We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

Tüm fareler Johns Hopkins Üniversitesi&#39;nde hayvan tesisi -accredited Laboratuar Hayvan Bakımı Akreditasyon Amerikan Derneği (AAALAC) muhafaza ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen prosedürlere uygun olarak muhafaza edildi. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tüm deneysel protokolleri onayladı. 1. Deneysel hazırlanması <ol><li> 60 dakika boyunca fosfat tamponlu çözelti içinde% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) (PBS) ile kaplayın 12 oyuklu plaka. </li><li> Kaplama çözeltisini çıkarın ve serum içermeyen vasat (SFM) ve 200 ul ilave edin. Medya film tüm yüzey alanı kaplamaktadır emin olmak için plakayı döndürdüm. </li></ol> 2. Cerrahi İşlemleri <ol><li> Tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon tarafından takip kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış protokol kullanılarak gebe fareler Euthanize. </li><li> Sprey ve% 70 ile fare göbek bölgesini temizlemeketanol. Kirlenmesini önlemek için sıkı steril teknikler koruyun. </li><li> Kullanım forseps ve makas göbek bölgesinde 0.5 cm 2 kesi yapmak için. </li><li> / Çimdik kesi altında ve üstünde cildi kapmak ve yavaşça zıt yönlerde (baş ve kuyruk) cilt çekmek için parmaklarınızı kullanın. </li><li> Göbek bölgesinde zarında bir başlangıç ​​kesi yapmak için forseps ve makas kullanın. Yavaşça böylece rahim ifşa her bir tarafında (2 x 1.5 cm2) üzerine overlere göbek V-şeklinde membran kesti. </li><li> Böylece yumurtalıktan rahim kurtararak, yumurtalık tarafında yumurtalık çimdik yumurtalık ve rahim makas bağlayan yumurtalık çimdik için forseps kullanabilir. </li><li> Yavaşça forseps yumurtalık tarafından rahim yukarı çekin ve makas ile mesane bölgeden serbest rahim kesti. </li><li> Forseps ile yumurta kanalı tarafından daha fazla yukarı rahim çekin ve böylece m rahim bırakmadan diğer tarafta makas ile yumurtalık kesmekouse. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer rahim ve Ca + 2 ve Mg + 2 ile birlikte, steril, soğuk PBS ve 20 ml ekleyin. PBS embriyo diseksiyonu sırasında Ca 2+ ve Mg 2+ içermelidir. </li><li> Yavaşça kan rahim yıkamak için 10 saniye boyunca tüp sallayın. </li><li> Forseps ile tüp rahim aktarın ve 10 ml çanak koyun ve uterus üzerine soğuk PBS 5 ml ekleyin. </li><li> Bir stereomikroskop altında rahim ile çanak yerleştirin. Not: 2,13-2,19 Stereomikroskopta gerektirir Adımları. </li><li> Yavaşça tek rahim itibaren embriyolar ile amniyotik keseler rahim açıp dışarı incelemek için forseps iki çift kullanın. <ol><li> Dikkatle embriyo çevreleyen amniyotik kese açmak için forseps iki çift kullanın tek forseps ile kesesini tutam ve yavaşça embriyo çıkarın, kesme ve embriyo amniyon kesesi serbest bırakmak için diğer forseps kullanabilir. Belirli bir genotip Gerekirse, genotipleme için amniyotik kese tutun. </li></ol></li><li> Yan embriyo yerleştirin ve kemer ve farenks kesenin (Şekil 1A &#39;&#39;) arasındaki kalbe posterior kemer nd 1 st ve 2 kesmek için forseps kullanabilir. </li><li> Yavaşça diğer tarafa çevirmek embriyo ve posterior kemer ve farenks kese arasındaki kalbe 1. ve 2. kemer kesmek için forseps kullanabilir. </li><li> Hala 1 st ve embriyoya 2. farengeal kemerli bağlanan kalp çıkış yolunu kesmek için forseps kullanabilir. Hala embriyodan, kelebeğin (Şekil 1B) şeklinde birbirine bağlı olan kemerler, çıkartın. </li><li> Çimdik için forseps kullanabilir ve kalan kalp çıkım yolu ve foregut endoderm 1 st farengeal kemerli bırakın (Şekil 1B &#39;* kesik çizgi ile gösterilen ve). </li><li> Çimdik için forseps kullanabilir ve kalan kalp çıkış yolundan 2. faringeal kemerler serbestve foregut endoderm (Şekil 1B &#39;kesikli çizgi ve ** ile gösterilir). </li><li> Ayrı ayrı forseps kullanarak kemerlerin her çift aktarın ve iyi belirlenmiş bir ortasında iki kemerler yerleştirin. Ayrı kuyularda Levha 1. ve 2. faringeal kemerler. Kemerler adım 1.2 ilave medya filmi ile temas içinde olduğundan emin olun. Onlar bu dönemde ek için kuyunun yüzeyi ile temas kurmaya gerek olarak kemerler, orta kapsamında DEĞİLDİR çok önemlidir. </li></ol> 3. Kuluçka ve Görüntüleme <ol><li> Kemerler iyi bir yüzey alanı eklemek için 2 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 içinde 12 oyuklu plaka kemerler inkübe edin. </li><li> Yavaşça kuyunun aşağı tarafı 37 ° C SFM 200 ul ekleyin. Kemerler bağlı kalır emin olun ve / N O kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Ertesi gün, görsel farengeal kemerler takılı ve hafifçe aşağı tarafı 37 ° C SFM 200 ul ekleyin olduğunu kontrol ediniyi. Kemerler bekâr ve yüzen kalırsa, yavaşça sadece medyanın film kalana kadar kemerleri çıkarmadan bir pipet ile ortamı çıkarın. Kuyu ve tekrar adım 3.1 ortasına kemerler yerleştirmek için pipet kullanın. </li><li> Günlük Monitör; herhangi bir medya buharlaştırılarak yerine 2 günde medya ~ 100-200 ul ekleyin. Not: hücrelerini göç sonra 24-48 saat kemer etrafında görünür ve çoğalırlar ve önümüzdeki 5-8 gün içinde kemer göç edecektir. Dayak kardiyomiyositlerde 36-72 saat oluşumu 2. faringeal kemer (Şekil 2B) den görülebilir sonra. Miyotüp formasyonu eki (Şekil 2A) sonra 1 st farenks kemer 3-7 gün görülebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu videoda, biz izole etmek ve 9.5 gün eski fare embriyolarının ilk kültür ve ikinci yutak kemerler nasıl gösterilmektedir. Farengeal kemerler, ilk kemerlerin 8 ikinci kemerli ve baş kas atalarıdır -in embriyogenez 10,11 sırasında kalbi yapmak için çok güçlü kalp progenitör hücrelerin bina blokları içeren gelişmekte olan embriyoların 9&#39;un craniolateral tarafında görünen çıkıntı geçici segmente edilmiş . Yutak kemerlerin dis...

