Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DP2OD008470.

Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade de Notre Dame. Preparação de Solução de Ringer 1. <ol><li> Adicione uma solução de NaCl 116 mM, KCl 2,9 mM, 3,6 mM de CaCl 2, 5 mM de Hepes e com ultrapura H 2 O por meio de agitação contínua para evitar qualquer precipitação de sal. </li><li> Após a adição de sais e enquanto a solução ainda está agitação, adicionar 100 unidades / ml de penicilina e por 100 g de estreptomicina por ml. </li><li> Depois de adicionar todos os antibióticos e sais, realizar a esterilização filtro da solução e guarde em recipiente estéril. Nota: N-feniltioureia (1-fenil-2-tioureia) ou PTU pode ser adicionado à solução de Ringer para bloquear a formação de pigmento na grânulo embriões implantados sem consequências negativas para a saúde do embrião. Para preparar solução de bloqueio / pigmentação de Ringer, use uma concentração de 0,003% PTU. Devido à baixa concentração de UTP a ser adicionado é aconselhável que um maior volume de Solução de Ringer ser feita, pelo menos, um L, para evitar a adição de quantidades minúsculas de pó PTU. Adicionar PTU durante a etapa 1.2, enquanto a solução é agitação. </li></ol> 2. Preparação de Solução tricaina <ol><li> Adicionar 2 g de cloridrato de 3-aminobenzoato de sal metanossulfonato de (tricaina) por L de solução mais 0,1 M de Tris, a partir de um estoque 1 M equilibrada para um pH de 9.5 e fez ultrapura com H 2 O. Nota: tricaina será usado para sacrificar os embriões de peixe-zebra no ponto de tempo desejado para ensaiar fenótipos implantação do grânulo. </li></ol> 3. Preparação de Solução E3 <ol><li> Adicione uma solução de 0,25 M de NaCl, 10 mM de KCl, 12,5 mM de CaCl2, e 16,6 mM de MgSO 4 para 1 L de água ultrapura para criar 1 L de E3. </li><li> Adicionar 200 ul de azul de metileno à solução de E3 para inibir o crescimento de fungos. </li></ol>4. Needles que puxam para Microbead Transferência <ol><li> Use fogo polido vidro de borosilicato com filamento a uma DO: 1,0 mm ID: 0,5 mm, com um comprimento de 10 cm. </li><li> Coloque vidro borosilicated em um extrator micropipeta para preparar agulhas finas. Nota: Os quatro dimensões que se seguem podem ser utilizados como um ponto de partida para puxar as agulhas: Calor = 540, Pull = 245, velocidade = 200, Tempo e = 125. </li><li> Depois de puxar um número adequado de agulhas, armazenar em plástico coberto placas de petri, posicionados em tiras de massa de modelar ou fita adesiva para evitar a quebra da ponta da agulha, até o uso. </li><li> Para cortar a ponta da agulha para o diâmetro desejado, usar um par de fórceps finos para marcar a extremidade da agulha. Nota: diâmetro da agulha pode variar, dependendo do tamanho micropérola a ser utilizado, bem como as preferências de manuseamento utilizador. Um bom ponto de partida é diâmetros ofício em um intervalo entre 100 e 200 mm se microesferas que vão 50-100 mm será utilizado. </li><li> Prior de usar, inserir a agulha aparado no suporte do tubo capilar para formar o instrumento de transferência microbead concluída. </li></ol> 5. Bigode / Lash ferramenta de preparação <ol><li> Obter um triz, chicote, ou outra peça ainda pequena empresa de filamento de cabelo natural ou sintético. Cortar perto da base do filamento num ângulo de 45 °. Aderir a suiça a uma ponta micropipeta P-1000 usando cola permanente adesivo transparente. </li></ol> 6. Microbead Implantação Bandeja Preparação <ol><li> Misturar 2 g de agarose com 100 ml de solução de E3 para fazer um 2% de gel de agarose E3. </li><li> Aquece-se a solução de agarose a 2% durante 1 minuto e 30 segundos num balão de Erlenmeyer de 250 mL, agitando o frasco a cada 30 segundos, a fim de evitar que o gel de borbulhando. </li><li> Tirar a tampa de 60 mm x 15 milímetros placa de Petri e coloca-se numa maior 150 milímetros x 15 milímetros prato com o interior voltado para cima. </li><li> Despeje o gel de agarose quente na 150 milímetros x 15 mm placa de Petri, certificando-se de ancorar-sea tampa da placa de menor com o dedo indicador. Nota: Permitir uma fina camada de agarose de baixo da tampa do prato menor para remover