We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

Todos los ratones fueron mantenidos a una Asociación Americana para la Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) acreditado por animalario de la Universidad Johns Hopkins y alojados de conformidad con los procedimientos establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) aprobó todos los protocolos experimentales. 1. Preparación Experimental <ol><li> Escudo placa de 12 pocillos con 10% de suero bovino fetal (FBS) en solución tamponada de fosfato (PBS) durante 60 min. </li><li> Retire solución de revestimiento y añadir 200 l de los medios de comunicación libre de suero (SFM). Girar la placa para asegurarse de que una película de los medios cubre toda la superficie. </li></ol> 2. Procedimientos Quirúrgicos <ol><li> La eutanasia a los ratones embarazadas que utilizan cuidado de los animales protocolo comité aprobados de la institución seguido por dislocación cervical para asegurar la eutanasia completa. </li><li> Rocíe y limpie la región del vientre del ratón con el 70%etanol. Mantener estrictas técnicas estériles para evitar la contaminación. </li><li> Use pinzas y tijeras para hacer un 0,5 cm2 incisión en la región del ombligo. </li><li> Utilice los dedos para pellizcar / agarrar la piel por encima y por debajo de la incisión y tire suavemente la piel en direcciones opuestas (cabeza y cola). </li><li> Utilice pinzas y tijeras para hacer una incisión inicial en la membrana en la región del ombligo. Cortar con cuidado la membrana en forma de V desde el ombligo hasta los ovarios en cada lado (2 x 1,5 cm 2), revelando así el útero. </li><li> El uso de fórceps para pellizcar el oviducto que conecta el útero con el ovario y tijeras para pellizcar el oviducto en el lado del ovario, liberando así el útero desde el ovario. </li><li> Tire suavemente hasta el útero por el oviducto con las pinzas y cortar el útero libre de la región de la vejiga con unas tijeras. </li><li> Tire del útero más arriba por el oviducto con las pinzas, y cortar el oviducto con unas tijeras en el otro lado, liberando de este modo el útero de la mOuse. </li><li> Transferir el útero a un tubo de 50 ml y añadir 20 ml de PBS frío estéril con Ca2 + y Mg2 +. PBS debe contener Ca 2+ y Mg 2+ durante la disección de embriones. </li><li> Agite suavemente el tubo durante 10 segundos para lavar el útero para la sangre. </li><li> Transferir el útero desde el tubo con pinzas y colocarlo en una placa de 10 ml y añadir 5 ml de PBS frío en la parte superior del útero. </li><li> Coloque el plato con el útero bajo un microscopio estereoscópico. Nota: Los pasos 02/13 a 02/19 requiere un microscopio estereoscópico. </li><li> Use dos pares de pinzas para abrir suavemente el útero y diseccionar sacos amnióticos con embriones desde el útero uno por uno. <ol><li> Use dos pares de pinzas para abrir cuidadosamente el saco amniótico que rodea al embrión, pellizcar el saco con uno fórceps y suavemente sacarlo de la embrión, utilizar las otras pinzas para cortar y liberar el saco amniótico a partir del embrión. Si un genotipo específico necesario, mantenga saco amniótico para el genotipado. </li></ol></li><li> Coloque el embrión en el lado y utilizar pinzas para cortar el 1 ° y 2 ° arco posterior al corazón entre el arco y la bolsa faríngea (Figura 1 A &#39;&#39;). </li><li> Voltear suavemente el embrión para el otro lado y utilizar pinzas para cortar la primera y segunda arco posterior al corazón entre el arco y la bolsa faríngea. </li><li> Utilice unas pinzas para cortar el tracto de salida cardíaco que todavía se está conectando el 1 y 2 de la faringe arcos al embrión. Retire los arcos, que todavía están unidos juntos en la forma de una mariposa (Figura 1B), a partir del embrión. </li><li> Utilice pinzas para pellizcar y suelte los arcos 1 st faríngeas del restante del tracto de salida cardíaco y endodermo del intestino anterior (Figura 1B &#39;&#39; se indica con línea discontinua y *). </li><li> El uso de fórceps para pellizcar y suelte los arcos faríngeos 2º del resto del tracto de salida cardíacoy endodermo del intestino anterior (Figura 1B &#39;&#39; se indica con línea discontinua y **). </li><li> Transferir cada par de arcos por separado utilizando fórceps y colocar ambas arcadas en el medio de un así designado. Plate 1 y 2 de la faringe arcos en pocillos separados. Asegúrese de que los arcos están en contacto con la película de los medios agregados en el paso 1.2. Es crucial que los arcos no están cubiertos por medio, ya que necesitan para hacer contacto con la superficie del pozo para la fijación durante este período. </li></ol> 3. Incubación e Imagen <ol><li> Incubar arcos plateados en la placa de 12 pocillos en 37 ° C / 5% de CO 2 durante 2 horas para arcos para fijar a la superficie también. </li><li> Añadir suavemente 200 l de 37 ° C SFM por el lado del pozo. Asegúrese de que los arcos permanecen unidos e incubar O / N. </li><li> Al día siguiente, comprobar visualmente que arcos faríngeos se unen y agregan suavidad 200 l de 37 ° C SFM por el lado de labien. Si arcos permanecen sin ataduras y flotante, retire con cuidado los medios de comunicación con una pipeta sin remover arcos hasta que sólo queda una película de los medios de comunicación. Utilice punta de la pipeta para colocar arcos en el medio de la etapa de bien y de repetición 3.1. </li><li> Monitorear diariamente; añadir ~ 100-200 l de los medios de comunicación cada segundo día para reemplazar cualquier medio evaporó. Nota: 24-48 h después de la migración de las células aparecen alrededor del arco y proliferar y migrar de arco en los próximos 5-8 días. Después de 36 a 72 horas de formación de los cardiomiocitos que baten se puede observar desde el 2º arco faríngeo (Figura 2B). Formación myotube se puede observar a partir de los 1 st faríngea arco 3-7 días después de la unión (Figura 2). </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este vídeo, se demuestra cómo aislar y cultura primero y segundo arcos faríngeos de 9,5 días de edad embriones de ratón. Arcos faríngeos se transitoria, segmentados abultamientos que aparecen en el lado craneolateral de embriones en desarrollo 9, que contienen bloques cardiaca de creación de células progenitoras múltiples potentes para hacer que el corazón durante la embriogénesis 10,11 -en segundo arcos y progenitores musculares cabeza en primera arcos 8 . <p class="jo...