Faringeal mezoderm hücreleri kalp parça ve yutak kas yol açmaktadır. Embriyonik gelişim sırasında, ikinci kalp alanından multipotent kalp progenitör hücrelerin yutak mezodermden göç ve kardiyak çıkış yolunu ve sağ ventrikül doldurmak ve onların anormal gelişim yakından doğum kusurları ve doğum defect- konjenital kalp hastalığı lideri nedeni ile ilişkilidir İnsanlarda 1-3 benzer ölümler. Son çalışmalar yutak mezoderm mezoderm kardiyo-Kraniofasiyal gelişim 4 kritik bir parçası yaparak, kalp ek olarak, kas kafa katkıda bulunduğunu göstermiştir. Böylece, indüksiyon, çoğalması ve yutak mezoderm baş ve kalp atalarıdır farklılaşma dahil gelişimsel süreçleri etkin soruşturma 5-7 altındadır. Yakın zamana kadar, kardiyak progenitör hücreler genişleme witho tabi olup olmadığı bilinmeyen kaldıkendi cep çevre hakkında bilgi eksikliği kısmen ut farklılaşma. Bizim yeni bir çalışma faringeal kemerler kalp ve kas atalarıdır yenilenmesi için bir mikroçevresinin olarak hizmet ve birkaç hafta üzerinde 8 ex vivo kültüre olabileceğini düşündürmektedir. Bu eksplant yöntemi kardiyo-kraniofasial atalarıdır ex vivo gelişimini incelemek için yeni ve eşsiz bir fırsat sunmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2 + Mg2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm petri plates</td>
			<td>Fishersci</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Serum Free Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% BSA (in PBS) &#224; (Invitrogen Cat#. P2489)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>P2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

Gelişmekte olan embriyoların faringeal mezoderm baş ve kalp kaslarının geniş bölgelere katkıda bulunur. Biz (aynı zamanda brankiyal kemerli olarak da bilinir) farenks kemerli baş ve kalp progenitör hücre gelişimini ex vivo çalışma için yeni bir yöntem geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak, biz son zamanlarda ikinci faringeal kemer kendini yenileyen kalp atalarıdır içeren ve fare kalp gelişimi sırasında atalarıdır genişletilmesi için bir mikro olarak hizmet ettiğini tarif var. progenitör hücrelerin kemerin içinde farklılaşmamış ve geniş kalır, ancak hızlı bir şekilde kemer dışarı göç gibi fonksiyonel kardiyomiyositler olur. Biz de ilk faringeal kemer kemer ayrıldıktan sonra miyotüplerinin sebebiyet veren kas atalarıdır içerdiğini bildirdi. Burada, biz diseksiyon ve fare embriyoları geliştirmekten birinci ve ikinci faringeal kemerler ex vivo kültür prosedürü göstermektedir. yöntem baş ve kalp progenitör / kas dev incelemek için birini sağlayankardiyomiyosit ayrıntılı ex vivo miyotüp formasyonu da dahil olmak üzere elopment.

Onlar çoğalır ve baş ve kalp kas, sırasıyla (Şekil 1A, A &#39;ve A&#39; &#39;) olmak üzere, 1. ve 2. faringeal kemer göç olarak gelişimi sırasında, yüz kası ve kalp atalarıdır izlenebilmektedir. Yutak kemerlerin Kültürleme detaylı ex vivo kalp ve kas gelişimini incelemek için benzersiz bir yol sunuyor. Diseksiyon ve yutak kemerlerin bağlanması sonrasında, ekli kemerli göç hücrelerin kültür 24-48 saat içinde görülebilir. Kültür miyot...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

ex-vivo-culture-pharyngeal-arches-to-study-heart-muscle-progenitors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.7K Görüntüleme.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.