a condensação que se formam quando se vaza o gel; isso fará com que as contas mais fáceis de ver sob um microscópio de dissecção. </li><li> Como a agarose arrefece, mas antes que solidifique, colocar um molde bem no gel. Isto irá permitir a fácil colocação dos embriões. </li><li> Nota: A fim de evitar bolhas nos poços, coloca o molde lentamente num ângulo até ser flutuante no topo do gel. </li><li> Usando um microspatula, remova cuidadosamente o bem molde uma vez que o gel tem solidificado. Adicionar solução E3 e armazenar a 4 ° C. </li></ol> Coleção 7. Embryo <ol><li> Prepare câmaras de acasalamento, separadas por divisórias, preenchendo-os com água do sistema, e em seguida, colocando adulto do sexo feminino (s) pares do sexo masculino (s) peixe-zebra e nas câmaras O / N. </li><li> Recolher os ovos fertilizados usando um filtro fino de malha de arame (estágios embrionários irá variar um pouco). </li><li> Depositar os ovos fertilizados em um ambiente limpo, 10 centímetros de diâmetro petri prato girando o filtro de cabeça para baixo e enxaguá-lo com um bom fluxo de E3 até que não haja ovos deixados no coador, e há cerca de 25 ml de solução E3 no prato. </li><li> Após a coleta, dividir os ovos em vários pratos (aproximadamente 50-60 ovos por placa) para evitar a superlotação, o que pode levar a assincronia de desenvolvimento dentro da embreagem e fazer a coleta desejados pontos vezes difícil. </li><li> Incubar embriões em solução E3 a 28,5 ° C para permitir a avaliação do desenvolvimento de acordo com a série de paragem peixe-zebra padrão 40. Nota: Os embriões devem ser transferidos para E3 / PTU às 24 horas pós fecundação (hpf) para prevenir o desenvolvimento de pigmento se manipulações em estágios mais velhos necessitam de clareza óptica. </li></ol> 8. Bead Implantação <ol><li> Incubam-se as microesferas em concentração molécula de ensaio ou o veículo desejado s correspondentesolution durante o tempo necessário num volume apropriado. Nota: O pesquisador pode utilizar placas de Petri esterilizadas que variam de 3-6 cm de diâmetro, ou placas de multi-poços, os quais permitem a visualização das microesferas dentro da solução. O tempo pode variar dependendo do tipo e quantidade de molécula de interesse e o investigador deve referir-se ao fabricante ou recomendações publicadas para a duração de incubação e outros aspectos, tais como a sensibilidade à luz e temperatura. </li><li> Uma vez que os embriões atingiram o ponto de tempo de desenvolvimento desejado, remova os embriões de suas córions usando uma pinça fina. </li><li> Incubar os embriões na solução de Ringer filtrada com antibióticos, durante 10 min a aclimatar-los para a solução. </li><li> Enquanto os embriões são aclimatação, transferir as microesferas para a placa micropérola situado dentro da bandeja de implantação e lavá-los em solução de Ringer durante 10 minutos. Nota: Implante as contas dentro de 50 min após chegar a este ponto. Esta wdoente diminuir a probabilidade de que uma vai implantar um grânulo com uma menor concentração da molécula de interesse. </li><li> Disposição dos embriões nas cavidades da bandeja de implantação microbead, tendo o cuidado de orientá-los para que a área de interesse, onde o microbead será implantado está acessível. </li><li> Fazer uma pequena incisão no embrião usando a agulha de tungsténio. </li><li> Transferir um microbead para o embrião usando a pipeta de transferência microcapilar: pressionando o bulbo da pipeta, puxe o microbead na coluna capilar, e, em seguida, liberar a pressão para transferir o microbead no destino desejado. </li><li> Use a ferramenta da suiça / chicote para posicionar o microbead dentro do embrião. Nota: Certifique-se de posicionar o microbead para o tecido longe do local da incisão para que o microbead não será expulso do embrião como ele cura. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ao longo do século passado, a compreensão do plano de padronização corpo e organogênese tem sofrido avanços monumentais. Técnicas de manipulação de tecidos foram críticos em revelar informações importantes sobre esses processos vitais. A modificação genética é um dos métodos mais utilizados para determinar a função do gene, e métodos de análise de mosaico, tais como o transplante de células, fornecer abordagens úteis para compreender a autonomia da função do gene. Implantação Microbead fornece um outro local para interrogar como as moléculas especial alterar a dinâmica de desenvolvimento, já que este método permite que o pesquisador de alterar um ambiente tecidual local através da introdução de moléculas ou inibidores da sinalização. Uma gama de diferentes micro-esferas estão comercialmente disponíveis, que têm diferentes tamanhos e outras propriedades físicas existem (por exemplo, carga) de tal modo que eles podem ser utilizados para as condições experimentais de interesse. Assim, através da implantação de microesferas que são embebidos numa proteína ou químicocal de interesse dentro de um organismo, os pesquisadores podem investigar os efeitos localizados durante o desenvolvimento e encontrar associações entre o gene ou molécula de interesse e especial fenótipo biológico (s). Estudos como o realizado por Wada e seus colegas usaram implantação microbead a fim de avaliar o efeito do aumento de sinalização Hedgehog no padrão esquelético no neurocranium anterior (ANC) em peixes-zebra 23. Estudos anteriores demonstraram que Shh é necessária para a formação de 14 ANC. Usando microesferas Shh-revestidos pesquisadores identificaram que este sinal promove a formação de cartilagem no ANC. O processo de implantação microbead foi utilizado para demonstrar uma ligação clara entre a sinalização Hedgehog e formação de cartilagem no ANC. Outro exemplo chave desta técnica de manipulação de tecidos em peixes-zebra é observada em estudos em que os cientistas investigaram o controlo transcricional do eritroblastoma Vinte e seis (ETS) f domíniomolécula relacionada com a ETS atores (ERM) e Polioma potenciador ativador 3 (Pea3) por sinalização Fgf durante o início do desenvolvimento do cérebro do peixe-zebra 19. Através de experiências de implantação microbead, eles foram capazes de mostrar que Fgf8 e Fgf3 pode ectopically activar a expressão de erm e pea3. Estes exemplos ilustram a utilidade das microesferas para proporcionar perspectivas sobre os mecanismos de desenvolvimento que colaboram durante a formação do tecido, que podem ser bem caracterizados pelo uso de métodos para avaliar a expressão do gene 41. Assim, o transplante de microesferas pode ser um método viável para explorar outros tecidos, tais como a mesoderme intermediária (IM), que dá origem ao rim. Especificamente, ele iria ajudar em estudos de desenvolvimento renais, para investigar como diferentes moléculas afetam nephron segmentação 42 e tubulogenesis 43,44, processos que estão apenas superficialmente compreendidas no presente. Além disso, o implante micropérola começou a ser utilizado para estuy processos de regeneração em peixes-zebra 29] e pode ser adaptado para utilização com qualquer número de modelos de regeneração de órgãos, tais como após a ablação a laser dos tecidos embrionários como o nefrónio 45 ou em conjunto com os métodos que têm sido formuladas para realizar pesquisas com as estruturas correspondentes adultos 46-49. Finalmente, o implante micropérola tem o potencial de ser utilizados em modelos de doenças humanas, tais como cancro ou tecido degeneração 50,51 52,53. No presente protocolo, que demonstram o método de implantação micropérola em embriões de peixe-zebra, o que também foi descrito de forma semelhante por outros investigadores, mas não mostrado, através de protocolos de vídeo 1. Com a prática mínima fomos capazes de implantar microbeads a uma taxa aproximada de 8-10 embriões / h, que se refere a viabilidade deste processo uma vez que o pesquisador tem alguma experiência. Os resultados aqui apresentados demonstram que os grânulos de vários dimensions pode ser implantado em fases iniciais, e que, com cuidado, esta técnica de manipulação de tecidos pode ser implementado com um mínimo de ruptura física do embrião. Uma melhoria que devem ser enfatizados é a utilização de uma ferramenta suiça / chicote para posicionar a micropérola no embrião. Esta peça relativamente simples e barata do equipamento é