Las células del mesodermo faríngeos dan lugar a partes del corazón y los músculos faríngeos. Durante el desarrollo embrionario, las células progenitoras multipotentes cardiacos desde el segundo campo corazón migran desde el mesodermo faríngea y pueblan el tracto de salida del ventrículo derecho y cardiaco, y su desarrollo anormal está estrechamente asociada con la enfermedad-el corazón congénita causa de defectos de nacimiento y-defecto de nacimiento muertes relacionadas en seres humanos 1-3. Estudios recientes han demostrado que mesodermo faríngea contribuye a la cabeza músculos, además del corazón, haciendo que el mesodermo una parte crítica del desarrollo cardio-4 craneofacial. Por lo tanto, los procesos de desarrollo incluyendo la inducción, proliferación, y diferenciación de progenitores de la cabeza y del corazón en el mesodermo faríngea están bajo investigación activa 5-7. Hasta hace poco, seguía siendo desconocida si las células progenitoras cardíacas experimentan witho expansióndiferenciación ut, debido en parte a la falta de información sobre su entorno celular. Nuestro estudio reciente sugiere que los arcos faríngeos sirven como un microambiente para la renovación de los progenitores cardíacos y musculares y pueden ser cultivadas ex vivo durante varias semanas 8. Este método de explante ofrece una novedosa y única oportunidad de estudiar el desarrollo de progenitores cardio-craneofacial ex vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2 + Mg2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm petri plates</td>
			<td>Fishersci</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Serum Free Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% BSA (in PBS) &#224; (Invitrogen Cat#. P2489)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>P2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

El mesodermo faríngea de los embriones en desarrollo contribuye a amplias regiones de la cabeza y la musculatura del corazón. Hemos desarrollado un nuevo método para estudiar la cabeza y progenitor corazón desarrollo de las células con arcos faríngeos (también conocido como arcos branquiales) ex vivo. Usando este método, hemos descrito recientemente que el segundo arco faríngeo contiene progenitores corazón auto-renovación y sirve como un microambiente para la expansión de los progenitores durante el desarrollo del corazón de ratón. Las células progenitoras permanecen indiferenciadas y expansivo en el interior del arco, pero rápidamente se convierten en cardiomiocitos funcionales a medida que migran fuera del arco. También informó que el primer arco faríngeo contiene progenitores musculares que dan lugar a miotubos después de dejar el arco. Aquí, se demuestra el procedimiento para la disección y la cultura ex vivo de primer y segundo arcos faríngeos de desarrollo de embriones de ratón. El método permite a uno para estudiar la cabeza y el corazón progenitor / dev muscularelopment, incluyendo cardiomiocitos y myotube formación en detalle ex vivo.

Durante el desarrollo, los progenitores del músculo y del corazón faciales se pueden remontar a medida que proliferan y migran desde el 1 ° y 2 ° arco faríngeo, para convertirse en la cabeza y la musculatura del corazón, respectivamente (Figura 1 A, A &#39;y A&#39; &#39;). El cultivo de arcos faríngeos ofrece una forma única para estudiar el corazón y el músculo de desarrollo en detalle ex vivo. Después de la disección y la unión de los arcos faríngeos,...

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Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

ex-vivo-culture-pharyngeal-arches-to-study-heart-muscle-progenitors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.7K vistas.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.