We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

所有小鼠均维持在实验室动物护理的认可美国协会（AAALAC）-accredited在约翰·霍普金斯大学动物设施及安置按照指南中列出了实验动物的护理和使用的程序。该机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的所有实验方案。 1.实验准备<ol><li>外套12孔板，用10％胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中60分钟。 </li><li>除去涂布溶液，并添加200微升无血清培养基（SFM）的。捻盘，以确保媒体的膜覆盖整个表面区域。 </li></ol> 2.外科手术<ol><li>安乐死使用机构的动物护理委员会批准的协议，颈椎脱位，以确保完全安乐死孕鼠。 </li><li>喷雾和清洁鼠标的腹部区域有70％乙醇。保持严格的无菌技术，以避免污染。 </li><li>使用镊子和剪刀，使0.5 平方厘米的切口在肚脐区域。 </li><li>用手指捏住/抢皮肤上方和下方的切口，然后轻轻拉动以相反的方向（头部和尾部）的皮肤。 </li><li>使用镊子和剪刀，使在膜的初始切口在肚脐区域。轻轻地从肚脐至卵巢每侧（2×1.5 cm 2）的切成V字形的膜，从而揭示子宫。 </li><li>使用镊子夹住子宫连接卵巢和剪刀输卵管捏在输卵管卵巢端，从而释放从卵巢子宫。 </li><li>轻轻拉起子宫与镊子输卵管切摆脱用剪刀膀胱区的子宫。 </li><li>进一步向上拉子宫通过用钳子的输卵管，并用剪刀剪下输卵管上的另一侧，从而从m释放子宫乌斯河。 </li><li>子宫转移至50ml管中，并加入20毫升冷无菌PBS的与钙离子和镁离子 。 PBS必须包含在胚胎解剖钙离子和镁离子 。 </li><li>轻轻摇动管10秒以洗涤子宫血。 </li><li>从管转移子宫用镊子并将其放置在10ml的培养皿和对子宫的顶部添加冷PBS 5毫升。 </li><li>与广场立体显微镜下子宫菜。 注意：步骤2.13-2.19需要立体显微镜。 </li><li>使用两对镊子从子宫逐一轻轻打开子宫解剖用的胚胎囊羊水。 <ol><li>使用两对镊子小心地打开羊膜囊包围胚胎，掐国资委一个镊子轻轻地从胚胎中取出，用另一钳剪切和从胚胎释放羊膜囊。如果特定基因型的需要，保持羊膜囊进行基因分型。 </li></ol></li><li>在广场一侧的胚胎，并使用镊子削减1 和第 2 次向后拱到心脏的弓和咽囊（ 图1A&#39;&#39;）之间。 </li><li>轻轻翻转胚胎到另一边，并用钳子切断第一和第二拱后方的弓和咽囊之间的心脏。 </li><li>使用镊子将那仍然是连接1 和第 2 次咽弓的胚胎心脏流出道。取出拱门，目前仍在连接在一起蝴蝶（ 图1B）的形状，从胚胎。 </li><li>使用镊子夹住并从剩余的心脏流出道和肠内胚层释放1日咽弓（ 图1B&#39;标有虚线和*）。 </li><li>使用镊子夹住并从剩余的心脏流出道释放第二咽弓和前肠内胚层（ 图1B&#39;表示与虚线和**）。 </li><li>传输每对单独使用镊子拱门和放置两个拱门的中央指定的很好。板1 和第 2 次咽弓在不同的孔。确保拱在与在步骤1.2中加入介质薄膜接触。至关重要的是，拱门并不包含介质，因为它们需要在此期间，以与井用于附连的表面接触。 </li></ol> 3.孵化和影像<ol><li>孵育拱门镀在12孔板在37℃/ 5％CO 2下2小时为拱附加到孔表面面积。 </li><li>轻轻加入200微升37℃的SFM井里的一侧。确保拱门保持连接，并培育O / N。 </li><li>第二天，在视觉上检查咽弓连接，轻轻地加入200微升37℃SFM下来的边良好。如果仍然拱门未婚和漂浮，轻轻地用吸管取出介质而不删除拱门，直到只有媒体的膜离开。用枪头把拱门井和重复步骤3.1的中间。 </li><li>日常监控;添加〜100-200微升媒体每2天更换任何媒体蒸发。 注：迁移细胞后24-48小时左右出现拱，将增殖和迁移拱在未来5-8天。后36-72小时形成跳动的心肌细胞可以从第二咽弓（ 图2B）中观察到。肌管形成可以从第1次咽弓3-7天附件（ 图2A）后进行观察。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

在这段视频中，我们将演示如何隔离和9.5天的小鼠胚胎文化第一和第二咽弓。咽弓是短暂的，分段出现在胚胎发育9，其中含有多能心脏祖细胞，积木胚胎10,11 -in第二拱门和头部肌肉祖细胞在第一拱8时，使心脏的craniolateral侧面凸起。 咽弓的解剖需要先进的小鼠胚胎解剖技能。一旦拱已成功解剖使用这种分步协议，并转移至预包被的孔，即拱连接到所?...

咽中胚层细胞产生的心脏的部分和咽肌肉。在胚胎发育期间，从第二心脏字段多能心脏祖细胞从咽中胚层迁移和填充心脏流出道和右心室，和它们的异常发展密切出生缺陷和出生无缺陷的先天性心脏疾病的主要原因相关相关死亡在人类1-3。最近的研究已经表明，咽中胚层有助于头部肌肉，除了心脏，使得胚层的心颅面发展4的一个关键部分。因此，在发展过程中，包括诱导，增殖，以及头部和心脏祖细胞在咽中胚层分化正在积极调查5-7。 直到最近，它仍然是未知的心脏祖细胞是否发生无覆盖扩张UT分化，部分原因是由于他们的细胞环境信息的缺乏。我们最近的研究表明，咽弓作为微环境的心脏和肌肉祖细胞的更新和可体外培养在几个星期8。该块法提供了一个新颖而独特的机会来研究心颅面祖细胞体外的发展。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2 + Mg2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm petri plates</td>
			<td>Fishersci</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Serum Free Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-retinoic acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% BSA (in PBS) &#224; (Invitrogen Cat#. P2489)</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>P2489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

发育中的胚胎的中胚层咽有助于头部和心脏肌肉组织的广泛地区。我们已经开发出一种学习的头部和心脏祖细胞发育与咽弓（也称为鳃弓） 离体的新方法。使用这种方法，我们最近描述了第二咽弓包含自我更新心脏祖细胞，并作为一个微环境对祖细胞的小鼠心脏发育过程中扩张。祖细胞分化仍然膨胀和拱内，但很快就成为功能的心肌细胞，因为它们迁移出弓。我们还报道说，第一咽弓包含肌肉祖离开后拱引起肌管。在这里，我们展示了解剖，并从发展中国家小鼠胚胎的第一和第二咽弓体外培养的过程。该方法使一个研究头部和心脏祖/ dev的肌肉elopment，包括心肌细胞和肌管的详细体外形成。

在开发过程中，面部肌肉和心脏祖细胞可以作为他们增殖并从1 和第 2 次咽弓迁移，成为头部和心脏肌肉组织，分别为（ 图1A，A&#39;和A&#39;&#39;）进行跟踪。培养咽弓提供学习心脏和肌肉的发育，详细体外的独特方式。解剖和附件咽弓后，从拱门连接迁移细胞可以在24-48小时的培养中观察到。内的培养肌管形成3天可以从1次咽弓和从第二</...

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Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

咽弓的体外培养研究心脏和肌肉祖细胞和自己的优势

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.7K 次观看.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.