aproximadamente o mesmo diâmetro que a micropérola, é fácil de obter e ajuda a acelerar o processo de implantação. A suiça / chicote pode ser cortado para um comprimento desejado para produzir um firme ainda ferramenta de manipulação de cordão delicado, dependendo destreza pesquisador e preferência. Finalmente, enquanto nós aqui descrita como manipular fisicamente microbeads e embriões de peixe-zebra para realizar o implante, este protocolo não descrevem os procedimentos de manipulação específicas para diferentes drogas ou peptídeos. Em geral, microesferas tratados quimicamente deve ser implantado no animal com a conveniência, para evitar efeitos indesejados em outras áreas do organismo, e os investigadores devem ser bastanteformada sobre os possíveis problemas de segurança associados a tais produtos químicos antes de iniciar seus estudos. Em suma, nós demonstramos um método de implantação micropérola relativamente simples e eficaz com uma ampla gama de aplicações, usando materiais que estão prontamente disponíveis no laboratório. Finalmente, nós esperamos que este manual vai ajudar pesquisadores com a natureza delicada da manipulação dos tecidos do peixe-zebra.

Pesquisadores Developmental Biology utilizar uma vasta gama de métodos celulares, moleculares e genéticas para descobrir os mecanismos que controlam como um organismo é formado. Entre essas abordagens, manipulação de tecidos é uma ferramenta chave para decifrar questões complexas sobre o destino da célula, movimento celular, ea organização dos tecidos. Uma maneira de alterar a ambientes de tecidos locais é através da aplicação cirúrgica de microesferas que são usados ​​para fornecer uma fonte de foco de proteínas ou outras moléculas de sinalização 1. Esse tipo de manipulação experimental tem sido amplamente implementado em modelos embriologia vertebrados clássicos, como a rã e pintainho 2. O peixe-zebra tornou-se um importante organismo modelo vertebrado para o estudo da organogênese e também fornece muitas vantagens únicas para a modelagem de doença 3-5 como eles compartilham alta conservação genética com os seres humanos 6. Em particular, a transparência óptica e external desenvolvimento do embrião de peixe-zebra oferece um ponto de vista inigualável para a observação da ontogenia do tecido 3-5. A aplicação de telas genéticos para a frente em grande escala tem gerado um repositório poderoso de estirpes mutantes de peixe-zebra para o estudo mais aprofundado 7,8, e a identificação de técnicas de rastreio alternativos que podem ser eficazmente conduzido à escala reduzida em laboratórios 9,10 individuais. Mais trabalho experimental com peixe-zebra foi facilitada através de avanços nas metodologias de transgênicos e reverter abordagens genéticas 11,12, bem como a genética químicos 13-15. Técnicas de manipulação de tecidos, tais como a aplicação de micro-esferas, não têm sido tão amplamente empregue no peixe-zebra, mas não obstante constituem uma ferramenta útil para entender melhor a sinalização celular durante o desenvolvimento. Microbead implantação tem sido utilizado para interrogar os processos de formação de órgãos na retina de peixe-zebra16,17, coração 18, 19-22 cérebro, crista neural 23, e fin 24,25. Nestes e em outros estudos, os grânulos foram aplicados durante o desenvolvimento para compreender a difusão de moléculas de sinalização 26, como gradientes afectar a migração de células 27 e 28 axial patterning. Mais recentemente, foram utilizadas microesferas para avaliar os mecanismos de regeneração em adultos zebrafish 29. Em estudos de desenvolvimento, por exemplo, o trabalho microbead peixe-zebra forneceu insights sobre os mecanismos de formação dos membros por meio de estudos da nadadeira peitoral 25. O broto barbatana peitoral peixe-zebra é homóloga à bud membro anterior no rato 30 e 31 de pintinho. O botão do membro vertebrado tem dois nós de sinalização essenciais: a zona de actividade polarizadora (ZPA), que estabelece o eixo anterior-posterior, para, através da expressão de hedgehog Sonic (Shh) e alvos de genes Hox a jusante,e a crista ectodérmica apical (AER) presente na ponta do botão do membro, que actua para estabelecer