekonstrüksiyon u kullanarak Faringeal Arch Arterlerin Görselleştirilmesi ve Analizi

Pluripotent Kök Hücrelerden Elde Edilen Kendi Kendine Monte Edilen İnsan Kalbi Organoidlerinin Üretilmesi

Kuş Embriyonik Kapak Progenitör Hücreler izolasyonu ve Kültür

Civciv Embriyolarında İnsan Kök Hücre Sferoidlerinin Davranışının İncelenmesi İçin Etiketsiz Bir Ksenogreft Modeli

Civciv Embriyolarında İnsan Kök Hücre Sferoidlerinin Davranışının İncelenmesi İçin Etiketsiz Bir Ksenogreft Modeli