a identidade proximal distal do membro através da expressão de factores de crescimento de fibroblastos (FGFs). por implante de micropérolas Fgf embebidos em mutantes de peixe-zebra Shh genéticos, investigadores identificado Fgf como essencial para a progressão do ciclo celular e o crescimento do membro 25 de vertebrado. Em adição ao Fgf e Shh cascatas de sinalização que estabelecem identidade posicional, estudos pioneiros utilizando o botão pintainho membro identificado de ácido retinóico (RA) como uma molécula que pode mimetizar a acção da região de polarização para estabelecer a identidade anterior para posterior 32. Esses experimentos envolvidos colocando pequenas tiras de papel Whatman RA-embebido no membro pintainho para avaliar dígito padronização 32. Além disso, os investigadores realizaram outros estudos elegantes que empregam o uso de microesferas, o transplante de células, e exógenoTratamentos da AR em peixe-zebra para determinar que a AR age para fornecer longo alcance pistas posicionais dentro da hindbrain peixe-zebra e mesoderme 28. No entanto, actualmente muitas questões permanecem sobre os papéis de fatores como Fgf e RA sinalização durante vários aspectos do desenvolvimento dos vertebrados. Os efeitos de sinalização de AR, na qualidade de um morfogénio, impactar muitos órgãos 33, tais como o coração em desenvolvimento 34 e os progenitores renais, onde RA especifica células renais proximais tipo destinos 35-39. Ainda mais a compreensão de temas poderiam beneficiar significativamente a partir de estudos experimentais utilizando técnicas de manipulação de tecidos e implantação microbead. Embora poucos estudos têm sido realizados com o implante de microesferas no peixe-zebra, quando comparado com modelos como o pintainho, aqueles que foram realizadas foram altamente informativa. Uma das razões para a escassez de implantação microbead baseada em investigação no embrião de peixe-zebra é likely a noção de que existem desafios técnicos difíceis, com base no tamanho do embrião, o que constitui um impedimento para a execução de tais manipulações com sucesso. No entanto, a implantação de embriões de peixe-zebra microbead pode ser aprendido com a prática e assistida através da observação visual da técnica, e, portanto, pode ser perseguido como um meio para interrogar os mecanismos de desenvolvimento. Aqui, demonstramos a aplicação precisa de uma micropérola no embrião do peixe-zebra, o qual pode ser utilizado para a realização de uma ampla variedade de ensaios de formação de tecido e morfogénese celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FB-500-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2707402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly Sulfoxide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45-106 &#181;m)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140-1454 AG1-X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45 &#181;m)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>7314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube holder</td>
			<td>Globe Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>51674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

O peixe-zebra tem emergido como um sistema modelo genético valiosa para o estudo da biologia do desenvolvimento e da doença. Zebrafish compartilhar um elevado grau de conservação do genoma, bem como semelhanças em processos celulares, moleculares, fisiológicos e, com outros vertebrados, incluindo os seres humanos. Durante a ontogenia precoce, embriões de peixe-zebra são opticamente transparentes, permitindo aos pesquisadores visualizar a dinâmica da organogênese usando um microscópio estereoscópico simples. Microbead implante é um método que permite a manipulação do tecido através da alteração de factores no ambiente local. Isto permite que os investigadores para testar os efeitos de qualquer número de moléculas sinalizadoras de interesse, tais como péptidos segregados, em pontos espaciais e temporais específicos dentro do embrião em desenvolvimento. Aqui, nós detalhe um protocolo para a manipular e grânulos de implantes durante o desenvolvimento do peixe-zebra cedo.

Vários tipos de ferramentas de manipulação são úteis para o tratamento de microesferas durante aplicações de pesquisa (Figura 1). Além disso, um molde de agarose simples com pequenos poços podem ser utilizados para manter o embrião do peixe-zebra, o que é vital para realizar estas experiências de uma maneira rápida e eficiente (Figura 1). A implantação de uma micropérola pode ser realizada na posição espacial e temporal da fase de interesse, o que permite limitar os investigadores a uma janela de acção específico para a molécula de interesse. Aqui, microesferas individuais foram implantadas em embriões de peixe zebra na fase de botão de cauda ou em pontos de tempo posteriores durante fases somitogénese (Figura 3). Dois microesferas de diferentes tamanhos, lavadas com solução de Ringer sozinho, foram utilizados neste protocolo de demonstração (figura 3A, 3B e 3C). Este implante micropérola na ausência de qualquer conjugadomoléculas pequenas demonstra que o implante de grânulo pode ser conseguida sem efeitos morfológicos brutas durante o desenvolvimento correcto do embrião do peixe-zebra (Figura 4). O experimentalista podem encontrar dificuldades à manobra da microbead no buraco punção feita por uma agulha de tungstênio sobre o embrião. Para conseguir um melhor manuseamento do micropérola uma vez colocado no embrião com a micro-agulha, um / chicote suiça ferramenta pode ser usada. Isto pode ser trabalhada com naturalmente derramado felino ou canino bigodes, embora outros filamentos lash natural ou sintético pode ser utilizado (Figura 1). Um empurrãozinho da microbead quer com a agulha de tungstênio ou a ferramenta suiça deve ver o microbead afundar em solução de Ringer do molde. Uma vez que a micropérola se afundou no molde deve ser movido grandes distâncias, se necessário, utilizando a agulha de tungsténio e uma vez sobre o embrião a ferramenta ou de filamentos emaranhados de agulha pode ser usado para position O microbead no embrião. O sucesso da implantação microesferas pode ser imediatamente avaliada através da visualização em um estereomicroscópio, tal como o rebordo irá permanecer estavelmente posicionado no tecido. Para avaliar a posição do grânulo ao longo do tempo, cada amostra embrião pode ser trabalhada por meio da fotografia curso de tempo vivo ou verificado a intervalos regulares (como representado na Figura 4) para assegurar que a localização do grânulo não se deslocou ao longo da duração da experiência, devido ao tecido endógeno morfogênese. Compreendendo a posição do cordão ao longo do tempo é crítica para a interpretação mais informado dos resultados, tais como a avaliação do efeito de uma molécula pequena sobre um tecido-alvo ou processo de desenvolvimento. A utilização destes passos acima irá proporcionar um ambiente ideal para encaixar microesferas no embrião do peixe-zebra de cada vez e posição desejada. Em nossa experiência, os usuários novatos deste protocolo implantação microbead tipicamente ganhou a habilidade necessário para executar a implantação cirúrgica consistente de microesferas no embrião de peixe-zebra após cerca de uma semana de prática. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Figura 1. As ferramentas usadas para realizar o implante micropérola. (A) A bandeja de implantação talão (esquerda, 15 cm de diâmetro) com moldes de embrião (à esquerda) e uma bandeja de incubação micropérola (no lado direito, a 6 cm de diâmetro). Este tabuleiro de trabalho permite ao investigador para colocar os embriões na orientação desejada para a implantação microesferas, e ter as microesferas preparadas para implantação em estreita proximidade na estação de microscópio. Microesferas devem ser incubadas em pequena molécula (s) e / ou o veículo e depois foi enxaguada numa placa separada micropérola (direita) antes da sua colocação na bandeja implantação do grânulo que está posicionado por baixo da estação de microscópio. (B) Dois pares de uma pinça fina vai ser utilizado para remover o choriem torno de cada embrião do peixe-zebra e também para quebrar a extremidade da agulha microcapilar. (C) Uma agulha de tungsténio serão empregues para fazer um furo muito fina no embrião do peixe-zebra, em que posicionar o microesferas. (D) A transferência pipeta microcapilar será usado para pegar e posicionar uma microbead em cima do embrião de peixe-zebra perto do local da punção. (E) A suiça / ferramenta de cílios vai permitir o posicionamento suave do microbead no local da incisão dentro do embrião que foi anteriormente feita pela agulha de tungstênio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema do procedimento de implante micropérola. (A) Um tabuleiro de implantação micropérola com micropérolas Soaking na solução de lavagem desejado está configurado sob uma estação de microscópio estereoscópico, e os embriões posicionado com o tecido voltado para cima. (B) Utilizando uma agulha de tungsténio, de uma pequena incisão no embrião pode ser feita com um ligeiro movimento ainda forte. (C) Com uma pipeta microcapilar transferência, a micropérola desejado pode ser retirado da câmara de microesferas de incubação na bandeja, localizada no lado direito, e trazido para a esquerda do compartimento onde a área de trabalho do embrião está situado. A micropérola deve ser depositado perto do local da incisão, e depois delicadamente posicionado no local de incisão feita pela agulha de tungsténio usando a ferramenta / chicote suiça. Uma vez que uma micropérola é manobrado para o local da incisão, ela deve ser dobrado para o tecido (distância a partir da incisão) para posicionar de forma estável e a micropérola impedir o movimento subsequente para fora do embrião, o desenvolvimento continua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>locação clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Figura 3. microesferas pode ser implantado em embriões em diferentes estádios de desenvolvimento. (A) Zebrafish embriões foram implantados com um microesferas (diâmetro de aproximadamente 50 mm) para o tronco na fase cauda broto. Quando examinados no 24 horas após o implante do talão (hpbi), os embriões tinham desenvolvido normalmente e a micropérola mostrou movimento mínimo durante a passagem do tempo de desenvolvimento. (B) Zebrafish embriões implantados com microesferas (com um diâmetro de aproximadamente 50 mm) para o saco vitelino no estádio 3 somito (ss) exibido desenvolvimento normal com o movimento do grânulo relativamente menor ao longo do tempo. (C) microesferas maiores (diâmetro de aproximadamente 70 mm) foram implantados no embrião 7 ss semelhante mostrou subsequente desenvolvimento normais, assim como mini-mal se qualquer movimento a partir do local de implantação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Figura 4. desenvolvimento bruta do embrião do peixe-zebra é perturbado pela presença de uma micropérola através de 72 hpbi. Zebrafish embriões foram implantados com microesferas embebidas em solução de Ringer (com um diâmetro de cerca de 50 um) na fase 7 somito (ss). Cada microbead foi cirurgicamente inserida no tronco, entre somites 3 ​​e 4. A presença do talão não foi associada com defeitos evidentes de desenvolvimento em 24 horas após talão implante (hpbi), 48 hpbi, ou 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K visualizações.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Eficácia do ar despojamento em dois peixes salmonídeos, truta arco-íris (Oncorhynchus Mykiss) e truta (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...